应用Sry-PCR扩增鉴定狍(Capreolus capreolus)的性别

根据人的SRY基因核心序列设计合成1对引物C1、C2，应用PCR技术对野生狍(Capreolus capreolus)Sry基因(哺乳动物Y染色体DNA雄性特异区)进行扩增．结果在野生狍雄性样本扩增出1条带(221bp)．而在雌性样本未见扩增带．显示了Sry基因的性别特异性。应用这1对引物对42个未知性别狍肌肉组织样本进行了性别鉴定．结果雄性22个，雌性20个。对Sry-PCR产物克隆测序，得到185bp的Sry基因部分核苷酸序列。本试验为狍种群性别比率及其种群动态变化机制研究提供了资料。     

狍Sry基因PCR扩增的初步研究

为研究狍性别决定机制,采用聚合酶链式反应(PCR)技术对野生狍(Capreoluscapreolus)(n♀=2,n♂=2)Sry基因(哺乳动物Y染色体DNA雄性特异区)进行扩增。根据人的SRY基因核心序列设计合成了1对引物1,2。结果在野生狍雄性个体中扩增出1条带,大小约为220bp,而在雌性个体中未见扩增带,表明了Sry基因的性别特异性,为探讨野生狍的性别决定机制提供了分子资料。     

蓝狐牙釉质基因克隆及性别鉴定的应用

牙釉质(Amelogenin,AMEL)基因在哺乳动物X、Y染色体上存在不同程度碱基缺失,已在动物性别鉴定方面得到一定程度的应用。本试验对蓝狐牙釉质基因片段进行克隆、纯化和测序,并通过测得序列设计1对引物,对50个蓝狐DNA样本(其中25个来自雄性蓝狐精液,25个来自雌性蓝狐静脉血液)进行PCR扩增和电泳分析,鉴定蓝狐性别。结果显示,雌性蓝狐产生1条X带,雄性蓝狐产生1条X带和1条Y带,50个蓝狐DNA样本鉴定结果符合实际性别。判断所设计牙釉质基因引物可以用于蓝狐性别鉴定。     

利用多重PCR技术快速鉴定牛性别的研究

为了建立一套简单、快速鉴定性别的方法,试验根据牛的Beta基因及SRY基因,设计2对引物(β-1,2和SRY-1,2),对牛96个牛肉DNA样本进行PCR性别鉴定。结果表明:雄性样品扩增出了300 bp和429 bp 2条片段,而雌性样品只能扩增出300 bp 1条片段。40个牛血液DNA样本鉴定结果与实际性别对比,雄性、雌性准确率均为100%。     

牙釉质基因鉴定麇鹿性别

性别鉴定是调查野生种群雌雄性比的重要方法,对野生动物种群管理具有重要意义。而牙釉质(AMEL)基因在性染色体上具有较高的保守性,在鉴定动物性别方面得到了应用,本次试验采用北京麋鹿生态实验中心的15头糜鹿组织样本,其中11个来自雄性麇鹿鹿茸,4个来自雌性糜鹿静脉血液。对所取样本分别进行基因组DNA提取、AMEL基因片段PCR扩增、纯化、测序。得到了AMEL基因鉴定和实际雌雄性别个数差异不显著(P>0.05)。结果表明:雌性麋鹿产生1条322 bpX带和1条N带,雄性麋鹿则产生322 bpX带和277 bpY带以及1条N带,雄鹿(10/10)和雌鹿(4/4)性别鉴定结果分别都与实际性别符合,所以,使用鹿茸角和血液样本进行AMEL.基因扩增电泳分析可以对糜鹿性别鉴定。     

牙釉质基因巢式扩增鉴定牛早期胚胎性别的研究

根据牙釉质基因在牛X染色体和Y染色体上存在的差异设计巢式引物,对牛静脉血基因组DNA样本以及10枚牛早期胚胎DNA样本进行巢式扩增和电泳分析,以鉴定性别。结果表明:利用此方法能够对牛10 pg量血液基因组DNA进行扩增鉴定性别,雌性产生1条片段长度为311 bp的源于X染色体的条带,雄性产生1条源于X染色体的条带(311 bp)和1条片段长度为251 bp的源于Y染色体的条带,对10枚胚胎进行鉴定,6枚为雄性,4枚为雌性。说明牙釉质基因巢式PCR扩增鉴定牛早期胚胎性别方法可靠,准确性和敏感性较高。     

牙釉质基因鉴定山羊性别的研究

根据牙釉质(amelogenin,AMEL)同源基因在山羊X、Y染色体上存在不同程度碱基缺失的特点,设计1对引物,对山羊血液基因组DNA混合样进行PCR扩增,将PCR产物纯化、克隆并测序;然后对46个山羊血液DNA样本(♀:22个,♂:24个)进行性别鉴定。结果显示,雌性山羊样品经扩增只产生一条非特异性条带,雄性山羊样品产生一条非特异性条带和一条特异性条带;非特异性片段长度为349 bp,特异性片段为289 bp;46个山羊血液DNA样本鉴定结果与实际性别对比,雌性准确率为100%(22/22),雄性准确率为100%(24/24)。     

