匍匐剪股颖ZjSGR基因的遗传转化及生理生化分析

SGR(stay green regulation)基因是植物体内叶绿素代谢的关键调控基因,在调控植物衰老进程中发挥着重要的作用。本研究利用从日本结缕草(Zoysia japonica)中分离的ZjSGR基因,通过农杆菌介导的方法,完成对匍匐剪股颖(Agrostis stolonifera)的转基因操作。经过诱导、分化、生根、炼苗及土培过程,最终获得了19株再生匍匐剪股颖植株。PCR方法检测证实:其中15株再生匍匐剪股颖植物为转化阳性;RT-PCR分析表明:15株转基因匍匐剪股颖能够转录表达ZjSGR基因;利用荧光定量RT-PCR技术筛选ZjSGR基因高水平表达的转基因植株,结果显示:10号、13号、15号表达水平最高。选择这3株表达水平最高的转基因植株,进行生理生化分析,结果显示:转基因匍匐剪股颖叶绿素含量明显降低,净光合速率显著下降,可溶性糖及丙二醛含量与野生型植株相比有所提高。以上结果表明,ZjSGR基因在匍匐剪股颖中过量表达,能够通过促进叶绿素的降解加速植物的衰老。     

紫花苜蓿MsNAP基因克隆及烟草转化

NAP转录因子是植物体内特有的转录因子,在调控植物生长发育、衰老速度以及响应生物、非生物胁迫等方面有重要作用。采用RT-PCR方法克隆紫花苜蓿NAP转录因子基因,将其命名为MsNAP(GenBank登录号:KM211498.1),MsNAP编码区长822bp,编码274个氨基酸。生物信息学分析显示:其与其他物种NAP蛋白具有较高的同源性,与蒺藜苜蓿同源性最高。荧光定量技术分析结果显示:MsNAP基因在花中表达量最高,衰老叶片中的表达水平远远高于未衰老叶片。利用DNA重组技术将MsNAP基因完整编码区连接至植物表达载体pBI121,成功构建植物表达载体pBI-MsNAP,通过农杆菌介导方法转化烟草,PCR和RT-PCR检测结果显示,成功获得了转MsNAP基因的转基因烟草,初步证明在转基因烟草中外源基因MsNAP能够转录表达,为研究MsNAP基因功能奠定了基础。     

过表达青绿苔草滞绿基因CbSGR加速拟南芥叶绿素降解和衰老

根据全长转录组数据,克隆得到青绿苔草滞绿基因CbSGR(GenBank登录号:MN746439),其完整编码区全长为771bp,编码256个氨基酸。NCBI Nr数据库Blast结果显示,CbSGR属于STAY-GREEN超家族,系统进化分析表明CbSGR与油棕和海枣SGR的相似度最高。为研究CbSGR的转录激活特性,构建pGBKT7-CbSGR载体并转化Y2HGold酵母感受态细胞,其在三缺培养基(SD-Trp-His-Ade)上不能生长,表明CbSGR不具有转录激活活性。利用本生烟草瞬时表达方法观察亚细胞定位情况,结果表明CbSGR定位于叶绿体。利用花序侵染法转化拟南芥,过表达株系表现出黄化,叶绿素含量显著低于对照且净光合速率明显小于对照。荧光定量分析结果表明,过表达CbSGR转基因株系中光合效率相关的AtCAB1、AtPSAF、AtRCA基因表达量均显著低于对照,而衰老相关的AtNYC1、AtNOL、AtSEN、AtSAG12和AtSAG14基因表达量均显著高于对照,表明CbSGR的过表达降低了光合效率并加速了植物衰老。CbSGR是一个调节植物叶绿素降解和衰老的关键基因,为后续通过基因编辑等措施改良青绿苔草绿期奠定了基础。     

