哺乳动物性控DNA疫苗研究现状和构想

介绍了DNA疫苗的定义、组成、机理、应用策略,综述了X、Y精子间蛋白和mRNA的研究现状,指出X、Y精子间基因表达差异的存在,利用mRNA差异显示技术可对X、Y精子构建性别差异表达的消减cDNA文库,大规模筛选性别差异表达基因,在此基础上应用DNA疫苗技术,既避开蛋白质水平寻找X、Y精子弱差异蛋白这个困难,又能够特异性地抑制X或Y精子,更经济地实现对性别的控制.性控DNA疫苗是新的研究方向.     

X、Y精子差异膜蛋白及其分离方法的研究进展

X、Y精子差异膜蛋白的分离是利用抗原抗体反应进行性别控制的关键环节,H-Y抗原是最早被发现并应用于性别控制的Y精子特异抗原,但由于抗原特异性较差,未能在生产中得到广泛应用。雄性性别传递偏移、性别偏移及其他相关研究表明,尽管在精子形成过程中,细胞间桥使两类精子部分基因的表达产物被共享了,但X、Y精子膜蛋白差异仍然存在。同时,差异膜蛋白分离技术的进步及这些技术的优化集成,使这种差异膜蛋白的分离成为可能。     

奶牛Y精子膜蛋白的提取与分析

奶牛Y精子膜蛋白的提取与鉴定为深入研究Y精子特异膜蛋白在受精过程中的作用，开发经济、安全、高效的奶牛性别控制方法具有重要意义。本研究采用超声波破碎法将精子膜与精子分离，分离后的精子膜粗品采用蔗糖密度梯度离心法进行纯化。纯化的精子膜经膜蛋白提取液（去污剂）提取，透析浓缩。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）银盐染色，成功地提取到膜蛋白。BIO—RAD凝胶成像分析仪分析得知Y精子膜蛋白至少有10种，分子量范围为7．94KD-166．65KD，其中尤以15KD的蛋白含量最多。     

性控奶山羊精液X和Y精子分离比例检测方法的建立

旨在建立可以定量计算奶山羊精液中X、Y精子数量的双重TaqMan荧光定量PCR方法,用以检测经过分离的奶山羊精液X和Y精子的数量和比例,为性控技术的开发和生产应用提供技术支撑。本研究选择X、Y染色体中特异基因F9及ZFY片段设计引物,建立标准曲线,优化荧光定量PCR反应体系和条件。通过对阳性标准品梯度稀释以及对60支已知纯度的性控精液进行测定(3次重复)来检验方法的敏感性和可靠性。结果显示,所建立的双重TaqMan荧光定量PCR方法特异性和重复性好,X和Y精子检测灵敏性分别为47和51 copies·μL~(-1);利用该方法对商品化的奶山羊性控冷冻精液中X和Y精子的数量和比例进行计算,其结果与销售公司提供的X和Y精子的纯度无显著差异(P0.05),表明该方法结果可靠。本研究建立的计算奶山羊X、Y精子数量的双重TaqMan荧光定量PCR方法特异性和重复性好,灵敏度高,结果可靠,为计算奶山羊精液分离后X、Y精子数量及比例提供了快速可靠的方法。     

性控奶山羊精液X和Y精子分离比例检测方法的建立

旨在建立可以定量计算奶山羊精液中X、Y精子数量的双重TaqMan荧光定量PCR方法,用以检测经过分离的奶山羊精液X和Y精子的数量和比例,为性控技术的开发和生产应用提供技术支撑。本研究选择X、Y染色体中特异基因F9及ZFY片段设计引物,建立标准曲线,优化荧光定量PCR反应体系和条件。通过对阳性标准品梯度稀释以及对60支已知纯度的性控精液进行测定（3次重复）来检验方法的敏感性和可靠性。结果显示,所建立的双重TaqMan荧光定量PCR方法特异性和重复性好,X和Y精子检测灵敏性分别为47和51 copies·μL^-1;利用该方法对商品化的奶山羊性控冷冻精液中X和Y精子的数量和比例进行计算,其结果与销售公司提供的X和Y精子的纯度无显著差异（P>0.05）,表明该方法结果可靠。本研究建立的计算奶山羊X、Y精子数量的双重TaqMan荧光定量PCR方法特异性和重复性好,灵敏度高,结果可靠,为计算奶山羊精液分离后X、Y精子数量及比例提供了快速可靠的方法。     

分离X、Y精子准确率评估方法的应用研究

近年来X、Y精子分离技术发展迅速,利用该技术分离的X、Y精子广泛应用于人工授精,依靠观察后代表型来完成数据的收集及分析费时费力,且效率低。X、Y精子比例的鉴定在精子分离过程及性控冻精的使用效果评价中显得非常重要。该研究对比了几种精子准确性评估方法,以期为研究人员提供参考。     

