猪肺炎支原体PCR快速检测方法的建立和应用

根据猪肺炎支原体P36基因序列,设计1对引物,建立了猪肺炎支原体PCR诊断方法,该方法对猪肺炎支原体的扩增结果为阳性,对照菌株扩增结果均为阴性,对猪肺炎支原体检测的灵敏性为1 pg总DNA量。并用建立的PCR诊断方法检测52份猪肺炎支原体疑似病料,检出阳性病例18份,以上结果表明该PCR方法特异性强敏感性高、简便、快速,可用于猪肺炎支原体疾病的诊断。     

应用巢式POR方法检测牛支原体肺炎

根据Genbank发表的牛支原体全基因序列,设计2对特异性引物,建立了诊断牛支原体肺炎的巢式PCR方法,第一轮引物P1、P2扩增片段长度为1912bp,第二轮引物P3、P4扩增片段长度为422bp：该方法特异性试验未扩增出丝状支原体丝状亚种小克隆和无乳支原体特异性条带;敏感性试验证明扩增DNA最低含量达到10—7Hg／mL,是单一PCR的10^3倍;用该方法对阳性病料进行检测,均扩增出特异性片段。该体系的成功构建,可以为牛支原体肺炎的活体检测,和流行病学调查提供技术支持。     

应用巢式PCR方法检测牛支原体肺炎

根据Genbank发表的牛支原体全基因序列,设计2对特异性引物,建立了诊断牛支原体肺炎的巢式PCR方法,第一轮引物P1、P2扩增片段长度为1912bp,第二轮引物P3、P4扩增片段长度为422bp:该方法特异性试验未扩增出丝状支原体丝状亚种小克隆和无乳支原体特异性条带;敏感性试验证明扩增DNA最低含量达到10-7μg/mL,是单一PCR的103倍;用该方法对阳性病料进行检测,均扩增出特异性片段。该体系的成功构建,可以为牛支原体肺炎的活体检测,和流行病学调查提供技术支持。     

新疆地区规模化奶牛场牛支原体流行病学调查

为了调查新疆地区规模化奶牛场牛支原体的感染情况,采用牛支原体间接ELISA和特异性PCR检测牛血清中的牛支原体抗体及病料中牛支原体核酸,共检测9个地区15个规模化奶牛场437份血清,肺脏、关节液及鼻腔黏液44份。结果显示,血清抗体阳性率为76.43%（334/437）,其中脐带血抗体阳性率为40.00%（4/10）;病料阳性率为40.91%（18/44）。检测结果表明,新疆地区大部分奶牛场存在牛支原体感染,部分奶牛场发生牛支原体肺炎及关节炎病例,并存在垂直传播的风险。牛支原体感染可能成为危害新疆规模化奶牛场犊牛健康的主要疫病之一。     

致犊牛肺炎牛支原体南疆株的分离鉴定及oppF基因序列分析

本研究旨在调查新疆喀什某规模化奶牛场的犊牛死亡原因,并确定病原体.无菌采集3份因肺炎死亡的犊牛肺脏病料样品.采用牛支原体专用液体培养基和1.0%牛支原体琼脂固体筛选培养基从3份病死犊牛肺脏病料中分离得到2株牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis),分别命名为M.bovis-NJ-1和M.bovis-NJ-2.通过菌落形态学观察、特异性PCR和oppF测序比对对分离株进行鉴定.结果显示,2个分离株在固体培养基上的菌落呈现典型的"煎蛋状",且Dienes染色特点符合牛支原体菌落着色特征,中心呈深蓝色;PCR能扩增出牛支原体特异的448 bp目的片段;2个分离株的oppF基因序列与牛支原体国际标准株PG45的同源性分别为96.7%和95.3%.结果表明,引起犊牛发病死亡的病原是牛支原体,本研究为犊牛支原体肺炎的快速诊断和防制提供依据.     

我国奶牛牛支原体流行情况调查

由牛支原体引起的奶牛支原体肺炎和乳房炎所导致的经济损失非常巨大,而目前我国尚无较详细的奶牛牛支原体病流行病学资料。2008~2016年,本课题组采用牛支原体间接ELISA、直接培养法和特异性PCR检测法对国内12个地区30个规模化奶牛场进行了牛支原体感染情况调查及分析,共对843份血清和60份肺脏、关节液及鼻腔黏液、1 090份乳样中的牛支原体抗体和牛支原体及其核酸进行了检测。结果显示,血清抗体阳性率为52.31%(441/843);病料阳性率为55%(33/60);乳样阳性率为34.22%(373/1090);从样本中共分离保存了55株支原体菌种。检测结果表明,国内大部分奶牛场存在牛支原体感染,部分奶牛场发生牛支原体肺炎、乳房炎及关节炎临床病例,并存在垂直传播的风险。牛支原体感染可能成为危害国内规模化奶牛场奶牛健康的主要疫病之一。     

