克伦特罗小分子半抗原偶联率的测定方法研究

利用重氮化两步法将半抗原盐酸(CL)分别偶联到牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(O-VA)上制得了免疫抗原BSA-CL和包被抗原OVA-CL。建立了用紫外分光光度法测定偶联比率的方法,测得它们的偶联率分别为39:1和24:1。     

克伦特罗小分子半抗原偶联比率的测定方法研究

利用重氮化两步法将盐酸克伦特罗(CL)分别偶联到牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)上制得了免疫抗原BSA-CL和包被抗原OVA-CL。建立了用紫外分光光度法测定偶联比率的方法,测得它们的偶联比率分别为39∶1和24∶1。     

金黄色葡萄球菌CP8-ClfA-FnBPB偶联物的制备及其免疫学特性

以己二酰肼为间桥,碳二亚胺为偶联剂,将纯化的血清8型荚膜多糖和纯化的ClfA-FnBPB融合蛋白偶联制备偶联物,并在偶联的过程中确定其最佳质量比和偶联比.用制备的偶联物免疫小鼠,同时用间接ELISA法检测抗体水平,并对三免后2周的小鼠进行攻毒保护试验.结果显示,用化学方法制备的多糖-蛋白偶联物在其质量比为1:2时可成功偶联,计算得到偶联比为1:1.89.采用间接ELISA法检测抗体水平,二免后7d,偶联物免疫组可产生抗体,且抗体效价最高可达1∶6 400.阴性对照组和单独多糖组均没有抗体产生,而单独融合蛋白组在二免后产生了抗体反应,但抗体效价较低,最高时仅为1∶100.对小鼠进行攻毒保护的结果表明,偶联物组的攻毒保护率最高,可达80％,而阴性对照组、单独多糖组以及单独融合蛋白组的保护率分别为20％、30％和60％.     

水牛肝片吸虫病间接ELISA诊断方法的建立及应用

以肝片吸虫的分泌－排泄物作为抗原（ES抗原），建立水牛肝片吸虫病间接ELISA诊断方法，并用此方法与粪便检查法检测江苏和安微2省10县（市）302户的307头水牛的血清和粪便；间接ELISA诊断法的最佳工作条件，每乳包被0．2μg抗原，血清稀释度为1：960，二抗稀释度为1：600。结果粪便检查出虫卵的阳性水牛43头，阳性率为14．01％，其中安徽省为11．61％（18／155），江苏省为16．45％（25／152）；用间接ELISA法检测299头水牛血清，阳性87头，阳性率为29．19％，其中安徽省为23．53％，江苏省为34．92％，两种方法的符合率为86．05％。     

两种不同偶联比的莱克多巴胺免疫原免疫效果比较

将同窝3月龄体重2 kg左右的新西兰白兔随机分为2组,每组5只,分别用偶联比为2.5∶1、10∶1的莱克多巴胺-BSA(BSA-Rac)免疫6次后,间接ELISA和间接抑制ELISA检测抗血清的效价和特异性。结果表明,偶联比为10∶1的免疫原产生了效价超过1∶10000以上、IC₅₀值约为10 ng/ml的抗体,而偶联比为2.5∶1的免疫原未产生抗体。     

口蹄疫病毒特异性抗体间接ELISA检测方法的建立

以Chap10-VP1融合蛋白为包被抗原。建立了检测口蹄疫病毒特异性抗的间接ELISA方法。抗原包被浓度为50μg／L时。血清最佳稀释度为1：400，病毒与阳性血清的反应可被Chap10-VP1蛋白阻断，检测的灵敏度为1：1600。     

猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅱ蛋白的表达、纯化及其间接ELISA检测方法的建立与应用

将含有猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅱ基因的质粒pET-ApxⅡ转化到大肠杆菌BL21(DE3)。挑选出表达量最高的克隆子，于37℃经IPTG诱导表达。对表达条件进行优化，并对包涵体进行了提纯和复性。用复性后的蛋白作抗原，建立了检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗体的间接ELISA，试验的最佳反应条件为：最佳抗原稀释度为1：160，抗原包被液用Tris-HCl(pH8．0)，封闭液用含0．4％BSA的PBST，血清稀释度为1：40，二抗稀释度为1：6000，稀释液用含0．4％BSA的PBST，血清反应时间为30min，二抗反应时间为45min，底物反应时间为20min。与间接血凝(IHA)检测结果比较，建立的ELISA诊断方法具有良好的稳定性和可重复性，并具有较高的特异性和敏感性。用建立的间接ELISA对2503份临床送检血清进行了血清流行病学调查，结果表明，胸膜肺炎放线杆菌抗体的阳性率为63％。     

