高羊茅黔草1号SAMDC基因的克隆及植物表达载体的构建

采用高保真平末端法从高羊茅"黔草1号"(Festuca arundinacea cv.Qiancao No.1)叶片c DNA中扩增S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因(SAMDC)序列。基因测序分析表明,扩增片段含有1 835个核苷酸,包含有9 bp的微型上游阅读框、147 bp的小型上游阅读框和1 185 bp的主阅读框。微型上游阅读框和小型上游阅读框存在一个碱基重叠,主阅读框编码395个氨基酸。整个克隆片段与Gen Bank上注册的高羊茅Fa SAMDC基因的核苷酸同源性为95.05%,编码氨基酸的同源性为98.22%。利用Kpn I和Pst I酶切位点将该片段插入到经贵州省草业研究所分子生物学实验室改造过的p CAMBIA1300植物表达载体的多克隆位点内,经琼脂糖凝胶电泳检测、酶切鉴定和序列测定,获得具有SAMDC基因和潮霉素抗性基因的适合于单子叶植物遗传转化的表达载体p CAM-SAMDC。通过冻融法将构建的重组质粒导入根癌农杆菌GV3101和EHA105感受态细胞中,并通过PCR反应对所获得的工程菌株进行鉴定,为进一步通过农杆菌介导法培养抗逆禾草新材料奠定了基础。     

白三叶TrSAMDC1克隆及表达分析

S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC)在植物抵御逆境胁迫中发挥着重要作用。通过分子生物学技术克隆得到一个全长为1559 bp的白三叶S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因,并命名为TrSAMDC1。对该序列进行生物信息学分析表明:TrSAMDC1开放阅读框长度为1077 bp,编码358个氨基酸;预测其编码的蛋白为不稳定的亲水性蛋白,无跨膜结构,无信号肽,二级结构的主要构件为无规则卷曲,三级结构为同源二聚体,可能定位于细胞质中;系统进化树表明TrSAMDC1与其他豆科植物SAMDC亲缘关系很近,在进化上高度保守。分析该基因在重金属镉(CdSO₄)、低温(4 ℃)、高温(35 ℃)、干旱(PEG-6000)和盐(NaCl)等非生物胁迫以及100 μmol·L^-1脱落酸(ABA)和1 mmol·L^-1生长素(IAA)等激素处理下的表达模式发现TrSAMDC1的表达具有组织器官和时空特异性:所有处理都能显著上调叶片的相对表达量,并且在大多数处理12 h后达到峰值。而根系表达量虽较对照有差异,但对各种处理的敏感程度显著低于叶片。推测该基因能在调节植物的生长发育以及植物应对非生物胁迫尤其是高温和重金属镉胁迫中发挥重要作用,以上结果为进一步研究该基因奠定了基础。     

白三叶TrSAMDC1克隆及表达分析

S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC)在植物抵御逆境胁迫中发挥着重要作用。通过分子生物学技术克隆得到一个全长为1559 bp的白三叶S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因,并命名为TrSAMDC1。对该序列进行生物信息学分析表明:TrSAMDC1开放阅读框长度为1077 bp,编码358个氨基酸;预测其编码的蛋白为不稳定的亲水性蛋白,无跨膜结构,无信号肽,二级结构的主要构件为无规则卷曲,三级结构为同源二聚体,可能定位于细胞质中;系统进化树表明TrSAMDC1与其他豆科植物SAMDC亲缘关系很近,在进化上高度保守。分析该基因在重金属镉(CdSO_4)、低温(4℃)、高温(35℃)、干旱(PEG-6000)和盐(NaCl)等非生物胁迫以及100μmol·L~(-1)脱落酸(ABA)和1 mmol·L~(-1)生长素(IAA)等激素处理下的表达模式发现TrSAMDC1的表达具有组织器官和时空特异性:所有处理都能显著上调叶片的相对表达量,并且在大多数处理12 h后达到峰值。而根系表达量虽较对照有差异,但对各种处理的敏感程度显著低于叶片。推测该基因能在调节植物的生长发育以及植物应对非生物胁迫尤其是高温和重金属镉胁迫中发挥重要作用,以上结果为进一步研究该基因奠定了基础。     

