结缕草ZjCCS基因的克隆与表达分析

为了解Cu/Zn超氧化物歧化酶分子伴侣基因(CCS)在结缕草逆境胁迫过程中的表达调控机制,以结缕草(Zoysia japonica)盐胁迫条件下的转录组数据为依据,结缕草cDNA为模板,通过RT-PCR法,克隆了924 bp长的结缕草ZjCCS基因的CDS序列。同源性分析显示该基因与谷子(Setaria italica)同源性最高,含有植物CCS蛋白所特有的3个保守结构域。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术研究该基因在非生物胁迫条件下在结缕草叶片中的表达情况,结果显示,在盐胁迫条件下,ZjCCS基因的表达量呈先上升后下降的趋势,4 h表达量最高,相对于盐胁迫,干旱和重金属胁迫对ZjCCS基因的表达量影响不大,推测ZjCCS基因可能在结缕草响应盐胁迫过程中发挥作用。     

干旱胁迫下结缕草叶片抗坏血酸与相关生理指标变化的品种差异研究

通过盆栽试验,以日本结缕草与细叶结缕草为材料,研究了干旱胁迫下结缕草叶片AsA含量与相关生理指标的品种差异。结果表明,干旱胁迫下日本结缕草和细叶结缕草叶片中AsA含量与相关生理指标的动态变化规律基本相似,但品种间差异显著。干旱胁迫下2个品种的AsA含量和AsA/DHA均呈现先上升后下降的变化趋势,但日本结缕草下降的时间更早。干旱胁迫下叶片相对含水量、POD活性在2个品种中均呈下降趋势,但日本结缕草的下降趋势更明显,尤其在干旱胁迫后期。胁迫后日本结缕草叶绿素a与叶绿素b含量下降明显,而细叶结缕草变化不大。胁迫后两者的相对电导率和MDA含量均呈上升趋势,但日本结缕草增加的幅度更为显著。干旱胁迫后日本结缕草和细叶结缕草叶片Rubisco的含量均在第3天开始下降,胁迫后期日本结缕草Rubisco含量恢复到对照水平,而细叶结缕草Rubisco含量在胁迫后期显著高于对照。本研究结果表明,干旱胁迫下结缕草可以通过增加和维持叶片中AsA含量与POD活性来减缓Rubisco及叶绿素的降解,降低干旱胁迫对植株造成的氧化胁迫伤害程度,进而改善其抗旱能力。本研究结果进一步证实结缕草抗旱能力有品种差异,其中日本结缕草抗旱能力弱于细叶结缕草。     

暖季型结缕草对低温响应的生理生态特性

以沟叶结缕草和结缕草为材料,测定了两种结缕草在低温胁迫下叶片主要抗性生理指标及其内源激素的变化,结果表明:在低温胁迫下,两种结缕草叶片可溶性糖、可溶性蛋白质和脯氨酸含量都显著增加,叶片SOD、POD和CAT三种酶活性和MDA含量都有不同程度增强或增加.其中沟叶结缕草叶片可溶性糖和脯氨酸含量及SoD和CAT值增幅均大于结缕草,表现出更强的生长优势;低温对两种结缕草叶片的类胡萝卜素(Car)含量,叶绿素a (Chla)、叶绿素b(Chlb)以及Chla/Chlb的比值也产生了较大的影响.在低温胁迫下,两种结缕草叶片内ABA含量增加,GA3含量下降,抑制类激素ABA含量与促进类激素GA3、IAA和ZR含量总和的比值升高,IAA和ZR含量则表现为10℃时增加,O℃时减少.     