过表达桑树色氨酸脱羧酶基因(MnTDC)转基因烟草提高其耐盐性

褪黑素在植物生长、发育、生物与非生物胁迫中发挥重要作用.色氨酸脱羧酶(tryptophan decarboxylase,TDC)是褪黑素生物合成中第一个重要的酶.本研究克隆川桑TDC基因,并将其转入烟草中过表达,探讨MnTDC在盐胁迫下的作用机制.结果 表明,成功构建过表达载体pLGNL-MnTDC,并经过农杆菌介导的愈伤组织转化获得3个独立转基因系.GUS染色、基因组PCR鉴定证明MnTDC成功转化到烟草株系中.qRT-PCR结果表明MnTDC在3个转基因烟草株系中的转录水平显著高于野生型(WT).UPLC-MS/MS结果表明转基因株系显著提高了褪黑素的生物合成量.盐胁迫下,Mn TDC过表达烟草与野生株系烟草相比,耐盐性显著增强.转基因烟草株系中的过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)及过氧化物酶(POD)活性均显著高于野生株系烟草,脯氨酸(Pro)等调节渗透压物质的含量和ERD10C等调节渗透压的基因表达量显著高于野生株系烟草,转基因株系中丙二醛(MDA)含量比野生株系烟草低.研究结果表明,MnTDC通过调节烟草细胞中褪黑素的含量进而影响了烟草植株整体的耐盐性.本研究初步揭示了MnTDC基因的抗逆功能,为桑树耐盐分子育种提供了重要候选基因和理论参考.     

神农香菊CibHLH1的鉴定及对光合特性的影响

bHLH家族是植物中第二大转录因子家族，对植物的生长发育、次生代谢和环境胁迫应答都起着重要的作用。本研究以神农香菊叶片cDNA为模板克隆了CibHLH1的全长序列，该基因全长738 bp，开放阅读框为630 bp。多序列比对分析及系统进化树结果表明，CibHLH1与菊花的CmbHLH1同源性最高。不同组织部位的荧光定量数据显示该基因在花中表达量最高，在根中表达量最低，亚细胞定位结果显示该基因定位在细胞核中。为进一步研究CibHLH1的功能，通过叶盘法将其转化烟草，发现过表达CibHLH1烟草叶片黄化，测定叶绿素含量发现，叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量均显著降低。测定转基因烟草的光响应曲线及光合生理指标，结果表明过表达CibHLH1降低了烟草的最大净光合速率、表观量子效率、光饱和点和水分利用率，但其蒸腾速率、气孔导度和光补偿点均增加。综上所述，CibHLH1能够通过降低光合色素的含量而影响植物的光合能力。     

MsWRKY33转录调控MsACS2影响紫花苜蓿耐盐性的研究

乙烯作为重要的植物激素之一,在植物逆境胁迫应答中发挥重要作用。ACS基因是乙烯合成过程中的关键限速酶(ACC合成酶)基因,本研究通过探究紫花苜蓿MsWRKY33转录因子对ACS基因的调控关系,为MsWRKY33参与紫花苜蓿耐盐胁迫响应的具体调控机制奠定理论基础。利用同源克隆、载体构建、酵母单杂交、酵母双杂交、qRT-PCR等技术,验证MsWRKY33对AtACS2和MsACS2的转录调控,并对盐胁迫下转基因株系中MsACS2表达模式进行分析。结果显示：MsWRKY33转录因子可以与W-box元件特异性结合,且对AtACS2和MsACS2具有转录调控作用;MsWRKY33转基因株系中MsWRKY33基因的表达量显著高于对照,转基因株系中MsACS2的表达是在MsWRKY33基因大量表达后呈上升趋势,进一步说明紫花苜蓿MsACS2基因的表达可能受MsWRKY33转录因子的正向调控。因此,紫花苜蓿受到盐胁迫时可诱导MsWRKY33的表达,MsWRKY33转录因子通过正向调控MsACS2表达,可能影响乙烯合成,从而影响紫花苜蓿的盐胁迫响应。     

利用CRISPR/Cas9系统编辑日本结缕草ZjSGR基因技术研究

日本结缕草(Zoysia japonica)是一种常见的具有众多优良性状的暖季型草种,秋冬季节在我国北方地区会较早出现叶片脱绿现象,在一定程度上限制了日本结缕草在北方的大面积使用。ZjSGR是从结缕草中分离出来的一种衰老诱导基因,负调控叶片滞绿性状。本研究利用CRISPR/Cas9系统,通过基因枪介导的遗传转化方法实现对日本结缕草ZjSGR基因的编辑,经测序验证获得1株单碱基缺失突变植株。突变植株叶片深绿,在正常生长温度(28~30℃)条件下,和对照相比,叶绿素含量更高(P<0.05)。本研究为进一步阐述ZjSGR基因在日本结缕草滞绿性状调控中的作用机理提供了基础研究材料,也为培育日本结缕草滞绿品种育种工作奠定了基础。     