羊草乙醛脱氢酶基因LcALDH的克隆与表达分析

采用RACE技术从羊草中克隆了乙醛脱氢酶基因LcALDH的cDNA(GenBank登录号EF492045)。长为1 712 bp的LcALDH cDNA序列含有编码500个氨基酸的1 503 bp的开放读码框、66 bp的5′非翻译区和144 bp的3′非翻译区。氨基酸序列中含有醛脱氢酶家族绝对保守的谷氨酸活性位点和半胱氨酸残基活性位点。分析LcALDH基因在不同胁迫条件下的表达情况,结果表明,LcALDH的表达受到低温、干旱、高盐和ABA的正调控作用。研究结果为进一步从分子水平探明羊草的抗逆机制,挖掘并利用植物抗逆基因奠定基础。     

星星草PtGAPDH基因的克隆与表达分析

本试验利用RACE(rapid amplification of cDNA ends)克隆技术从星星草中克隆得到抗盐碱相关基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的cDNA全长序列,其GeneBank登录号为JX411954。PtGAPDH基因开放阅读框为1014 bp,编码337个氨基酸。该氨基酸序列与高羊茅、大麦、小麦、水稻等禾本科作物具有较高的序列相似性。系统进化分析表明,PtGAPDH基因编码蛋白与单子叶植物的GAPDH具有较近的亲缘关系。Northern杂交分析显示,在一定盐碱胁迫条件下,随着处理试剂Na₂CO₃溶液浓度的增加,PtGAPDH基因在盐碱胁迫下的叶片和根部表达量都显著升高;超过最大耐受量后,PtGAPDH基因表达丰度逐渐降低。PtGAPDH基因的表达模式代表了星星草在盐碱胁迫下其自身的生理生化变化对分子水平上的基因表达丰度产生的影响趋势。     

紫花苜蓿γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)基因的克隆与逆境下的表达分析

紫花苜蓿是目前全国乃至世界上种植最多的牧草,在畜牧业生产中发挥着重要的作用。γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)是维生素E合成途径中一种重要的合成酶,催化γ-生育酚向α-生育酚的转化,改变维生素E组成,利于动物和人体的吸收。本实验通过RACE-PCR技术,得到紫花苜蓿γ-TMT基因的全长cDNA序列,命名为MsTMT。测序和生物信息学分析表明,此序列全长1 306 bp,包含1个长为939 bp的完整开放阅读框(ORF),编码312个氨基酸。MsTMT属于甲基转移酶家族(AdoMet-MTases),有1个腺苷脱氨基酶信号(SLSTDDP),包含有2个保守的S-腺苷甲硫氨酸结合结构域(XXDXGCGIG,VXXPGGXXIX)。Real-time PCR检测结果表明MsTMT基因在紫花苜蓿各组织中均有表达,叶片中表达量最高。受NaCl、PEG以及黑暗诱导后,该基因表达上调;低温胁迫后该基因表达下降;外源ABA不影响该基因的表达。     

家蚕钙网蛋白的基因结构与初步表达谱研究

钙网蛋白(calreticulin,CRT)是内质网/肌浆网主要的Ca2+结合蛋白,在细胞功能的调节方面发挥重要作用。利用双向电泳技术及质谱技术研究家蚕脂肪体蛋白组的变化,通过分析检索蛋白质组数据,获得了钙结合蛋白的氨基酸序列。通过电子克隆、cDNA3′末端快速扩增(3′rapid amplification of cDNA ends,3′RACE)方法克隆了家蚕钙网蛋白基因cDNA全长序列,命名为BmCRT(GenBank登录号:FJ360528)。BmCRT基因cDNA全长1 705 bp,开放阅读框序列(ORF)长1 197 bp,编码398个氨基酸。氨基酸序列分析显示,BmCRT与其它物种的CRT都具有保守的N-结构域、脯氨酸富集结构域和C-端结构域。BmCRT基因组结构分析表明:该基因由7个外显子和6个内含子组成。分析BmCRTmRNA在不同发育时期的表达变化显示,该基因在家蚕幼虫眠期的mRNA表达量比食桑期高,而在4龄和5龄食桑期mRNA表达量没有随着生长变化而变化。     

无芒隐子草SAMS1基因的克隆及干旱胁迫下的表达分析

以无芒隐子草干旱诱导的cDNA文库中获得的一个与S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因同源性较高的EST序列为基础,采用RT-PCR技术克隆该基因全长序列(命名为CsSAMS1),该序列全长1 399 bp,编码397个氨基酸,具有SAMS基因的典型结构特征。无芒隐子草SAMS1蛋白为亲水性蛋白,无跨膜结构域,其空间结构主要由α-螺旋和无规则卷曲结构构成。与近缘植物SAMS的氨基酸序列多重比较分析表明,不同植物的SAMS的氨基酸相似程度非常高(92%~100%), 其中无芒隐子草与水稻的相似性最高(99%), 说明SAMS基因在植物进化中非常保守。CsSAMS1基因在无芒隐子草幼苗干旱过程中的半定量和实时定量RT-PCR表达模式分析均表明,干旱胁迫诱导该基因在根中大量表达, 叶中表达量变化不明显。CsSAMS1基因受干旱胁迫的诱导表达,为进一步探讨其应用于草类作物抗旱性的遗传改良奠定了基础。     