基于牛支原体P81基因环介导等温扩增方法的建立及应用

为快速检测牛支原体(M.bovis),根据GenBank中登录的M.bovis P81基因序列设计特异性引物,通过条件优化,建立了M.bovis环介导等温扩增(LAMP)检测方法。将该方法的灵敏度与巢式PCR进行对比,并用其检测牛支原体外的其他几种病原菌,同时对疑似感染M.bovis的临床病料进行检测。该方法的灵敏度比巢式PCR高103倍,最低检出限为1.1ng/L,对其他几种病原菌的检测结果均为阴性,临床病料检测结果与分离培养符合率为100%。建立的M.bovis LAMP检测方法灵敏度高、特异性强、检测快速准确,且不需要专门的仪器设备,可用于牛支原体病的临床检测。     

新疆不同地区牛支原体分离株oppD/F基因的克隆和序列分析

为研究新疆不同地区牛支原体分离株oppD/F基因的遗传特性,从哈密、塔城等新疆不同地区的规模化奶牛场采集了疑似牛支原体感染的病死奶牛肺脏组织、关节液及鼻拭子。对病料进行病原分离,PCR检测特异性基因oppD/F及序列分析。结果显示,固体培养基上得到典型的"煎蛋状"菌落,并扩增出448bp特异性目的条带。生物信息学分析显示,24株新疆不同地区分离株间核苷酸和氨基酸序列同源性均较高,与国际标准株PG45(CP002188.1)氨基酸序列同源性为97.3%~100.0%,具有高度同源性。研究结果为新疆地区牛支原体流行病学分子信息及免疫预防提供理论依据。     

一例奶牛发生牛支原体肺炎的诊断

牛支原体是严重影响养牛业发展的重要病原。2008年我们报道牛支原体导致＂肉牛传染性牛支原体肺炎＂以来,主要在肉牛发现该病。本文从临床出现类似症状的运输后发病奶牛采集样本,经细菌培养和支原体培养、特异性PCR扩增和16S rRNA测序等病原学检测证实为牛支原体感染。     

致犊牛肺炎和关节炎牛支原体新疆株的分离与鉴定

自2010年7月以来,新疆北疆部分地区某些奶牛场犊牛陆续出现严重的肺炎和关节炎,为确定其病原,无菌采集8个牛场病死犊牛的肺脏和关节液,患病犊牛的血清和部分鼻拭子,病料接种筛选培养基,通过菌落形态观察、特异性PCR鉴定、生长抑制试验和血清学检测,确定牛支原体15株,其中7株牛支原体克隆测序,与PG45 OPP F基因同源性为97.32%~100.00%。牛支原体ELISA试剂盒检测92份血清显示,阳性率82.61%。结果表明,该地区奶牛场发病犊牛以牛支原体感染为主。     

牛支原体引起奶牛乳房炎的诊断

牛支原体（Mycoplasma bovis）是引起成年牛乳房炎和犊牛肺炎、关节炎的主要病原之一。本文从有乳房炎临床症状的奶牛中采集牛奶样本,经细菌培养和支原体培养、特异性PCR与环介导等温扩增（LAMP扩增）和16S rRNA测序等病原学检测证实为牛支原体感染,同时还有其他细菌的混合感染。     

Leachii支原体PCR检测方法的建立与应用

为建立一种leachii支原体的检测方法,本研究根据leachii支原体LPPA外膜蛋白编码基因序列设计一对引物,建立了PCR检测方法。结果显示,该方法仅对leachii支原体扩增出539 bp的目的片段,而与牛支原体、丝状支原体山羊亚种、绵羊肺炎支原体、丝状支原体丝状亚种小菌落型、山羊支原体山羊肺炎亚种等其它支原体无交叉反应,具有良好的特异性;该方法对leachii支原体的最低检测浓度为105 ccu/m L,敏感性较高。采用该方法可以在乳汁和关节液等病料样品中检测到leachii支原体,与分离培养的结果相符。上述结果表明,本研究建立的leachii支原体PCR检测方法具有特异性强、敏感性高的特点,可实现准确、高效检测leachii支原体的目的。     

犊牛轮状病毒和大肠杆菌混合感染检测

黑龙江省某规模化奶牛场部分新生犊牛发生了严重腹泻且犊牛病死率较高。为了确诊,无菌采集病料,通过病毒检测、细菌分离、生化试验、细菌和病毒特异性基因PCR扩增、动物致病性试验及药敏试验等方法进行了病毒抗原和微生物检测。结果显示,病毒检测中牛轮状病毒（BRV）呈阳性,PCR扩增得到400 bp的特异性片段;从病料中分离到1株含K99和F41兼性菌毛抗原的高致病性产肠毒素大肠杆菌（ETEC）,该分离菌株对恩诺沙星、头孢唑啉、氯霉素敏感,对其他抗生素有一定的耐药性。流行情况调查结合病原学检查确诊该牛场新生犊牛严重腹泻是由BRV和大肠杆菌混合感染造成的,根据诊断结果进行了针对性地防制,取得了良好的防控效果。     

