牛贝诺孢子虫抗原制备及间接血凝试验诊断牛贝诺孢子虫病的研究

本文报道了直接用贝氏贝诺孢子虫病牛皮肤制备诊断抗原,并用所制抗原通过微量间接血凝法(间接血凝)对吉林、内蒙、河北以及黑龙江等省(区)1086头(份)牛血清进行诊断研究的结果。 所制抗原为蛋白类抗原,其蛋白含量为1.26～1.48毫克/毫升。间接血凝试验表明,207头(份)带虫牛血清检出阳性反应牛196头(份),阳性符合率为94.68％,血凝效价达1∶40～5120;56头健康牛血清均为阴性反应;67头类症病牛血清除2头肉孢子虫牛血清血凝效价为1∶40外,其余均为阴性;3头人工感染牛(18份血清)最早于接种后10天出现阳性反应,比眼巩膜出现虫体包囊早40～50天;来自上述疫区的738头被检牛,通过临床、组织学以及眼巩膜包囊等检查,检出带虫病牛55头(7.45％),而间接血凝法检出阳性牛150头(20.33％),两者相差非常显著。血清学诊断进一步证实了上述地区发生的牛“厚皮病”就是牛贝诺孢子虫病。     

牛分枝杆菌重组MPT83蛋白间接ELISA方法的建立

以纯化的牛分枝杆菌重组MPT83蛋白为包被抗原，建立了检测牛分枝杆菌抗体的间接ELISA方法。确定了间接ELISA各组分的最适反应条件：抗原包被浓度为1μg／mL，酶标二抗稀释度为1：1600，血清稀释度为1：60，抗原和血清、血清和二抗均在37C反应30min，底物在37℃显色15min，D655nm阴性、阳性临界值为0．5。经阻断试验、交叉试验、重复性试验，表明该方法特异性强、重复性好。用该方法对18份结核菌素试验阳性牛血清和36份结核菌素试验阴性牛血清进行检测，结果显示，阳性血清的符合率为27．8％，阴性血清的符合率为91．7％。     

牛分枝杆菌CFP-10和ESAT-6基因的融合表达及其抗原活性鉴定

CFP-10和ESAT-6是牛分枝杆菌的免疫优势抗原,可诱导机体产生IFN-γ,在牛结核病的免疫诊断中发挥重要作用。本试验分别克隆了牛分枝杆菌CFP-10和ESAT-6基因,并将这2个基因融合扩增,构建重组表达质粒pET28a/CFP-10-ESAT-6,重组质粒在大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达。重组蛋白主要以分泌表达的形式存在于表达上清中,收集上清中的目的蛋白进行Ni亲和层析柱和分子筛两步纯化,蛋白纯度分别达到90%和95%。将纯化的重组蛋白以2mg/L的质量浓度包被酶标反应板,用间接ELISA方法检测不同来源牛血清中的结核病抗体,结果表明,表达的重组融合蛋白具有良好的抗原活性,可有效识别阴、阳性结核病血清。     

Dot-ELISA检测牛副结核病抗体的研究

本文利用提纯的副结核分枝杆菌胞浆特异性抗原,建立了检测牛副结核抗体的Dot-ELISA方法。用该方法对粪便培养阳杜的32头份牛副结核病血清检测,检出27头,阳性检出率为84.4％,其敏感性与ELISA相似。与10头OT变态反应阳性牛血清检测,无交叉反应。M.phlci.M.fortuitum.M.kansasii人工高免血清经两次用M.phlci悬液吸收,用建立的Dot-ELISA方法也无交叉反应。表明设立的Dot-ELISA具良好的敏感性特异性。     

NSP—ELISA鉴别FMDV感染与免疫

利用大肠埃希氏菌表达的口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白(NSP)3ABC多肽作为抗原，建立了一种可区分FMDV感染与接种灭活疫苗免疫牛的间接酶联免疫吸附试验(I—ELISA)。通过对336份正常牛血清、508份注射疫苗牛血清、60份人工感染牛血清和58份豚鼠免疫血清的检测，确定了血清抗体阴性与阳性效价的临界值。试验证明，该方法简易、快速，灵敏度比VIAA—AGID高。     