沉默CCR和CAD基因培育低木质素含量转基因多年生黑麦草

木质素作为维管植物的重要成分之一,主要存在于细胞的次生壁中。然而,木质素却是许多工农业加工过程的限制因素,例如在化学制浆、牧草消化以及木质纤维转化为生物酒精等过程中。肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)和肉桂醇脱氢酶(CAD)是催化木质素单体生物合成最后两步的关键酶。本研究根据NCBI中黑麦草CCR和CAD基因序列设计特异引物并添加相应酶切位点,从野生型多年生黑麦草cDNA分离克隆CCR和CAD基因片段,分别构建了含正反方向目的片段的植物表达干扰载体p23-iCCR和p23-iCAD。通过根癌农杆菌EHA105介导转入多年生黑麦草胚性愈伤组织,经过巴龙霉素筛选和PCR检测获得导入了干扰CCR和CAD基因片段的转基因株系i-CCR和i-CAD。常规方法测定相对木质素含量,结果显示,与对照相比,有9株i-CCR植株和11株i-CAD 植株木质素含量显著降低,分别平均降低了34.67％,33.86％,且生长正常。本研究表明通过干扰CCR和CAD基因表达,可以获得低木质素含量的多年生黑麦草,为进一步培育易消化吸收的黑麦草提供了良好的种质资源。     

铅递进胁迫对假俭草和结缕草生理特性的影响

采用盆栽试验,研究了铅递进胁迫对假俭草和结缕草叶片脂质过氧化程度、叶绿素含量、脯氨酸含量及叶片抗氧化系统等的影响.结果表明,随着Pb2 处理浓度的升高,1)假俭草叶片出现不同程度的伤害,结缕草伤害较轻;2)2种草叶片膜脂过氧化产物丙二醛(MDA)含量增加,增大幅度假俭草大于结缕草;3)超氧化物歧化(SOD)活性在假俭草中先升高后降低,结缕草变化不明显;4)假俭草过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性均呈现先升高后降低的趋势,而结缕草恰好相反;5)游离脯氨酸(Pro)含量假俭草随铅胁迫浓度的增加先升高后降低,结缕草游离脯氨酸含量一直升高;6)2种草叶绿素含量都是呈现出先升高后降低的变化趋势.分析表明结缕草对铅的耐受性比假俭草强.     

梨果实中肉桂醇脱氢酶基因的克隆与序列分析

肉桂醇脱氢酶( CAD ) 是木质素生物合成过程中的一个关键酶。本研究分别提取了‘砀山酥梨’及‘幸水’梨果肉总RNA，并通过RT-PCR、克隆和测序，成功获得了2个CAD的大小约为689bp的cDNA片段，并分别命名为PB-CAD（登录号：FJ478151）和PP-CAD（登录号：FJ478152）。在核苷酸水平上，这两个基因片段只有4个碱基的差异，编码相似性达99.6%的两个氨基酸序列，该序列由229个残基组成。通过蛋白质序列比较，发现梨果实CAD与其他植物中CAD氨基酸序列极为相似，与苹果Malus domestica （AAC06319）、梅Prunus mume （BAE48658）、枇杷Eriobotrya japonica （ABV44810）和葡萄Vitis vinifera （CAO21890）的相似性分别达到97.8%、95%、92.6%和83.4%。     

不同盐浓度下3种结缕草的耐盐性比较研究

以大穗结缕草、沟叶结缕草和日本结缕草为试材,研究了不同浓度NaCl(0.20%,0.40%,0.60%,0.80%)处理40 d后对3种草坪草叶片中保护酶(POD,SOD,CAT)活性、丙二醛、脯氨酸、叶绿素及可溶性蛋白含量的影响,以确定各自的耐盐性强弱。结果表明,随盐浓度增加,3种草坪草叶片中的保护酶活性、丙二醛、脯氨酸含量呈上升趋势。在0.80%盐浓度下,大穗结缕草叶片中的保护酶活性较高而丙二醛、脯氨酸含量较低;低盐浓度下(<0.40%),3种草坪草叶片的叶绿素含量、可溶性蛋白含量随盐浓度升高而升高,高盐浓度下(>0.60%),随盐浓度升高而下降。在0.80%盐浓度下,大穗结缕草叶片的叶绿素及可溶性蛋白含量较高且下降值较小。表明大穗结缕草具有较高的耐盐性。     