内蒙古绒山羊 CDK2 基因的克隆与序列分析

采用同源序列克隆技术结合RT-PCR和RACE技术,首次从内蒙古绒山羊睾丸组织中克隆出羊CDK2基因的全长cDNA序列（GenBank登录号为EF035041）。结果显示：羊CDK2基因的cDNA序列长为1355bp,5′端非翻译区为174bp,3′端非翻译区为266bp,开放阅读框为894bp,编码298个氨基酸。与牛CDK2基因cDNA序列同源性为98％,氨基酸序列完全一致;和其他哺乳动物CDK2基因的cDNA序列同源性也达92％以上;氨基酸序列同源性为93％以上。说明CDK2在结构和功能上有很高的保守性。     

镰形扇头蜱组胺结合蛋白全长基因的克隆与分析

从本实验室构建的镰形扇头蜱（Rhipicephalus haemaphysaloides）抑制消减杂交cDNA文库中选择了1条可能编码组胺结合蛋白（HBP）的EST序列（RhHBP）,以5′末端快速扩增的方法（5′RACE）扩增获得5′末端序列,拼接获得全长基因。DNAMAN（v4.0）、DNAstar（v4.0）和Genetyx（v4.0）软件分析阅读框、编码产物、序列同源性和系统进化,同时也分析了该基因在吸血前后雌雄蜱体内的表达情况。5′RACE法获得1条约400 bp的DNA片段,克隆测序,拼接获得1条长803 bp的全长基因,编码219个氨基酸残基。该基因在吸血雌蜱唾液腺内特异表达,初步分析该基因是组胺结合蛋白基因。     

家蚕泛素结合酶新基因的克隆与基因组结构及5′调控区分析

在家蚕丝腺cDNA文库测序过程中,发现一个编码家蚕泛素结合酶的EST序列,利用3′RACE方法克隆了一个新的家蚕泛素结合酶基因cDNA全长序列,命名为BmUCE2 I(GenBank登录号为DQ219874)。家蚕BmUCE2 I基因全长cDNA由465 bp的开放阅读框序列(ORF)、97 bp的5′端非翻译区序列(5-′UTR)和237 bp的3′端非编码区序列(3-′UTR)组成,其编码的154个氨基酸与其他真核生物间具有较高的同源性。利用BmUCE2 I的EST片断作探针,通过筛选家蚕噬菌体基因组文库,获得了家蚕BmUCE2 I基因组序列和5′调控序列。BmUCE2 I基因由4个外显子和3个内含子组成,在5′端上游调控区域没有类似TATA盒元件,但在-219~-268 bp的区域存在一个50bp的启动子序列,此外还存在CF2-Ⅱ、FTZ、DFD、BRCZ2、DL、STAT、PRD-HD等多个转录因子结合位点。家蚕泛素结合酶新基因的克隆、基因结构及5′调控区的分析为进一步研究泛素蛋白水解酶复合通路相关基因的调控规律提供了重要依据。     

家蚕真核翻译起始因子3f基因结构与表达研究

在对家蚕5龄丝腺cDNA文库测序的过程中,发现一个编码家蚕翻译起始因子基因(eIF3f)的EST序列。利用电子克隆、3′RACE(3′rapid amplification of cDNA ends)方法克隆了家蚕eIF3f基因cDNA序列全长,命名为eIF3f(GenBank登录号为DQ868530)。家蚕eIF3f基因cDNA全长为1 009 bp,由870 bp的开放阅读框序列(openreading frame,ORF)、55 bp的5′端非翻译区序列(5′-UTR)和65 bp的3′端非编码区序列(3′-UTR)组成,编码289个氨基酸。氨基酸序列比较分析显示,家蚕eIF3f与其他物种的eIF3f都具有翻译起始功能所必需的JAB_MPN结构域。家蚕eIF3f基因组结构分析:该基因由5个外显子和4个内含子组成;5′调控序列存在E74A、DFD、DRI等多个潜在的转录因子结合位点,但没有TATA盒启动子序列。家蚕eIF3f基因的表达在不同组织和不同发育时期存在差异,eIF3f是一种负调控翻译起始因子。研究结果有助于进一步研究真核翻译起始因子的相关基因调控规律。     