牛分枝杆菌重组MPT83蛋白间接ELISA方法的建立

以纯化的牛分枝杆菌重组MPT83蛋白为包被抗原，建立了检测牛分枝杆菌抗体的间接ELISA方法。确定了间接ELISA各组分的最适反应条件：抗原包被浓度为1μg／mL，酶标二抗稀释度为1：1600，血清稀释度为1：60，抗原和血清、血清和二抗均在37C反应30min，底物在37℃显色15min，D655nm阴性、阳性临界值为0．5。经阻断试验、交叉试验、重复性试验，表明该方法特异性强、重复性好。用该方法对18份结核菌素试验阳性牛血清和36份结核菌素试验阴性牛血清进行检测，结果显示，阳性血清的符合率为27．8％，阴性血清的符合率为91．7％。     

猪抗克伦特罗(CL)抗血清的制备及其IgG纯化与鉴定

为了获得高特异性、高纯度的猪抗克伦特罗 (CL)IgG ,将克伦特罗跟牛血清白蛋白 (BSA)偶联后 ,选取 1 0头大×大×约三元杂交猪 (5头为免疫组 ,5头为对照组 ) ,用偶联物BSA CL对其进行免疫 ,来制备猪抗CL抗血清。以卵清蛋白 (OVA)跟CL的偶联物OVA CL为包被抗原 ,采用ELISA法测定抗血清效价和血清阻断率。结果表明 ,有 4头猪体内产生了抗CL抗体 ,且在第 2次加强免疫后达到最大 ,效价为 1∶2 0 0 0 0 ;而当血清稀释率为 1∶40 0 ,CL的PBS液浓度在 1 8× 1 0 - 4 ～ 7 0× 1 0 - 7之间时 ,其阻断率为 80 %～ 1 8%。随后用正辛酸 硫酸铵法对血清抗体进行纯化 ,经紫外吸收法测定和SDS PAGE电泳试验结果表明IgG成份得到了纯化 ,可用于进一步的免疫试验     

莱克多巴胺人工抗原的合成与鉴定

用戊二酸酐将盐酸莱克多巴胺活化成莱克多巴胺-戊二酸酐半醛,用混合酸酐法将莱克多巴胺-戊二酸酐半醛与KLH和BSA偶联,合成免疫原和包被抗原,经核磁共振法和紫外吸收法鉴定,偶联成功.用紫外吸收法测定免疫原和包被抗原的偶联比分别为24：1和2.5：1.用免疫原免疫新西兰白兔,采用间接ELISA法检测抗体效价,采用间接竞争ELISA法检测IC50值,获得了效价为1：6 000以上、IC50值为10 ng/mL的多克隆抗体,证明合成的人工免疫原具有免疫原性.     

非洲猪瘟病毒p30基因的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测血清中非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFV p30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种血清中ASFV抗体的检测方法。结果显示,ASFV p30基因成功克隆到原核表达载体pET-32a （+）中,获得pET-32a-p30重组质粒;转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞进行诱导表达,得到P30重组蛋白,重组蛋白大小约为42 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,纯化后的蛋白具有良好的免疫原性;以纯化的P30重组蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了抗原最佳包被浓度为1.2 μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1：100,最佳封闭液为1% BSA,酶标抗体最佳稀释度为1：4 000,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.322。本方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达到1：1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均<10%。本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。     

间接ELISA检测犬瘟热血清抗体方法的建立

以重组表达的犬瘟热病毒融合蛋白(fusion protein,F)作为包被抗原,建立了检测犬瘟热病毒血清抗体的间接ELISA方法。所建立的间接ELISA抗原包被浓度为125ng/孔,血清最佳稀释度为1∶160。经阻断试验、重复性试验等表明该方法特异性强、重复性较好,可用于犬瘟热血清抗体的定量和定性检测。     

