参与鸭疫里默氏杆菌生物被膜形成的关键基因的鉴定

正中国农业科学院上海兽医研究所的科研人员为筛选鸭疫里默氏杆菌(RA)生物被膜形成过程中的关键基因,研究首先采用PCR检测了10个生物被膜形成相关基因在生物被膜形成强、弱和无的菌株中的分布,根据试验结果,比较了CH3株在置玻璃试管和12孔聚乙烯板中培养时5个生物被膜形成相关基因在转录水平上的     

鸭疫里默氏杆菌假定溶血素相关蛋白基因Riean_0620的原核表达及溶血活性检测

为研究鸭疫里默氏杆菌(RA)的假定溶血素相关蛋白Riean_0620的功能,本研究根据血清10型RAHXb2株Riean_0620基因序列设计引物,PCR扩增Riean_0620基因,并进行序列测定与分析。将Riean_0620基因克隆到原核表达载体p ET-43.1a进行诱导表达,采用亲和层析纯化获得重组蛋白r Riean_0620。溶血活性检测结果表明r Riean_0620具有裂解鸭红细胞的活性。本研究将有利于进一步研究Riean_0620蛋白的生物学特性以及RA的溶血机制。     

鸭疫里默氏杆菌氨基糖苷类药物的耐药性分析

为了调查鸭疫里默氏杆菌3种氨基糖苷类耐药基因aac (3)-Ⅱ、aadA、aac (6′)-Ⅱ的携带情况,探讨耐药基因与氨基糖苷类药物表型的相关性,试验选用常用氨基糖苷类抗生素对20株来自扬州、苏州、滁州、泰兴、淮安、南京地区的鸭疫里默氏杆菌进行药敏试验,用PCR法检测耐药基因aac (3)-Ⅱ、aadA、aac(6′)-Ⅱ,结晶紫染色法检测生物被膜形成能力。结果表明:20株鸭疫里默氏杆菌对氨基糖苷类药物中的妥布霉素耐药率最高,其次是多黏菌素B、庆大霉素和诺氟沙星,最后是丁胺卡那和链霉素;耐药基因aac (3)-Ⅱ、aadA与aac(6′)-Ⅱ的检出率均为0;20株鸭疫里默氏杆菌均能形成生物被膜,但OD_(595)值均在0.31～1.00之间,为弱生物被膜。说明鸭疫里默氏杆菌对氨基糖苷类药物具有强耐药性,且应少用妥布霉素等氨基糖苷类药物。     

鸭疫里默氏杆菌假定溶血素相关蛋白基因Riean_0415的原核表达及溶血活性检测

为了分析鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)假定的含CBS结构域的溶血素相关蛋白(hypothetical hemolysinrelated protein,HRP)的功能,本研究根据血清10型鸭疫里氏杆菌HXb2株Riean_0415基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物,采用PCR扩增了Riean_0415基因,并进行了序列测定与分析。然后将Riean_0415基因克隆到原核表达载体p ET-43.1a,再用亲和层析纯化获得诱导表达的重组蛋白r HRP。溶血活性检测结果表明表达的重组蛋白r HRP具有裂解鸭红细胞的活性。本研究结果为进一步研究r HRP蛋白的功能和鸭疫里默氏杆菌的溶血机制等奠定了基础。     

鸭疫里默氏杆菌CH3株tonB1或tonB2基因缺失对生物被膜形成的影响

为探究鸭疫里默氏杆菌CH3株TonB1和TonB2蛋白对其生物被膜形成的影响,本研究采用自杀质粒同源重组的方法分别构建了tonB1和tonB2基因的缺失突变株CH3△tonB1和CH3△tonB2。同时将tonB1和tonB2基因ORF克隆于大肠杆菌-鸭疫里默氏杆菌穿梭表达载体pRES中,构建回补株CH3△tonB1(pRES-TonB1)和CH3△tonB2(pRES-TonB2)。利用结晶紫染色法对野生株CH3、突变株CH3△tonB1和CH3△tonB2及其回补株的生物被膜进行测定。结果表明,与野生株CH3相比,突变株CH3△tonB1和CH3△tonB2生物被膜形成能力显著降低(p0.05),而回补株CH3△tonB1(pRES-TonB1)和CH3△tonB2(pRES-TonB2)的生物被膜形成能力较突变株显著增强。本研究结果表明鸭疫里默氏杆菌的TonB1和TonB2蛋白与其生物被膜的形成相关。     