蒺藜苜蓿叶绿素酸酯a加氧酶(MtCAO)基因的克隆与功能分析

叶绿素含量直接影响植物光合效率,从而决定其生物量。叶绿素酸酯a加氧酶(CAO)催化叶绿素酸酯a转化成叶绿素酸酯b,是叶绿素合成的限速酶之一。本研究克隆了蒺藜苜蓿MtCAO,该基因编码531个氨基酸。进化分析表明,MtCAO与双子叶植物的CAO亲缘关系较近。高等植物CAO基因的结构保守,均含有9个外显子。MtCAO主要在绿色组织尤其是叶片中高丰度表达。瞬时表达拟南芥原生质体试验显示,MtCAO-GFP融合蛋白定位于叶绿体。表达模式分析表明,茉莉酸甲酯(MeJA,100 μmol·L^-1)及黑暗处理抑制MtCAO的表达,而24 h内NaCl (100 mmol·L^-1)及聚乙二醇(PEG,5%) 处理先诱导后抑制其表达,且该基因受昼夜节律调控。这与对MtCAO启动子区顺式作用元件的预测结果一致。类似于超表达AtCAO的拟南芥,超表达MtCAO的拟南芥株系叶色正常,叶绿素含量及鲜重与野生型差异不显著,推测是由于MtCAO高度保守的A结构域中的降解子导致的。     

蒺藜苜蓿叶绿素酸酯a加氧酶(MtCAO)基因的克隆与功能分析

叶绿素含量直接影响植物光合效率,从而决定其生物量。叶绿素酸酯a加氧酶(CAO)催化叶绿素酸酯a转化成叶绿素酸酯b,是叶绿素合成的限速酶之一。本研究克隆了蒺藜苜蓿MtCAO,该基因编码531个氨基酸。进化分析表明,MtCAO与双子叶植物的CAO亲缘关系较近。高等植物CAO基因的结构保守,均含有9个外显子。MtCAO主要在绿色组织尤其是叶片中高丰度表达。瞬时表达拟南芥原生质体试验显示,MtCAO-GFP融合蛋白定位于叶绿体。表达模式分析表明,茉莉酸甲酯(MeJA,100μmol·L~(-1))及黑暗处理抑制MtCAO的表达,而24 h内NaCl (100 mmol·L~(-1))及聚乙二醇(PEG,5%)处理先诱导后抑制其表达,且该基因受昼夜节律调控。这与对MtCAO启动子区顺式作用元件的预测结果一致。类似于超表达AtCAO的拟南芥,超表达MtCAO的拟南芥株系叶色正常,叶绿素含量及鲜重与野生型差异不显著,推测是由于MtCAO高度保守的A结构域中的降解子导致的。     

日本结缕草ZjADH基因对拟南芥的转化及其耐寒性分析

为研究日本结缕草ZjADH基因是否与植物耐寒有关,通过DNA重组技术将ZjADH基因插入3302Y质粒中,成功构建了植物表达载体3302Y-ZjADH,通过农杆菌介导的花序侵染法获得具有草铵膦抗性的转基因植株。PCR和qRT-PCR鉴定表明,目的基因已整合入拟南芥基因组中并能够成功表达。对野生型和转基因拟南芥进行低温(4 ℃)处理和耐寒分析,结果表明,转基因拟南芥对低温胁迫的抵抗能力明显高于未转基因植株。在低温胁迫下,转基因拟南芥中脯氨酸的含量显著高于野生型植株,而活性氧的积累明显低于野生型植株;对转基因植物抗性相关基因的表达分析显示:转基因植物体内SOD、APX及LEA基因的表达水平明显高于未转基因植株,说明ZjADH基因可能通过提高转基因植物体内SOD、APX及LEA的表达活性来增强植物的抗寒性。综上所述,日本结缕草ZjADH基因的表达能够提高转基因植株的耐寒性,对ZjADH基因的研究也为进一步获得抗寒转基因日本结缕草植株奠定理论依据。     