鹈鹕性别鉴定的分子标记方法

鹈鹕是一种雌雄同态鸟类,外观上难以区分。从鹈鹕血液中提取基因组DNA,参照近缘鸟类性染色体上的CHD基因和EE0.6序列,筛选了3对引物进行特异性扩增,其中2对引物组合成1个组(A/B)进行双重PCR扩增。结果表明,2组引物在雄性个体中均扩增出1条片段,在雌性中扩增出2条片段;待测群体中雄性个体2只,雌性个体8只。本试验首次确立了利用PCR技术对鹈鹕性别进行鉴定的分子标记方法。     

聚合酶链式反应在小鼠雄性胚胎性别鉴定中的优化研究

为了提高聚合酶链式反应(PCR)在小鼠雄性胚胎性别鉴定中的应用效果,试验利用单一扩增雄性特有Sry基因法选取60枚雄性胚胎,将其中40枚平均分为2组,试验组1利用双重基因扩增法进行复检,试验组2利用两步双重基因扩增法进行复检,比较这2种方法对雄性胚胎的鉴定效果;利用两步双重基因扩增法分别以1,2,3个卵裂球模板量对其余20枚雄性胚胎进行体外扩增,确定卵裂球的适宜使用量。结果表明:利用两步双重基因扩增法进行雄性胚胎判定的准确率为100%,显著高于双重基因扩增法的准确率(85.00%)(P0.05)。以3个卵裂球作为模板时的准确率为100%,可以成功复检所有雄性胚胎。因此,利用两步双重基因扩增法可以有效对小鼠雄性胚胎进行性别鉴定。     

火烈鸟性别鉴定的分子标记方法

由于火烈鸟在外观上雌雄极为相似,很难用常规方法对其性别进行鉴定。本试验首次确立了利用PCR技术对火烈鸟性别进行鉴定的分子标记方法。从火烈鸟血液中提取总基因组DNA,针对性染色体上的CHD基因和EE0.6序列,筛选了4对引物进行特异性扩增,其中3对引物组合成2个组(A/B和B/C)进行多重PCR。结果表明,3组引物都在雄性个体中扩增出1条片段,在雌性中扩增出2条片段;待测群体中雄性个体11只,雌性个体6只。经检验,利用3组引物都能准确鉴定火烈鸟性别,为该物种在分子水平上的性别鉴定奠定了基础。     

Down-regulation of endogenous Wt1 expression by Sry transgene in the murine embryonic mesonephros-derived M15 cell line

Wt1 is one of numerous candidate genes comprising the hypothetical chain of gene expression essential for male sex differentiation of the bipotential indifferent gonads during embryogenesis. However, the evidence in the literature is ambivalent regarding the position of Wt1 relative to Sry in this scheme; Wt1 might act either upstream or downstream of Sry. In the present study, the effects of Sry expression upon Wt1 were investigated using M15 cells (XX karyotype), which are derived from murine embryonic mesonephros and express endogenous Wt1. In 3 stably-transformed Sry-expressing M15 cell lines, we showed that the expression levels of the mRNAs coding for all 4 isoforms of the WT1 proteins were down-regulated. Similarly, Wnt 4 expression was down-regulated in these cell lines. Silencing of Sry in the transformed cell lines using ribozymes or short hairpin RNAs (shRNAs) resulted in elevated levels of Wt1 and Wnt4 expression. These results strongly indicate that Wt1 might be under the control of Sry during gonadal differentiation in the mouse. In electrophoretic mobility shift assays (EMSA), we demonstrated that the 3.7 kb 5'-upstream DNA stretch of Wt1 containing potential Sry binding sites was capable of forming molecular complexes with nuclear protein(s) from Sry expressing cells but not with those from control non-Sry expressing cells. In summary, our present results support the notion that Wt1 is located downstream of Sry and down-regulated by the sex determining gene. Although the precise biological meaning of the present findings have yet to be clarified, it is possible that Wt1 plays a dual role during gonadal differentiation, i. e., turning on Sry expression on one hand, and being down-regulated by its product, Sry, on the other, possibly forming a type of negative feed-back mechanism. Further work is needed to substantiate this view.     