抗副结核分枝杆菌细胞壁抗原单克隆抗体的制备和特性鉴定

用3M 氯化钾浸出的副结核分技杆菌细胞壁抗原(KCl-Ag)免疫的 BALB/C 小鼠脾细胞和 NS-1骨髓瘤细胞融合,制备出3株抗副结核分枝杆菌单克隆抗体—McAb-JM_1、JM_2、JM_3。用 ELISA 方法对3株单克隆抗体与副结核分枝杆菌及其他6种分枝杆菌不同抗原的反应性进行了研究.McAb-JM_1与副结核分枝杆菌不同菌株间的 KCl-Ag 和部分胞浆抗原(PPD)发生交叉反应;在其他分枝杆菌抗原中,仅与牛草分枝杆菌的 PPA 和禽型结核分枝杆菌 KCl-Ag 发生交叉反应.McAb-JM_2在副结核分枝杆菌中.与强毒株抗原发生较强反应.而与弱毒株抗原反应性较弱。McAb-JM_3在分枝杆菌中.除 Teps 株和偶发分枝杆菌抗原外.均发生交叉反应。本文讨论了这些单克隆抗体在副结核病血清学诊断及抗原分析中的意义和用途。     

Dot—ELISA检测牛副结核病抗体的研究

本文利用提纯的副结核分枝杆菌胞浆特异性抗原，建立了检测牛副结核抗体的Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ方法，用该方法对粪便培养阳性性的３２头份牛副结核病血清检测，检出２７头，阳性检出率为８４．４％，其敏感性与ＥＬＩＳＡ相似，与１０头ＯＴ变态反应阳性牛血清检测，无交叉反应。Ｍ－ｐｈｌｅｉＭ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ．Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ人工高兔血清经两次用Ｍ．ｐｈｌｅｉ悬液吸收，用建立的Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ方法也无交叉反应     

用荧光偏振测定检测牛血清中牛分支杆菌抗体

加拿大研究人员研制了一种用荧光标记MPB70蛋白作为抗原的荧光偏振测定(FPA)并对用其检测牛血清中牛分支杆菌抗体的能力进行了评价。本研究检查了3组血清。A组血清(28份)获自培养出牛分支杆菌的牛,B组血清(5666份)获自假定没有牛分支杆菌的加拿大现地牛,C组血清     

应用Dot-ELISA检测结核病牛血清抗体效价

用牛型结核菌菌体蛋白(PP)及提纯牛结核菌素(PPD)作抗原,硝酸纤维素滤膜(NC 膜)作载体。以斑点-酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)检测了30份结核菌素变态反应阳性牛及30份非结核病牛血清中的抗体效价。结果证实,Dot-ELISA 与变态反应符合率很高(20/30),只有简便、快速、经济及适于现场推广应用等优点,可望在今后牛结核病检疫中取代变态反应和常规 ELISA.     

在应用酶联免疫吸附试验诊断牛副结核病时消除假阳性反应的方法

建立了检测牛血清中副结核分枝杆菌的特异抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA),在试验过程中探索出一种可以避免在 ELISA 检测副结核分枝杆菌原生质抗原的抗体时,经常遇到的假阳性反应的方法。被检血清来源于副结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌。堪萨斯分枝杆菌或星形诺卡氏菌感染的牛,经细菌学检查为阴性而副结核补体结合反应阳性及用假结核分枝杆菌感染的羊。预先使用草分枝杆菌吸收后的试验血清,基本上可以消除掉假阳性反应。凡经过这种方法处理的血清,不会影响副结核病牛的 ELISA 抗体水平。试验结果表明预先用草分枝杆菌吸收的血清,可以消除在 ELISA 诊断牛副结核病     