紫花苜蓿MsZAT10基因的克隆及其在烟草中的功能验证

C2H2型锌指蛋白ZAT10在植物应对外界非生物胁迫中具有重要的作用。克隆得到紫花苜蓿C2H2型锌指蛋白MsZAT10基因。该基因开放阅读框全长762 bp,编码253个氨基酸。ZAT10蛋白含有2个单C2H2型保守结构域,有典型的QALGGH保守基序,属于C2H2型锌指蛋白。氨基酸序列比对和进化树分析表明,紫花苜蓿MsZAT10与蒺藜苜蓿MtZAT10亲缘关系最近,其氨基酸的相似性为76%。构建植物表达载体pCBM-MsZAT10,通过农杆菌介导法转化到烟草,经过草丁膦(PPT)抗性筛选和聚合酶链式反应(PCR)鉴定,获得25株阳性植株。荧光定量PCR(qRT-PCR)检测表明,MsZAT10基因在转基因株系中得到表达。选取3个转基因株系进行抗逆性分析,在-4 ℃条件下处理2 h,转MsZAT10基因烟草叶片的萎蔫程度和相对电导率均低于野生型烟草。在0 ℃条件下处理5 h,转MsZAT10基因烟草与野生型烟草相比积累更多的脯氨酸和可溶性蛋白,但丙二醛(MDA)含量要低于野生型烟草。另外,在300 mmol·L^-1 NaCl溶液中处理4 d,转MsZAT10基因烟草的打孔叶圆片仍保持绿色而野生型烟草明显失绿。以上结果表明MsZAT10基因在提高烟草对低温和盐胁迫的抗性方面具有重要的作用。     

细叶百合LpWRKY20基因对非生物胁迫的响应及抗旱性分析

以细叶百合LpWRKY20基因为研究对象,通过荧光定量(qRT-PCR)分析该基因在不同非生物胁迫中的表达,结果表明,在不同非生物胁迫中该基因表达量存在差异。利用叶盘法将pBI121-LpWRKY20-GFP植物表达载体转入烟草并获得转基因株系。在干旱胁迫条件下,转基因植株的表型优于野生型;转基因植株超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性均高于野生型,且随着时间的延长这种清除体内自由基的能力在显著升高,而丙二醛(MDA)含量均低于野生型,说明转基因植株细胞膜受损程度较低,具有较强的自我修复能力。干旱条件下表型及生理指标的变化均表明转基因植株具有较强的抗旱性,初步推断LpWRKY20具有抗旱的功能。     

杨树木质部特异启动子MDCesAP的改造及功能检测

木质部特异表达的强启动子有助于外源目的基因在植物木质部中高效表达。将2个杨树木质部特异启动子MDCe-sAP串联在一起,置换植物表达载体pBI121上的35S启动子,构建成pDMDCesAP-GUS植物表达载体,通过农杆菌介导,并采用叶盘法转化烟草,获得烟草抗性植株。β-葡糖醛酸酶(GUS)活性检测结果表明,该串联启动子DMDCesAP具有木质部特异性,有望应用于桑天牛寄主树种的抗虫转基因研究。     

抗真菌和抗除草剂基因多价植物表达载体构建及对烟草遗传转化的研究

利用基因重组技术,将木霉几丁质酶基因(Chi)和β-1,3-葡聚糖酶基因(Glu)进行融合并将其引入含bar基因的载体pAHC25中,成功构建了由Ubiquitin启动子分别驱动Chi-linker-Glu和bar的中间载体,然后将其上的Ubi-Chi-linker-Glu-nos和Ubi-bar-nos表达盒引入pBI121中,获得兼具除草剂抗性基因bar和真菌抗性基因Chi与Glu的三价植物表达载体pBIb-CG,并对烟草进行遗传转化,经PCR及Southern检测,共获得转基因烟草32株。外源基因已整合到烟草基因组中。离体抑菌试验表明转基因烟草叶片提取液对木霉菌和镰刀菌表现出一定的抗性。     