奶牛XY精子分离后输精对超排卵子受精及人工授精受胎率的影响

就奶牛生产而言,如能将产母犊率提高10％。15％,则对迅速发展我国乳牛业能起很大作用。流式细胞仪精子分离法是根据X、Y两类精子在DNA含量上的差异来分离精子。分离X、Y精子并用于人工授精或显微授精是控制家畜性别最简单、可行的方法之一,它可在授精之前就控制其性别,避免了胚胎的浪费。现在,超数排卵利用性控精液生产性控胚胎是性控胚胎移植的主要胚胎来源。对优良种母牛进行超排生产性控胚胎,是充分挖掘良种母牛的遗传潜力和向社会提供大量优质性控胚胎的重要手段。本研究旨在检测和验证流式细胞分离仪分离精子的过程或染料对奶牛超数排卵后卵母细胞受精及胚胎质量的影响,以及通过精子分离后奶牛精液对受胎率及性别比率的控制。     

奶牛性控冻精人工授精技术要点

<正>奶牛性控冻精生产技术原理是利用XY精子分离技术,通过流式细胞精子分离仪,将奶牛公牛的X精子和Y精子进行有效分离,将所分离收集到的X精子,通过平衡、稀释、精子分装机装管,冷冻制成奶牛性控冻精细管。利用性控冻精细管对奶牛实施人     

牛性控精液纯度快速评价方法研究

为建立一种方便快捷的性控精液品质鉴定方法,本研究选择牛X、Y染色体特异基因PLP与SRY,对其提取质粒,构建含有不同比例的PLP和SRY质粒模板,即X:Y为1:20、1:10、1:5、1:1、5:1、10:1、20:1,并将其作为性别相关DNA定量的参考模板,使用实时荧光定量PCR(Real-timePCR)对市售的3头公牛性控精液进行了性别比例检测。结果表明:采用该方法检测的X-分选精液、Y-分选精液与未分选精液中X与Y精子比例与其所标注的X、Y精子比例(流式细胞仪重分析检测纯度)差异不显著。因此,本研究中建立的实时荧光定量PCR测定法可用于评估性控精液的纯度。     

应用5%精氨酸溶液对奶牛控性输精试验中得到的启示

应用经过科学处理的精液进行控性输精,以期获得更多的母犊,是繁育工作者多年来探索的技术和需要解决的课题之一,也是深受广大养牛户欢迎的项目。曾有过许多从精子角度的控性试验,其原理多是分离X精子和Y精子,以单一类(X或Y型)精子输精,或者以抑制Y精子或激励X精子,控制其运行速度的方法。     

对奶牛配种中几种性别控制技术的比较

1性控精液 性控精液包括鲜精和冻精两种方式。首先是提取优种公牛的精液；然后根据精液中含X、Y染色体不同精子其物理特性（包括体积、密度、电荷、运动状态）、化学特性（包括DNA含量、特异抗原）的不同。运用光学、电学等原理对精子进行分离：再剔除含有Y染色体多的精子。提取保留含X染色体多的精子，即获得性控鲜精，含X染色体的精子达到90％以上。可直接用于输精配种。而经过这样分离后的性控鲜精，再制作成冻精就称为性控冻精。     

膜联蛋白Ⅴ去除奶牛死精子技术及其在性控冷冻精液生产中的应用

本研究旨在通过膜联蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ)与奶牛死精子的特异结合,并尝试与免疫磁珠技术共用去除奶牛精液中死精子,从而提高性控精液生产效率。试验结果显示,通过膜联蛋白Ⅴ与免疫磁珠筛选后的精子活力、膜完整性、线粒体活性均有不同幅度改善,特别是上机分离时X/Y死精率明显下降(P0.05),说明该技术流程设计可以有效去除部分死精子,提高性控精液生产效率。同时,试验证明膜联蛋白Ⅴ与免疫磁珠筛选操作对于分离后的X或Y精子制备的性控冷冻精液各项产品技术指标均没有明显影响(P0.05),说明该技术流程并不会对精子造成额外的损伤。综上所述,本研究开发的Annexin Ⅴ蛋白的特异性结合免疫磁珠方法与技术工艺,可以有效去除奶牛精液中的死精子,显著提升奶牛性控冷冻精液生产效率、降低生产成本,为家畜性别控制冷冻精液推广应用提供新的技术支撑。     

胚胎性别控制技术

性别控制技术是把应用分子生物学和细胞生物学方法,按着人们预先的设计,有计划控制畜禽性别的技术和发展这种技术的研究领域叫做性别控制技术。迄今已经取得了许多令人鼓舞的研究成果。性控的方法,由于后代的性别是由雄性的家畜决定的,因此,性控方法主要包含着受精前对精子的类型鉴别和对附植前胚胎的性别选择两种手段。受精前精子的类型的鉴别方法有①X、Y型精子的分离,由于X、Y型精于在形态上、重量上、表面电荷、运动性以及顶体的抗原上存在差异,因此,通过各种方法将精子中两种类型的精子分开,然后再输精。目前主要采取的方法有:精子电泳分离法、精子离心分离法、情     