多西环素人工抗原的合成与鉴定

将多西环素（doxycycline,DOX）进行化学修饰引入羧基或氨基等活性基团,然后与牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）偶联合成人工免疫原DOX—PABA—BSA、DOX—BSA和包被原DOX—PABA—OVA、DOX～OVA,并用紫外吸收（UV）、凝胶电泳（SDS—PAGE）和EUSA方法对人工抗原进行鉴定;将合成的人工抗原DOX—PABA—BSA、DOX—BSA分别免疫BALB／C小鼠,用间接ELISA方法测定多抗（pAb）效价,用竞争ELISA方法鉴定其敏感性,用交叉反应试验鉴定其特异性。结果表明,二个免疫组6只小鼠血清抗体效价均在1：6400以上,DOXpAb对DOX的50％抑制浓度（IC50）在39．79～53．13μg/L,抗血清与四环素类药物交叉反应很低。本实验为建立多西环素ELISA残留免疫学检测方法和并制备多西环素试剂盒奠定了基础。     

边缘无形体MSP2的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立可检测边缘无形体（Anaplasma marginale）的血清学检测方法,该研究根据GenBank收录的边缘无形体MSP2基因序列（登录号：EU526889）,构建重组质粒pET28a-MSP2,原核表达获得pET28a-MSP2重组蛋白,将纯化后的蛋白作为抗原,建立间接ELISA检测方法。结果显示,该研究建立的间接ELISA方法,抗原最佳包被浓度、血清最佳稀释度和酶标二抗最佳工作浓度分别为8μg/mL、1∶400和1∶2 000,特异性、灵敏性和重复性良好。本试验成功表达并纯化了边缘无形体的MSP2蛋白,并建立了边缘无形体抗体间接ELISA方法,为边缘无形体的监测和诊断提供参考。     

莱克多巴胺多克隆抗体的制备

采用多元酸酐法活化盐酸莱克多巴胺，用混合酸酐法将活化的莱克多巴胺与载体蛋白（KLH，BSA）偶联，制备了莱克多巴胺免疫原KLH-Rac和包被抗原BSA-Rac。以KLH-Rac免疫新西兰白兔获得了莱克多巴胺多克隆抗体，以BSA-Rac为包被抗原，采用间接ELISA检测抗血清，其效价达到1：6000，间接竞争ELISA测得抗血清的IC50值约为5ng／mL，其与克伦特罗、沙丁胺醇、特布它林的交叉反应性小于0．01％。     

布鲁菌Rev.1株eryA基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

通过对布鲁菌优势抗原eryA基因进行原核表达,在获得目的蛋白的基础上建立以该蛋白为包被抗原的间接ELISA方法。构建原核表达载体pET-30a-eryA,并将其转入大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,镍柱亲和纯化eryA重组蛋白,SDS-PAGE 鉴定纯化蛋白,Western-Blotting检测反应原性后建立间接ELISA方法。反应条件优化后,抗原包被浓度为0.312 5 μg/mL,37 ℃包被2 h;封闭液为5%猪源明胶,37 ℃作用2 h;血清稀释度为1∶100,37 ℃作用1 h;酶标抗体稀释度为1∶8 000,37 ℃作用45 min。血清稀释度为1∶1 600时,仍然检测为阳性,证明建立的间接ELISA方法灵敏性良好;其他菌种及病毒经过特异性检测,均为阴性,证明建立的间接ELISA方法特异性良好;通过重复性检测,批间及批内变异系数均小于10%,证明建立的间接ELISA方法重复性良好。检测临床血清样品,建立的方法与试管凝集试验总符合率为95.7%,证明该方法可初步应用于临床诊断。     

猪圆环病毒2型ORF2基因截断表达及ELISA抗体检测方法的初步建立

为建立以重组PCV2Cap蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,构建了猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因原核表达质粒pET28a-ORF2。SDS-PAGE显示,在0.1mmol/L IPTG和37℃条件下诱导4h,重组Cap蛋白高效表达。Western blotting证实该蛋白能够被PCV2阳性血清特异性识别。以纯化的蛋白为抗原建立了检测PCV2抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原最适包被质量浓度为2mg/L;血清最佳稀释度为1∶100;酶标二抗最适浓度为1∶2 000,该方法的敏感性为86.96%,特异性为100%。用该方法对河南省152份猪血清样品进行检测,与间接免疫荧光（IFA）的符合率为85.53%（130/152）,与商品化的韩国金诺PCV2ELISA试剂盒的符合率为88.16%（134/152）。本试验成功建立了PCV2血清抗体间接ELISA方法,具有较高的敏感性和特异性,可用于大规模的血清学检测。     