副结核分枝杆菌MAP0862蛋白的表达及在间接ELISA中的初步应用

本研究的目的是探索副结核分枝杆菌特异性蛋白MAP0862在牛副结核病血清学诊断中的作用,建立牛副结核病特异性ELISA诊断方法。将通过原核表达获得的副结核特异性蛋白MAP0862纯化并定量后作为包被抗原,经过一系列条件优化后初步建立了牛副结核病间接ELISA诊断方法。使用牛副结核阳性血清、牛布病阳性血清、牛结核阳性血清、卡介苗免疫牛血清、牛大肠杆菌阳性血清以及健康阴性牛血清对该方法的验证表明其具有良好的特异性。使用该方法对300份临床血清进行检测,结果表明该方法与IDEXX副结核检测试剂盒的符合率为94.3%。基于副结核特异性蛋白质MAP0862建立的间接ELISA诊断方法能有效检测牛副结核病。     

用于检测孔雀石绿的全抗原的合成与鉴定

采用重氮化法,将半抗原副品红(Pararosaniline,PA)分别与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,反应得到免疫抗原和包被抗原,其偶联最佳结合比分别为8.8∶1,12.7∶1,6.9∶1,经紫外扫描光谱和蛋白电泳鉴定得到全抗原。用制备的抗原乳化后免疫小鼠获得了效价较高的多克隆抗体。为进一步制备抗孔雀石绿单克隆抗体打下基础。     

利用重组表位蛋白map0862-2154c检测牛副结核血清抗体胶体金免疫层析方法的建立（英文）

筛选牛副结核分枝杆菌的2个主要抗原map0862、map2154c中抗原指数高的抗原表位基因,将多表位基因序列合成,与原核表达载体pET28a(+)连接,构建重组质粒pET28a-map0862-2154c。重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中诱导表达,以表达的重组表位蛋白为抗原建立检测牛副结核分枝杆菌抗体的胶体金免疫层析方法(GICA,map0862-2154c-GICA),同时对河北省部分牛场采集的242份副结核病奶牛血样进行血清抗体检测。结果表明,牛副结核分枝杆菌表位蛋白map0862-2154c成功表达,表达产物能与牛副结核分枝杆菌阳性血清反应。临床血清样本检测结果表明,其敏感性、特异性和符合率分别为91.86%(79/86),94.23%(147/156)和93.38%(226/242),该方法可用于牛副结核病的血清抗体检测。     

排除检测牛副结核抗体的ELISA中非特异性反应的几种方法比较

为排除检测牛副结核抗体的ELISA反应中的非特异性反应,我们曾采用日本yokomizo等报道的方法,用草分枝杆菌进行吸收,并收到了较好的效果。为进一步探求其吸收效果,我们将用于吸收的草分枝杆菌抗原进行了几种不同的处理,并加以比较。材料与方法一、草分枝杆菌吸收抗原的制备将分枝杆菌接种于W-R液体培养基上,37℃培养3周左右,收获,以0.01MPBS(PH7.4)洗涤,离心,去上清,重复三次,取离心沉淀物置37℃温箱中烘干,以乳     

胎牛血清中牛病毒性腹泻病毒2型毒株分离及脱脂奶粉中抗体的检测

本研究旨在对进口胎牛血清中的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)进行分离及鉴定。利用BVDV抗原和抗体检测试剂盒检测,提取胎牛血清中的病毒RNA,用5′-UTR巢式PCR进行扩增,PCR扩增产物连接pMD19-T进行测序分析。胎牛血清样品接种MDBK细胞,进行细胞传代培养,通过细胞分离培养、直接免疫荧光抗体检测对实验室进口胎牛血清样品进行病毒分离及鉴定,应用DNAStar对BVDV 5′-UTR、N~(pro)与GenBank中公布的瘟病毒参考株进行多序列比对,采用Mega 6.0进行遗传进化分析。同时通过包被脱脂奶粉进行间接ELISA检测其中的BVDV抗体。结果显示,胎牛血清中BVDV抗原和抗体均为阳性,并且从胎牛血清中成功分离到一株新的牛源BVDV,命名为BVDV-GC株,该病毒株在MDBK细胞上进行增殖培养时未能引起细胞病变;5′-UTR与N~(pro) PCR扩增为阳性,扩增产物大小均与预期相符;直接免疫荧光检测荧光信号为阳性;病毒滴度为10~(-3.6)TCID_(50)/0.1 mL;遗传进化分析表明,该分离株与USMARC-60779(BVDV-2)株有较近的亲缘关系,同属于BVDV-2型毒株;通过包被脱脂奶粉和商品化的ELISA试剂盒进行检测,结果表明脱脂奶粉中存在BVDV抗体。本研究从进口胎牛血清中分离出1株BVDV-2型非致细胞病变病毒,从脱脂奶粉中检测到BVDV抗体,表明进口胎牛血清和脱脂奶粉中都存在BVDV抗原和抗体污染,本研究为后续试验分析提供参考。     