紫花苜蓿MsZIP基因超表达载体的构建及烟草转化

根据已经克隆得到的MsZIP基因(GenBank序列号:HQ911778),合成编码区cDNA,构建植物超表达载体PBI-MsZIP。将MsZIP基因插入到含有启动子35S和终止子nos的载体PBI121中, 酶切鉴定表明,目的基因已经正确的插入到载体中,超表达载体构建成功。采用CaCl₂冻融法将其转入农杆菌中,然后采用农杆菌介导的方法转化烟草(Nicotiana tobacum),共得到12株抗性烟草苗,选取其中长势良好的3株进行分析。结果表明:转基因烟草的PCR, RT-PCR和Southern-blot检测均得到了与目的条带大小一致的片段,说明已经成功获得了能够表达MsZIP基因的转基因烟草;进一步对转基因烟草进行组织化学染色分析,该基因在根、茎、叶中都可以表达。本试验为MsZIP基因功能的研究提供了理论依据和试验材料。     

紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的分离及遗传转化研究

WRKY转录因子是植物特有的转录因子,广泛参与植物对多种逆境胁迫的反应。但是对紫花苜蓿中WRKY转录因子的研究还较少。本研究从紫花苜蓿中克隆了一个WRKY I类转录因子MsWRKY33。该基因CDS全长1536 bp,编码512个氨基酸,结构分析显示MsWRKY33包括两个WRKY结构域和一个C2H2锌指结构(C-X4-C-X23-H-X-H),表明其属于WRKY I 族WRKY转录因子。亚细胞定位预测MsWRKY33蛋白定位在细胞核。MsWRKY33基因受盐、干旱和冷胁迫诱导,暗示基因可能参与了这些逆境胁迫的调控。构建原核表达载体pET-MsWRKY33, SDS-PAGE分析表明在大肠杆菌中表达了MsWRKY33蛋白。扩增MsWRKY33编码区cDNA,以pBI121为基础载体,构建植物超表达载体pBI121-MsWRKY33。采用农杆菌介导的愈伤组织培养法转化紫花苜蓿。利用nptⅡ基因引物和载体特异引物检测抗性苗呈阳性,表明目的基因已成功导入紫花苜蓿基因组中。qRT-PCR检测发现,MsWRKY33基因在转基因株系中得到增强表达。本研究为进一步探索WRKY转录因子基因在紫花苜蓿抗逆性调控中的作用奠定了基础。     

几个杨树木质部特异启动子片段表达载体的构建与功能分析

木质部纤维素合酶基因(CesA)在植物正常生长期的木质部特异表达,受到外界压力时可诱导在韧皮部表达,因而被用作杨树抗桑天牛转基因研究中的特异性表达启动子。将前期分离的CesA上游DNA片段JCesAP、YCesAP和MDCesAP分别替换植物表达载体pCAMBIA1302中的组成型启动子CaMV35S,构建成新的植物组织特异性表达载体pJCesAP-GFP、pYCesAP-GFP和pMDCesAP-GFP,然后采用农杆菌介导法转化烟草,均得到完整的再生烟草植株。经PCR初步检测证明目的基因已整合到烟草基因组中。荧光检测JCesAP、YCesAP和MDCesAP片段均能启动GFP蛋白的表达,在395 nm激发光下出现黄绿色荧光,显示3个CesA片段均具有在木质部特异表达的启动子活性。     

紫花苜蓿MsBBX24基因的克隆及耐盐性分析

盐胁迫是影响植物生长发育的主要非生物胁迫因子之一，BBX家族转录因子在植物色素积累、光形态发生、种子生长发育以及逆境适应等方面具有重要的调节作用。为明确紫花苜蓿BBX基因的功能，本研究使用Primer Premier 5软件根据NCBI数据库MsBBX24基因的序列设计特异性引物，以紫花苜蓿的cDNA为模板克隆MsBBX24基因。利用生物信息学软件对基因序列和结构进行分析，并与其他植物的BBX24进行比对和进化树构建，分析它们之间的进化关系。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析MsBBX24基因的表达模式。利用DNA的酶切与连接方法构建MsBBX24过表达载体，采用农杆菌介导法将其转入野生型拟南芥，通过除草剂Basta筛选，以半定量RT-PCR鉴定获得阳性转基因植株。通过对野生型和MsBBX24转基因拟南芥植株的表型观察和生理指标测定分析它们的耐盐性。研究结果表明，MsBBX24基因编码区序列长723 bp，编码240个氨基酸，分子量为30.58 kDa，等电点为7.74,MsBBX24与鹰嘴豆和蒺藜苜蓿的BBX24具有较高的同源性。qRT-PCR检测结果表明，MsBBX24基...