鸭疫里默氏杆菌GroEL蛋白的原核表达和单克隆抗体制备

本试验旨在研制鸭疫里默氏杆菌GroEL蛋白的单克隆抗体。将鸭疫里默氏杆菌WJ4菌株的groEL基因进行原核表达,重组蛋白经过纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠。经过3次免疫后,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,用间接ELISA筛选阳性细胞株并进行3次亚克隆后制备小鼠腹水单克隆抗体。共获得2株稳定分泌鸭疫里默氏杆菌GroEL单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1G2B6和1G2F10。2株单克隆抗体均为IgG1亚类。腹水单克隆抗体ELISA效价达到1:102 400。Western blot检测结果表明2株单克隆抗体均能与鸭疫里默氏杆菌血清1、2和10型菌株发生特异性结合,而与禽致病性大肠杆菌、沙门氏菌和禽巴氏杆菌菌株无反应性。本研究成功制备了稳定性好、特异性强的鸭疫里默氏杆菌GroEL单克隆抗体,为进一步研制基于抗体检测鸭疫里默氏杆菌抗原的试剂盒奠定了基础。     

鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定与生物学特性研究

为了解鸭疫里默氏杆菌的流行情况和药物敏感性,本研究对广东省、山东省、江苏省等地区疑似鸭疫里默氏杆菌病的病料进行病原分离和鉴定,并测定分离株对抗菌药物的敏感性。结果显示,共鉴定到46株鸭疫里默氏杆菌,其中血清1型、2型、10型和15型菌株依次为9株、25株、1株和1株,未定血清型菌株10株;RA分离株普遍对林可霉素、多粘菌素和诺氟沙星耐药,表明RA分离株对临床常用药出现了不同程度的耐受;易感鸭的动物回归试验能够复制出典型的原始病例,且可从死亡雏鸭中分离到同源菌株。该研究结果为鸭疫里默氏杆菌病疫苗选用和临床用药提供了科学的参考依据。     

科技动态

血清1型鸭疫里默氏杆菌灭活油乳剂疫苗的研制为研究血清1型鸭疫里默氏杆菌(R.anatipestifer,RA)的灭活油乳剂疫苗,中国农业科学院上海兽医研究所丁铲等将10株血清1型RA的临床分离株经腿部肌肉注射7日龄雏鸭进行动物体内复壮,结果表明所有被     

鸭疫里默氏杆菌贵州分离株的耐药性及致病性分析

从贵州三穗地区某鸭场临床疑似鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)感染的病死鸭体内分离得到6株病原菌,经细菌形态观察、生化试验和PCR鉴定确定为RA。对6株RA分离株的血清型鉴定、耐药性及致病性试验,结果表明:6株分离菌中有4株为血清2型,其余2株血清型未定;所有分离株对大环内酯类和氨基糖苷类药物耐药,而对青霉素类和头孢类药物高度敏感;将血清2型RA菌株以9×107cfu/m L剂量经肌肉注射后可导致雏鸭发病死亡,病死鸭表现典型的鸭疫里默氏杆菌病临床症状。结果表明,贵州三穗地区主要流行血清2型RA,且对多种抗生素呈多重耐药且致病性强,应加强对血清2型RA的监测和防控。     

间接ELISA检测鸭疫里默氏杆菌血清抗体方法的建立

应用1型鸭疫里默氏杆菌(云南株)超声粉碎物作为包被抗原,建立检测鸭疫里默氏杆菌血清抗体的间接ELISA方法。用倍比稀释法确定HRP标记羊抗鸭二抗最佳稀释倍数为1∶3500,并用棋盘测定法确定抗原的最佳包被浓度为2.7mg/mL,血清最佳稀释倍数为1∶300,阴性血清临界值为0.381;阻断试验结果表明,1型鸭疫里默氏杆菌与其抗血清阻断阳性,与鸭大肠杆菌O78、O132菌株和FJ4型鸭疫里默氏杆菌阻断阴性(无交叉反应)。重复性试验结果表明,该ELISA方法批内变异系数≤0.246,批间变易系数≤0.889。结果表明,该ELISA方法特异性强,重复性好,可用于1型鸭疫里默氏杆菌(云南株)血清抗体的检测。     