沟叶结缕草八氢番茄红素基因ZmPSY的克隆、亚细胞定位及表达分析

八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase,PSY)是生物类胡萝卜素合成途径中的一个关键酶。本实验从沟叶结缕草中克隆得到ZmPSY基因(Genbank登录号为:KY264128)。该基因开放阅读框为1230 bp,编码409个氨基酸残基。亚细胞定位结果显示,ZmPSY定位于叶绿体中。实时荧光定量分析表明,ZmPSY基因在沟叶结缕草幼嫩的叶片中表达量最高。ZmPSY可受外施激素脱落酸(ABA)的诱导,但受外施激素水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)的抑制。本实验为深入研究沟叶结缕草八氢番茄红素合成酶基因的功能奠定了基础。     

结缕草肌动蛋白基因全长cDNA的克隆及序列分析

根据植物肌动蛋白(Actin)基因编码区的保守序列设计引物,提取结缕草叶片的总RNA,进行RT-PCR。并采用RACE技术扩增出1560bp的Actin基因全长cDNA序列。序列分析表明,该基因的开放阅读框(ORF)为1134bp,编码377个氨基酸,5′非编码区117bp,3′非编码区309bp。所得序列与GenBank中收录的其他植物肌动蛋白核苷酸序列的一致性均在85%以上,氨基酸序列的一致性高达97%以上。将其命名为ZjACT,GenBank登录号为GU290545。根据高等植物肌动蛋白相似性构建的系统进化树显示,结缕草肌动蛋白与大麦和圆锥小麦肌动蛋白之间的亲缘关系最为密切,在进化中分化时间最为接近。进一步分离克隆了结缕草Actin基因的基因组DNA序列(登录号GU290546),它由4个外显子和3个内含子组成。本研究有助于揭示植物Actin基因家族的进化历史,为研究植物Actin基因家族功能和进化上的多样性奠定理论基础,同时也为开展草坪草和牧草Actin基因的功能分析和利用研究提供参考。     

日本结缕草ZjTCP20基因生物信息学及表达模式分析

TCP是高等植物所特有的一类转录因子，参与调控植物的生长发育、衰老及逆境应答等多个生物学过程。本研究从日本结缕草(Zoysia japonica)中克隆出ZjTCP20基因，并对该基因进行生物信息学分析、自激活检测、表达模式分析等来探究该基因特性。ZjTCP20基因完整编码区为624 bp,编码208个氨基酸。ZjTCP20蛋白无信号肽，具有疏水性，系统发育进化树结果显示其与玉米(Zea mays)ZmTCP20亲缘关系最近。亚细胞定位显示该蛋白定位于叶绿体、细胞质和细胞核上。ZjTCP20基因表达模式结果显示，该基因在幼嫩叶片中大量表达，随植物发育表达量逐渐减少，但茉莉酸甲酯(MeJA)等3个激素对基因的表达量没有显著影响。酵母自激活试验显示ZjTCP20具备自激活活性。本研究为进一步研究ZjTCP20基因提供了科学依据。     