奶牛性别鉴定的研究与应用

选取牛雄性性别决定基因SRY (sex region of Y chromosome),根据基因序列设计特异引物,应用PCR技术对5头荷斯坦奶牛DNA样品进行扩增,鉴定其性别;并对设计的引物灵敏度进行检测;对已有的公、母各20头荷斯坦奶牛DNA样品进行PCR盲检,获取奶牛高灵敏度特异性引物,用于奶牛性别鉴定。结果表明,4头公牛DNA样品可以扩增出目标条带(66 bp),1头母牛DNA样品无法扩增出条带,阴性对照扩增无条带;最佳引物灵敏度为1.6 pg/μL,可以很好地满足性别鉴定需要。40头个体中,20头个体DNA样品可以扩增出条带,其余20头个体DNA样品无法扩增出条带,检测结果与实际性别对比准确率为100%。试验结果表明,设计的引物灵敏度比较好,能够满足奶牛性别鉴定的需要。     

嗜水气单胞菌弹性蛋白酶基因的克隆表达

为了研究嗜水气单胞菌重组弹性蛋白酶的酶学性质,试验根据GenBank中的嗜水气单胞菌弹性蛋白酶基因ahyB设计1对含酶切位点的特异引物,以嗜水气单胞菌J-1(AhJ-1)株为模板,经PCR扩增得到不含信号肽的成熟弹性蛋白酶基因片段(787 bp),并与pMD18-T载体连接、测序,再用DNAStar软件分析。结果表明:该基因片段与豚鼠气单胞菌胞外蛋白酶同源性高达95%,与嗜水气单胞菌AG2株弹性蛋白酶ahyB基因同源性为92%,与铜绿假单胞菌LasB基因同源性为82%;将PCR产物连入表达载体pET-32a,转化至大肠杆菌BL21菌株中进行诱导表达,出现50 ku的融合表达蛋白,该表达产物纯化复性后表现出酶的活性。     

PCR扩增TK基因检测鸡传染性喉气管炎病毒的研究

根据已发表序列设计一对包含鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）TK基因全长核苷酸的1259bp引物，对2株ILTV强毒和1株ILTV疫苗毒进行PCR扩增，均能扩增出预期大小的目的片段，酶切分析证实了目的片段的特异性，而其它禽病原体的扩增均为阴性。PCR检测ILTV DNA的最小检测量为75pg。此方法检测人工接种鸡的气管棉拭样品，均能检测到ILTV，因此可用于临诊样品鸡传染性喉气管炎病的检测和诊断。     

PCR法鉴定雏鸽性别的初步研究

雏鸽的雌雄外貌形态差别甚微,极难区别。为有效准确地鉴别雏鸽的性别,淘汰非目的性别,从而降低饲养成本,提高经济效益。本研究通过采用PCR方法,选定特殊的性别CHD1基因及鉴定引物,克隆出雏鸽特定性别基因序列鉴定雏鸽的雌雄。结果表明:在雏鸽雌性样本中扩增出1条带(777 bp),而雄性中未见扩增带,显示出CHD1基因的性别特异性,PCR扩增性别鉴定结果与样本解剖后对性腺观察的形态学鉴定结果也完全一致。在87份样品中,阳性克隆结果为25,阴性克隆结果为62,故87只雏鸽中雌鸽25只,雄鸽62只,其准确率达100%。     

Non-CpG methylation occurs in the regulatory region of the Sry gene

The Sry (sex determining region on Y chromosome) gene is a master gene for sex determination. We previously reported that the Sry gene has tissue-dependent and differentially methylated regions (T-DMRs) by analyzing the DNA methylation states at CpG sites in the promoter regions. In this study, we found unique non-CpG methylation at the internal cytosine in the 5'-CCTGG-3' pentanucleotide sequence in the Sry T-DMR. This non-CpG methylation was detected in four mouse strains (ICR, BALB/c, DBA2 and C3H), but not in two strains (C57BL/6 and 129S1), suggesting that the CCTGG methylation is tentative and unstable. Interestingly, this CCTGG methylation was associated with demethylation of the CpG sites in the Sry T-DMR in the developmental process. A methylation-mediated promoter assay showed that the CCTGG methylation promotes gene expression. Our finding shows that non-CpG methylation has unique characteristic and is still conserved in mammals.     

应用PCR检测鸡传染性喉气管炎病毒

根据传染性喉气管炎病毒(ILTV)TK基因序列，设计、合成1对引物，应用PCR技术对ILTV以色列疫苗株、河南分离株（ILTV-CG和ILTV-XY）进行PCR扩增，均能扩增出预期大小的目的片段，测序分析和酶切分析证实了PCR产物的特异性，而对其它禽病原体的扩增均为阴性。PCR检测ILTV DNA的最小检测量为21 pg。应用PCR检测人工接种后不同〖JP2〗天数采集的鸡的结膜拭子，接种后第2~5 d均能检测到ILTV。该方法可用于鸡传染性喉气管炎病的诊断和临诊样品检测。     

利用iCODEHOP设计简并引物克隆益生菌FGM通透酶基因片段

作者通过iCODEHOP在线设计细菌通透酶的简并引物,以发酵黄芪菌FGM基因组DNA为模板进行TouchdownPCR扩增,得到740 bp PCR产物,将产物经pGEM-T Easy载体连接,转化至JM109中,筛选阳性株并测序。序列通过BLAST x检索与GenBank进行同源性比对后,结果表明,此DNA产物序列与其他菌属来源的通透酶蛋白序列具有相似性,所克隆的序列即为FGM通透酶基因片段。用iCODEHOP在线设计的简并引物可信性强,阳性率高。FGM通透酶基因的成功克隆为细菌发酵黄芪机理研究提供了依据。