牛结核分枝杆菌重组多抗原表位基因的原核表达与鉴定

利用DNAStar对牛结核分枝杆菌的3个主要抗原mpb70、mpb83、esat-6进行预测分析,将预测的抗原指数高的抗原表位经全基因合成后,克隆到表达载体pET28a(+)中,构建重组质粒pET28a-mpb-70-83-esat-6,转化入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定,结果检测到相对分子质量约为21 000的重组蛋白。经NI-NTA纯化重组蛋白后进行Western-blot鉴定,结果显示该重组蛋白可被牛结核分枝杆菌的多克隆抗体识别,表明该蛋白具有良好的反应原性。     

应用酶联免疫吸附试验诊断牛肝片吸虫感染的研究

用肝片吸虫成虫制备部分纯化抗原,以10μg/ml浓度包被微量反应板,对疫区106份肝片吸虫感染牛血清、I7份正常牛血清及10份非疫区正常牛血清(1:200稀释)进行ELISA检测,以OD_(492)值大于非疫区正常牛血清OD_(492)值2倍为阳性标准(即>0.54)。结果表明,肝片吸虫感染牛血清的阳性检出率为81.1％,显著高于粪检虫卵的检出率42.4％(P<0.001)和琼脂凝胶双扩散试验的检出率65.1％(P<0.01)。疫区和非疫区正常牛血清的阴性符合率为100％、血清抗体的出现比虫卵的检出早2个月左右。据此认为,本法可用于本病的早期诊断和血清流行病学调查。     

牛结核分枝杆菌MPB70蛋白分泌性载体的构建与蛋白表达

为了研究牛结核病新型诊断抗原,试验根据GenBank中Mycobacterium bovis基因序列设计1对引物,将牛结核分枝杆菌MPB70基因构建到pET22b(+)原核表达载体上,将重组载体转到E.coliBL21(DE3)中,经IPTG诱导获得高效表达,并进行SDS-PAGE和Westen-blot分析。结果表明:MPB70蛋白以可溶形式在细胞周质中表达,有部分蛋白以包涵体形式在细胞质中表达,其分子质量约为30ku,蛋白表达量占菌体总蛋白的20%;重组MPB70蛋白可与牛分枝杆菌阳性血清发生特异性反应。说明重组MPB70蛋白能够作为诊断抗原。     

达氟沙星人工抗原的合成与鉴定

采用碳二亚胺偶联法将达氟沙星分别与牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)载体蛋白偶联,制备达氟沙星人工抗原DFLX-BSA和DFLX-OVA,并用FeCl3显色反应、紫外扫描和酶联免疫吸附试验对制备的人工抗原进行鉴定.结果表明:DFLX与BSA和OVA的偶联比为14: 1和16: 1时可成功地制备达氟沙星人工抗原.     

牛血清中蛋白组分初步分析及其对细胞培养的影响

为探讨牛血清中蛋白组分对细胞培养的影响,应用凝胶过滤层析对不同牛血清进行初步组分分析,并应用MTT比色法衡量不同牛血清的促细胞生长作用.结果表明,蛋白组分大小相对较为一致的新生牛血清、商品血清1、2、5(一个波峰)与蛋白组分差异较大的成年牛血清、商品血清3、4(两个或者两个以上波峰)的促细胞生长作用相比较差异显著(P相似文献