苦豆子赖氨酸脱羧酶基因启动子在拟南芥中的表达分析

赖氨酸脱羧酶(LDC)基因是苦豆子中氧化苦参碱(OMA)生物合成的第一个关键酶基因。在已有苦豆子赖氨酸脱羧酶基因(SaLDC)基础上克隆得到该基因上游1260 bp的启动子序列,GenBank登录号为KY038928,前期在苦豆子愈伤组织中的瞬时表达研究显示该启动子具有启动活性。生物信息学分析发现该启动子区域除了拥有启动子区的基本顺式作用元件TATA-box和CAAT-box外,还具有多个与光信号、逆境应答等相关的顺式作用元件。为进一步研究SaLDC启动子的功能,构建了该启动子与β-葡萄糖苷酸酶(GUS)报告基因融合的植物表达载体并通过农杆菌介导遗传转化拟南芥,同时对光诱导和聚乙二醇(PEG)胁迫的转基因拟南芥进行GUS活性染色和定量分析。结果显示,在T₂代转基因拟南芥幼苗的不同生长阶段和成株的各组织器官中均可检测到GUS酶活性,且随幼苗生长时间的延长,叶片中的表达活性下降;在成株叶片和花萼中的表达活性强于根、茎、花瓣和角果。光和PEG胁迫均能诱导转基因拟南芥中GUS的表达;GUS酶活性定量测定显示,短时间的PEG胁迫(1~2 h)GUS酶活性显著上调(P<0.05),而连续胁迫8 h时GUS酶活性下调至最低(P<0.01),比胁迫前下降了28.2%。以上结果表明SaLDC启动子既有时空表达特异性又有组织表达特异性,光诱导和干旱胁迫对结构基因的表达有重要的调控作用。     

柠条CkCAD基因的克隆转化及其抗旱功能分析

干旱胁迫严重影响植物的生长发育甚至生存状态,是限制我国西北荒漠植被恢复的主要非生物胁迫因素之一。实验室前期研究发现随黄土高原由南向北降水减少,柠条苯丙烷生物合成是差异表达最显著的代谢途径。本研究遂以柠条苯丙烷合成途径中木质素合成酶基因CkCAD为研究对象,生信分析表明该基因开放阅读框全长1074 bp,编码357个氨基酸;蛋白序列比对发现柠条CkCAD与非洲相思豆、蒺藜苜蓿、大豆和花生的亲缘关系较近,相似度均在80%以上,其中与非洲相思豆ApCAD最为相似。蛋白质偏酸性且为亲水性蛋白,无跨膜结构域,亚细胞定位于细胞质中。通过农杆菌介导法利用过表达载体pCAMBIA1302将柠条CkCAD转入野生型拟南芥中。在筛选获得T₃代纯合阳性植株后进行抗旱性分析。对T₃代过表达CkCAD拟南芥进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和Western blot检测发现CkCAD及其酶蛋白在拟南芥中呈稳定表达。相较于野生型拟南芥,T₃代过表达CkCAD拟南芥叶脉长度和叶脉密度更大,脉岛长径、脉岛短径更短,脉岛密度更大,叶脉更为发达且木质素含量更高。同时发现干旱处理下T₃代过表达植株的叶片萎蔫程度、丙二醛含量、相对电导率均低于野生型植株,而相对含水量则高于野生型植株。从而证实干旱胁迫下柠条木质素合成酶基因CkCAD可以促进木质素合成进而提高过表达拟南芥植株的抗旱性。     

基于转录组测序分析象草木质素合成的研究

采用高通量测序技术Illumlna HiSeq 2000对高木质素的象草品系eg7和低木质素的象草品系eg87(对照)茎组织进行转录组比较测序。测序获得了169630902个序列读取片段(reads),包含13788439920nt碱基信息。对reads进行序列组装,获得87641个单基因簇(unigene),平均长度580nt。从长度分布、GC含量等方面对unigene进行评估,数据显示测序质量好,可信度高。将获得的unigene与Nr、Nt、Swiss-Prot、COG、GO和KEGG数据库进行序列同源性比较和功能分析,62557个unigene与其他生物的已知基因具有不同程度的同源性,象草与高粱序列同源性最高。共鉴定出33323个差异表达基因,其中上调基因9704个(29.12%),下调基因23619个(70.88%);GO分析显示39968个unigene归为54个功能类别,大量unigene与细胞进程、代谢过程、催化活性等相关;KEGG pathway分析富集得到127条代谢通路,包括光合作用、betalain生物合成、苯丙烷类代谢、苯丙氨酸代谢等,苯丙烷类代谢途径差异基因富集程度高、差异基因数目最多,达285条,该途径中64条木质素单体合成酶基因表达上调,79条ClassⅢ型植物过氧化物酶基因表达下调、22条上调。挑选9个差异基因进行qRT-PCR验证,9个基因的表达趋势与高通量测序结果一致。为象草的分子生物学研究提供了宝贵的基因组数据,对于了解象草茎生物合成与木质素调控基因挖掘和多用途定向育种具有指导意义。     