SMD残留检测的ELISA方法的建立和初步应用

用戊二醛法将SMD与载体蛋白BSA偶联 ,制备合成抗原SMD BSA作免疫原 ,同法合成包被抗原SMD OVA ,免疫健康家兔获得抗血清。分别用双向琼脂扩散试验和ELISA试验对抗血清进行定性定量测定 ,结果表明所获抗血清特异性针对SMD。用所制备的抗血清建立间接竞争ELISA方法。优化了ELISA的工作条件 ,方阵测定确定了包被抗原最佳浓度 (50 μg/mL) ,抗血清最佳稀释度 (1∶1 0 0 ) ,酶标抗体的最适工作稀释度 (1∶50 0 ) ,并建立了ELISA标准工作曲线。工作曲线表明在 1 0～ 2 0 0 0 μg/L浓度范围内呈良好的线性关系。该法检测底限为 63μg/L,低于国际规定残留限量 (1 0 0 μg/kg)和国内规定残留限量 (30 0 μg/kg)的要求。本法同时测定了回收率以及实际样品血清中的SMD的残留含量     

A型塞内卡病毒VP2蛋白阻断ELISA检测方法的建立

为了建立一种检测A型塞内卡病毒(SVA)VP2蛋白抗体的阻断ELISA方法,试验用SVA VP2蛋白作为抗原包被酶标板,采用棋盘法确定最佳蛋白包被浓度和单克隆抗体最佳稀释倍数。同时对阻断ELISA的其他条件(封闭液、血清稀释度、底物反应条件)进行优化,对方法的特异性和重复性进行考察。结果表明:VP2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL;最佳封闭液为2%BSA,每孔200μL,37℃封闭1 h;待检血清最佳稀释度为1∶1,在37℃条件下作用1 h;单克隆抗体最佳稀释度为1∶40 000,在37℃条件下作用1 h;底物最佳反应条件为室温避光10 min。特异性试验结果显示,SVA阳性血清与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综征病毒、猪瘟病毒、猪口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应。批间、批内重复性试验结果的变异系数均小于10%。对200份猪血清样本进行荧光抗体中和试验和阻断ELISA方法检测,符合率为96.0%。说明该ELISA方法具有良好的特异性和重复性,可用于塞内卡病毒血清抗体检测和流行病学调查。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白间接ELISA诊断方法的建立和应用

以纯化的原核表达的猪圆环病毒2型（PCV-2）重组结构蛋白（rCap蛋白）为包被抗原,建立PCV-2间接ELISA诊断方法;对抗原最适包被浓度、待检血清稀释浓度、重组抗原包被条件、封闭液的筛选、阴阳性临界值等条件进行了优化;对优化后的ELISA检测方法进行特异性试验、临床应用试验;组装试剂盒并进行试剂盒保存期试验。优化反应条件后确定的抗原最适包被浓度为2.815 μg/mL,抗原最佳包被条件为37 ℃ 2 h;血清最适稀释度为1∶40,酶标抗体最适稀释度为1∶500,最佳封闭液为1% BSA;阴阳性临界值判定标准为D450 nm≥0.33,判为阳性,D450 nm＜0.33,判为阴性。特异性试验结果表明,只有PCV-2阳性血清反应后的D450 nm＞0.33,包括抗PCV-1阳性血清在内的其他5种抗血清反应后的D450 nm＜0.33,说明所建立的ELISA方法具有良好的特异性。经对临床疑似PCV-2感染的100份血清样品进行检测,阳性检出率为69%。组装试剂盒在4 ℃条件下至少可保存12个月以上,说明所建立的诊断方法可以在生产中大量推广应用。本研究成功建立了能特异性检测抗PCV-2血清抗体的ELISA检测方法。