鸭疫里默氏杆菌MFS外排泵rant基因缺失株的构建及其介导的耐药性

旨在构建鸭疫里默氏杆菌rant基因缺失株及回复株,明确MFS外排泵Rant对鸭疫里默氏杆菌耐药性的影响。本研究以鸭疫里默氏杆菌RA-LZ01株为研究对象,通过自杀质粒pRE112介导的同源重组,以红霉素抗性标记进行正向筛选,获得基因缺失株Δrant,并以大肠杆菌-鸭疫里默氏杆菌穿梭质粒pCPRA作为载体,构建回复株cΔrant。采用微量肉汤稀释法测定11类临床常用抗生素对野生株、缺失株及回复株的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）,并测定3株菌的生长曲线,评价菌株对雏鸭的致病能力。结果表明,与野生株和回复株相比,四环素类抗生素对缺失株的MIC值明显下降,其他类抗生素的MIC值无变化;缺失株的生长速率明显下降;rant基因的缺失显著降低鸭疫里默氏杆菌的毒力。结果提示,鸭疫里默氏杆菌rant基因介导四环素类抗生素的外排,并可明显影响鸭疫里默氏杆菌的生长和毒力。     

鸭疫里默氏杆菌血凝素基因的克隆、表达及其蛋白的定位分析

为研究鸭疫里默氏杆菌(R.anatipestifer)血凝素蛋白的功能,本实验克隆表达了鸭疫里默氏杆菌血凝素基因,并对其蛋白定位进行了分析。根据鸭疫里默氏杆菌CH3株血凝素基因序列设计一对特异性引物,采用PCR扩增不同血清型鸭疫里默氏杆菌的血凝素基因,进行序列测定与分析。结果表明其血凝素基因全长1 059 bp,编码352个氨基酸。不同血清型鸭疫里默氏杆菌血凝素间的氨基酸同源性为94.1%～100%,与黄杆菌3519-10株血凝素的氨基酸同源性为68.0%～68.9%。采用表达的血凝素蛋白免疫鼠血清和鸭抗鸭疫里默氏杆菌阳性血清对血凝素在细菌中的定位分析表明,鸭疫里默氏杆菌血凝素可能不是一种膜蛋白,而是存在于胞浆中的一种蛋白。     

血清15型鹅源鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及交叉免疫保护研究

本研究对安徽省某鹅场急性死亡的雏鹅进行了细菌分离鉴定,无菌采集病死鹅肝脏、脑和心包液,经过培养特性观察、染色镜检、生化特性检测以及16S rRNA和血清学检测,鉴定病原菌为血清15型鸭疫里默氏杆菌,命名为LAG1株。该分离菌株对四环素类药物敏感,而对卡那霉素等耐药;对雏鸭的致病性强,半数致死量(LD50)测定为7.75×103CFU/只;交叉免疫保护试验结果显示LAG1灭活油乳剂疫苗对自身菌株攻毒的免疫保护率可达80%以上,对血清10型鸭疫里默氏杆菌HXb2攻毒的保护率可达70%,对血清1型鸭疫里默氏杆菌WJ4和血清2型鸭疫里默氏杆菌Yb2攻毒的保护率低于20%。本研究结果可为安徽省养鹅业鸭疫里默氏杆菌病的防治工作提供参考。     

鸭疫里默氏杆菌10个基因在菌株中的分布及序列分析

检测鸭疫里默氏杆菌（Riemerellaanatipestifer,RA）10个基因在不同菌株间的分布并进行序列分析,研究其在不同菌株中的保守性。分别选取8株RA的10个基因进行PCR扩增,扩增产物克隆于pMD18-T载体,进行序列测定和分析。结果显示：测定的8株RA菌株中均能检测到Lipid A、LuxE和TCTR编码基因,表明这些基因在不同血清型RA菌株中的保守性良好;TR基因仅从6株具有致病性的RA菌株中扩增得到,而2株非致病性RA菌株NJ1和NJ4未能扩增到,表明TR基因可能与RA菌株的致病性相关;IS1仅从6株血清1型和2型的RA菌株扩增得到,2株血清10型菌株均未扩增得到,提示IS1为血清10型菌株缺失基因。     

一株肉种鸡源鸭疫里默氏杆菌分离鉴定及致病性研究

为探究鸭疫里默氏杆菌对鸡的致病力,试验采集疑似感染鸭疫里默氏杆菌的病死肉种鸡肝脏进行病原的分离培养与纯化、革兰氏染色、生化试验、血清型鉴定、16S rRNA基因测序分析及药敏试验,并将分离菌株在SPF鸡、樱桃谷鸭上进行致病性试验。结果显示：分离到1株血清1型鸭疫里默氏杆菌,该菌株与鸭源、鸡源、鹅源鸭疫里默氏杆菌的相似性分别为99.24%～99.47%、99.16%～99.31%、99.04%～99.20%;该分离株对恩诺沙星、卡那霉素、头孢噻肟、多黏菌素B和多西环素较为敏感,对SPF鸡致病性较弱,可引起一过性精神沉郁和泡沫粪,对樱桃谷鸭有较强的致病性,可引起死亡和严重的纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎。研究表明分离的肉种鸡源RA对鸡致病力相对较弱,结果为临床鸡群感染RA的诊断与防控提供参考。     