日本结缕草ZjERF1的克隆、转录激活活性、亚细胞定位及表达分析

ERF转录因子是植物体内最大的一类转录因子之一,在调控植物生长发育和响应环境胁迫等方面发挥着重要的作用。研究利用RACE技术,从日本结缕草中克隆到ZjERF1基因(GenBank登录号为MH294481),开放阅读框为630 bp,编码209个氨基酸残基,含有1个高度保守的AP2结构域,属于典型的ERF转录因子。利用染色体步移技术,成功获得ATG上游1581 bp的启动子序列,生物信息学分析表明其中含有多个响应MeJA等激素和非生物胁迫的作用元件。为分析其转录激活特性,构建了pGBKT7-ZjERF1载体,转化Y2HGold酵母感受态细胞,结果表明其具有较强的转录激活活性。为探析其亚细胞定位情况,成功构建35S::ZjERF1:YFP载体,本生烟草瞬时表达结果证明ZjERF1定位于细胞核。为进一步研究ZjERF1的表达特征,利用实时荧光定量的方法进行了验证,结果表明:ZjERF1在日本结缕草茎中表达量最高,并且与叶片的衰老程度呈正相关性;此外ZjERF1的表达可受200μmol·L^-1 ET、10μmol·L^-1 MeJA和300 mmol·L^-1 NaCl处理的诱导,但受到20%PEG4000的抑制。研究表明ZjERF1是一个可参与多种信号转导途径的优良转录因子,为进一步探索ZjERF1基因的功能及其调控机制奠定了基础。     

高羊茅FaRVE8基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

生物钟是一个复杂的调控网络,在环境的不断变化中促进植物的生长,REVEILLE8 (RVE8)是生物钟的重要基因。为探讨其分子机理,采用RT-PCR和RACE方法,克隆高羊茅叶片FaRVE8基因,结果显示,FaRVE8全长为1881 bp,有1236 bp的开放阅读框,编码411个氨基酸,同属于MYB样因子。遗传进化树表明其与禾本科植物二穗短柄草、节节麦、大麦的同源蛋白亲缘关系较近。利用荧光定量分析高羊茅叶片中FaRVE8在不同光照处理下的表达特征,结果表明,FaRVE8在不同光照处理下均有表达,且呈现出明显的昼夜节律。亚细胞定位显示FaRVE8定位在细胞核中,可能在细胞核中发挥重要作用。以上研究表明,FaRVE8在调节生物节律中有重要作用,为进一步探讨FaRVE8基因的功能和分子调控机制奠定基础。     

日本结缕草ZjNAC1的克隆、转录激活活性、亚细胞定位及表达分析

采用RACE技术从日本结缕草中克隆得到ZjNAC1转录因子(GenBank No. MH428376),其开放阅读框为945bp,编码314个氨基酸。ZjNAC1编码的蛋白在N端有1个典型的NAM保守结构域,属于NAC转录因子家族。通过染色体步移的方法,获得ZjNAC1基因ATG上游1635bp序列,分析发现其包含响应脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)及逆境胁迫的作用元件。构建pGBKT7-ZjNAC1载体,转化Y2HGold酵母感受态细胞,发现ZjNAC1具有转录激活活性。农杆菌介导的35S-ZjNAC1-YFP载体注射本生烟草叶片瞬时表达结果显示,ZjNAC1定位于细胞核。实时荧光定量结果表明,ZjNAC1在日本结缕草根中表达量最高;此外,ZjNAC1的表达受10μmol/L MeJA和20%PEG4000处理的诱导,但受200μmol/L乙烯(ET)、10μmol/L ABA和300mmol/L NaCl处理的抑制。