荷斯坦奶牛性控冻精人工授精应用效果的研究进展

近年来,对性别控制的研究呈现出迅速发展的趋势。应用性控冻精进行人工授精,是快速增加优质高产奶牛数量的有效途径。奶牛性控冻精的人工授精技术是将奶牛种公牛的精液通过精子分离仪使含X、Y染色体精子得到有效地分离,再将分离后得到的X精子冷冻制成冻精,进行人工授精,从而使母牛怀孕产母犊的技术。     

奶牛性控冻精技术推广的几点体会

奶牛性控冻精技术是采用XY精子分离技术来获得良种母牛冻精，把这种根据精子X、Y染色体的不同而分装冷冻的冻精就叫性控冻精，含X精子达90％以上，是目前最先进、最快的一种良种繁育技术。     

水牛性控精液微生物分析

研究针对目前分离水牛X和Y精子性别控制过程中,容易导致微生物快速繁殖进而污染性控精液的问题,对水牛新鲜及冷冻性控精液中的微生物进行分析研究,以期改进水牛分离精子保存方法。结果表明:新鲜采集的水牛精液、常规冷冻精液及分离后的冷冻精液中,平均菌落密度分别为10 619个/mL、293个/mL和18935个/mL,三者差异显著(P0.05)。新鲜精液检测到的菌落中,革兰氏阳性球菌占48%,阴性杆菌占41%,阳性杆菌占9%,霉菌占2%;性控冷冻精液中的菌落100%为革兰氏阴性杆菌。对性控冻精菌落药敏检测发现,菌落对妥布霉素和庆大霉素均呈现耐药性,而对丁胺卡那霉素以及药物环丙氟哌酸药物敏感性较强。本研究结果,为改进水牛分离精子稀释液以及冷冻保存液中的抗生素使用提供了有价值的参考。     

马鹿X/Y精子分离及人工授精技术研究

对马鹿X/Y精子进行分离、冷冻保存和人工授精,探讨马鹿鲜精保存运输、精子分离以及性控冻精的受胎及后代性别控制准确率.结果表明:①马鹿鲜精中加入三联抗生素、18℃恒温保存最有利于精子活力的保持.②马鹿鲜精死精率与X/Y精子分离速度有明显相关性,死精率越低,分离速度越快.③来自同一马鹿供体的3组样品分离精子解冻后活力(0.61 vs 0.60 vs 0.65)及4 h时活力(0.30 vs 0.30 vs 0.32)无显著差异(P>0.05).④应用马鹿性控冻精对80只发情母鹿进行子宫角深部输精,有55只母鹿妊娠期满产下仔鹿,情期受胎率67.5%,均为雄性,性别控制准确率100%.结论:分离马鹿X/Y精子的冷冻保存、人工授精,在技术上已达到产业化应用水平,通过进一步改善后,可以大规模推广应用.     

Toll样受体7/8在公猪生殖系统中的表达及其配体对猪X/Y精子分选效果评价

旨在分析Toll样受体7/8(TLR7/8)在公猪精子及生殖器官中的表达情况，并探讨是否能通过其配体处理的方式分离猪X精子和Y精子。本研究采用qRT-PCR分析3头健康成年公猪睾丸、附睾头、附睾体、附睾尾以及精子中TLR7和TLR8基因的mRNA表达水平，利用免疫组化检测公猪睾丸和附睾中TLR7和TLR8蛋白的表达，并通过细胞免疫荧光分析其在不同物种(健康成年小鼠、公牛和公猪)精子中的表达情况，将其配体R848与猪精子共孵育，研究其对精子活力以及X/Y精子分离的影响。结果表明，TLR7和TLR8 mRNA在公猪睾丸、附睾头、附睾体、附睾尾组织以及精子中均表达；免疫组化结果显示，TLR7/8蛋白在睾丸中主要表达于生殖细胞，在附睾中主要表达于柱状细胞微绒毛中；细胞免疫荧光结果表明，TLR7和TLR8蛋白只表达于小鼠和牛X精子尾部，Y精子中不表达，但TLR7和TLR8蛋白在公猪X和Y精子中都表达且表达模式无显著差异，TLR7蛋白主要表达于猪精子头部顶体区域，TLR8蛋白主要表达于猪精子尾部；与对照组相比，用TLR7和TLR8配体R848孵育猪精子后，精子活力降低，但上层精子的性别比例无显著差...     

性控精液在牛体外性控胚胎生产中的应用

利用性控精液结合体外胚胎生产技术是获得预知性别后代的一种有潜在效率的方法.自20世纪90年代,利用流式细胞仪将X精子和Y精子分离开来,使畜牧生产性别选择的梦想变为现实,性控精液得到了极大的推广应用.本文重点阐述利用性控精液进行胚胎体外生产的研究和生产状况.     

流式细胞仪用于牛精液分选的技术要点

流式细胞仪应用于性控冻精生产是目前奶牛生产繁育性别控制技术的有效方法。本文阐述了流式细胞仪分离精子的工作原理及应用效果,并对流式细胞仪分离精子存在的问题进行了分析,提出了奶牛X精子和Y精子分离技术的展望。