宜良县鸭疫里默氏杆菌分离株的血清型鉴定及药物敏感性试验

对2008～2010年从云南宜良县鸭传染性浆膜炎病鸭中分离的鸭疫里默氏杆菌的血清型和抗药性进行了调查和分析。在89个鸭场中共分离鉴定出鸭疫里默氏杆菌67株。平板凝集试验结果表明血清1型菌株有61株,占分离株总数的91．04％,是宜良县鸭疫里默氏杆菌的优势血清型。以纸片法测定了所分离菌株对18种常用抗菌药物的敏感性,仅头孢噻吩、氟苯尼考和阿莫西林相对敏感,敏感菌株的比例分别为100％、82．90％和62．69％。此外,多重耐药现象严重。     

血清2型鸭疫里默氏杆菌铁载体受体蛋白突变体的构建及生物学特性研究

铁离子是致病菌重要的生长因子,研究表明铁离子摄取系统调控鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)铁离子的代谢,是鸭疫里默氏杆菌重要的致病因子之一。为了研究RA外膜ATP依赖的铁载体受体蛋白(siderophore receptor protein,SRP)在铁离子代谢中的作用,以及SRP与细菌毒力之间的关系,本研究构建了SRP基因的突变株,通过TSB培养基和限铁环境中的生长曲线比较,结果显示突变株在限铁环境中比TSB培养基生长慢约10 h,表明SRP基因是鸭疫里默氏杆菌在体内维持铁离子代谢至关重要的成份。动物试验表明突变菌株比野生型菌株晚24 h开始死亡,说明突变菌株在体内增殖并达到致死数量的速度明显要晚于野生型,从而提示SRP是鸭疫里默氏杆菌重要的毒力因子之一。     

血清6型鸭疫里默氏杆菌发酵工艺与攻毒模型的建立

本试验对不同地区分离的3株血清6型鸭疫里默氏杆菌,通过摇瓶试验筛选出血清6型鸭疫里默氏杆菌适宜的增菌液体培养基和细菌计数培养基,通过5L发酵罐各菌株生长曲线的对比,筛选出适合工业化发酵的菌株以及发酵工艺参数,通过鸭疫里默氏杆菌疾病模型条件筛选确立了攻毒模型.结果 显示:WF201910株和TA201912株适宜的增菌液...     

应用抑制性差减杂交筛选鸭疫里默氏杆菌强弱菌株基因组的差异片段

为了分析鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)强毒菌株HXb2和弱毒菌株NJ-1基因组之间的差异基因,以HXb2株基因组为待测菌株,以NJ-1株基因组为驱动菌株,构建了两株细菌基因组间的抑制性差减文库。经过dot-blot杂交和PCR验证,共鉴定到34个强弱毒株基因组差异片段。测定的序列经BLAST、DNAStar和PSORTb分析,结果表明有2个片段所在基因编码的蛋白为外膜蛋白,有2个片段所在基因编码的蛋白为胞质膜蛋白如磷酸盐转运蛋白,11个片段所在基因编码的蛋白为胞内蛋白如丙氨酸脱氢酶、β-内酰胺酶及一些假定蛋白等,有19个片段所在基因编码的蛋白(大部分为假定蛋白)定位未知。这些差异基因编码的蛋白可能与鸭疫里默氏杆菌的毒力及HXb2株特异蛋白等有关。本研究为下一步鉴定新的毒力基因及其他特异蛋白的功能奠定了基础。     

广东地区鸭疫里默氏杆菌RAPD分型研究

为了解广东地区鸭疫里默氏杆菌的流行情况,研究采用随机引物初步建立了鸭疫里默氏杆菌RAPD扩增多态性方法,对分离自广东地区的20株鸭疫里默氏杆菌进行鉴定。结果显示:20株鸭疫里默氏杆菌产生16种不同的指纹图谱;有些鸭场存在两种或两种以上基因型的菌株并且不同鸭场流行基因型不一样。该结果可为该地区鸭疫里默氏杆菌病的防治提供参考。鸭疫里默氏杆菌RAPD指纹图谱存在丰富的多样性,可用于鸭疫里默氏杆菌的快速基因分型及分子流行病学调查。