应用双重PCR方法检测羊支原体肺炎病原

通过对丝状支原体山羊亚种(M.mycoides subsp.capri,Mmc)特异性引物MmcF/MmcR和绵羊肺炎支原体(M.ovipneumontiae,Mo)特异性引物LmF/LmR退火温度、引物浓度比例等条件的选择,建立了一个可以同时检测Mmc和Mo的双重PCR方法。该方法可同时扩增出Mmc 195 bp和Mo 361 bp目的片段,但对其他病原菌不能扩增出任何条带,具有良好的特异性。敏感性试验表明,该方法能够分别检测出0.1ng的Mmc DNA和0.01 ng的Mo DNA,或同时检测出1ng Mmc和1ng Mo混合的DNA。用该双重PCR方法可对实验室保存的4株绵羊肺炎支原体和2株丝状支原体山羊亚种进行准确鉴定,并可从临床病料中检测出相应支原体,表明建立的双重PCR方法可用于Mmc和Mo的快速鉴定、实验室诊断和病原学调查。     

某奶牛场支原体分离鉴定及药敏试验

2019年6月,大庆市某奶牛场发生犊牛肺炎,表现为呼吸困难,短促咳嗽,病程2周左右,发病率约50%～80%,病死率约20%～30%。为确定该奶牛场犊牛因肺炎而致死的病因,本试验进行了临床诊断及实验室诊断,对病死牛肺脏进行细菌分离培养,经检测怀疑为支原体感染,又进一步利用PCR方法检测,检测结果确定为牛支原体感染,并对该牛场支原体进行药敏试验,药敏结果对卡那霉素、四环素、恩诺沙星、泰妙菌素、环丙沙星和土霉素高度敏感。可见牛支原体感染是该牛场发病的重要原因,筛选出的敏感药物可用于治疗发病牛,该结果为奶牛场犊牛肺炎的防控提供了参考依据。     

牛支原体快速PCR检测方法的建立及其应用

本试验旨在建立一种可直接从病料中快速检测牛支原体的PCR方法,并且应用于临床。根据牛支原体16S rRNA基因设计一对引物,配制PCR扩增体系,样品经简单处理后加入体系进行扩增,最终扩增出1 390bp片段,进一步的试验证明该方法具有良好的特异性和敏感性。临床样品检测结果显示,该方法的检出率与传统PCR的符合率为100%。试验表明,该方法能快速直接从临床样品中检测出牛支原体,可用于牛支原体的大量临床样品的检测。     

猪肺炎支原体PCR检测方法的建立与应用

根据猪肺炎支原体(Mhp)的P36基因的核苷酸序列,设计一对引物,建立一种猪肺炎支原体PCR检测方法,此方法对对照菌株显示为阴性,对猪肺炎支原体的扩增结果显示为阳性,并对此方法进行了特异性和敏感性试验,结果成功建立了猪肺炎支原体特异且敏感的PCR检测方法。采用已经建立的PCR方法对18份疑似猪支原体肺炎(MPS)样品进行检测,发现有9份呈现阳性,占比50%。试验结果表明,建立的该PCR检测方法可用于猪支原体的临床诊断,能为其以后的防控提供有力依据。     

绵羊肺炎支原体诊断方法的建立

从青海省海晏县发生胸膜肺炎的绵羊群中采集3份肺组织病料,进行病原的分离培养和特异性PCR检测。结果从3份肺组织中均分离到支原体,经鉴定为绵羊肺炎支原体,表明建立的PCR方法能对绵羊肺炎支原体做出正确诊断。     

一株猪肺炎支原体的分离鉴定

从全国部分猪场采集到疑似猪支原体肺炎肺组织病料12份,提取DNA进行猪肺炎支原体PCR和多重PCR检测,将病料研磨后分离猪肺炎支原体,最终分离到1株疑似猪肺炎支原体;通过测序分析、形态观察、生化试验、血清学试验证实其为猪肺炎支原体。该菌株能适应人工培养基的培养,且传代生长良好,液体培养基中培养活菌滴度达109CCU/m L;菌株有一定的致病性,免疫原性好,可作为疫苗备用菌株,该菌株的分离鉴定为研制猪支原体肺炎疫苗奠定了基础。     

牛多杀性巴氏杆菌和牛支原体双重PCR检测方法的建立及应用

参照Gen Bank中牛多杀性巴氏杆菌kmt1基因序列(AF016259)和牛支原体opp D/F基因序列(AF130119),设计两对引物,在建立两种细菌单项PCR检测方法的基础上,优化双重PCR反应条件,建立了两种细菌的双重PCR检测方法,用这两对引物对同一样品中的牛多杀性巴氏杆菌、牛支原体核酸为模板进行双重PCR扩增,结果可同时扩增牛多杀性巴氏杆菌和牛支原体的265bp和439bp的特异性片段,而对其他4种牛病原菌的扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,对牛多杀性巴氏杆菌和牛支原体的最低核酸检出限均为1pg。通过对30份临床病料检测,将建立的双重PCR技术和单项PCR方法进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。结果表明,建立的双重PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可用于对牛多杀性巴氏杆菌和牛支原体的同时检测和鉴别诊断。