军曹鱼MHC-Ⅱα基因全长cDNA的克隆及其组织表达分析

本研究根据其他鱼类MHC-Ⅱα基因的保守序列设计兼并引物,运用同源克隆和末端快速扩增方法扩增了军曹鱼MHC-Ⅱα基因的全长cDNA序列,并对cDNA及其氨基酸序列进行了分析,比较了军曹鱼和其他物种的MHC-Ⅱα氨基酸序列的差异,分析了军曹鱼MHC-Ⅱα基因的组织分布及经LPS刺激后头肾组织中MHC-Ⅱα基因的表达变化。结果表明,军曹鱼MHC-Ⅱα cDNA全长998 bp,包括53 bp的5′末端非编码区（5′UTR）、234 bp的3′末端非编码区（3′UTR）及711 bp的开放阅读框（ORF）,编码236个氮基酸,其蛋白质分子质量约为25.94 ku,等电点为4.39;军曹鱼MHC-Ⅱα蛋白质序列具有一些重要的特征,包括前导肽、α1、α2、CP/TM/CYT区和保守的半胱氨酸等;军曹鱼MHC-Ⅱα与鼠、人及其它鱼类的氨基酸同源性在25.0%～69.5%之间。Real-time PCR检测结果显示,MHC-Ⅱα基因在正常军曹鱼组织中均有表达,但其表达量在各种组织中存在差异,其中较强表达于头肾、鳃,中等程度表达于脾脏、肠,在心脏、脑、肌肉中表达较弱;经LPS刺激后,头肾中MHC-Ⅱα基因表达下调。     

Cloning of Carp Inducible Nitric Oxide Synthase Full-length cDNA and its Differential Expression Analysis in Peripheral Blood Leukocytes

The study was aimed to obtain carp iNOS cDNA full-length sequence, and investigate the changes in peripheral blood leukocyte expression of iNOS in the stimulation of different mitogens.Based on EST sequences of iNOS that obtained from carp normal peripheral blood leukocytes cDNA library, full-length cDNA sequence of carp iNOS was successfully amplified by using gene library screening and rapid-amplification of cDNA 5'ends (5'-RACE) method.Carp peripheral blood leukocytes were divided into control and experimental groups and cultured.The experimental groups were stimulated by LPS (1.0 μg/mL) and ConA (1.0 μg/mL) for 4 and 12 h, respectively.And control groups were in the same cultured conditon time without mitogen stimulated.Real-time PCR was used to detect the expression of iNOS in peripheral blood leukocytes of each group.The results showed that the cDNA fragment was total 3 704 bp containing 74 bp 5'untranslated region (UTR), 246 bp 3'UTR and a 3 384 bp ORF encoding 1 127 amino acids.Sequence homology analysis showed that the amino acid sequence of carp iNOS shared 100% identity with Carassius auratus.After LPS and ConA stimulation, the iNOS expression of peripheral blood leukocytes in the experimental groups were increased, and the expression in the short time stimulation condition (4 h) was higher than the long time (LPS 12 h; ConA 24 h).In conclusion, iNOS expression of peripheral blood leukocytes was raised after LPS and ConA stimulation, suggesting that there were dynamic changes in the inflammation.     

鲤鱼诱导型一氧化氮合成酶全长cDNA克隆及其在外周血白细胞中的差异表达分析

试验旨在获得鲤鱼诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)cDNA全长序列,并以此为基础探讨在丝裂原刺激下外周血白细胞中iNOS的表达变化。以从鲤鱼正常外周血白细胞cDNA文库中获得的iNOS的EST序列为基础,采用基因文库筛选和cDNA5'末端快速扩增技术(5'-RACE)相结合的方法,成功扩增出鲤鱼iNOScDNA全长序列,然后进行鲤鱼外周血白细胞原代培养,分成对照组和试验组,其中试验组分别为脂多糖(LPS,1.0μg/mL)刺激4、12h,刀豆蛋白A(ConA,1.0μg/mL)刺激4、24h,对照组为相同培养时间无丝裂原刺激的外周血白细胞,根据得到的iNOScDNA全长序列和鲤鱼β-actin序列分别设计特异性引物,应用实时荧光定量PCR方法检测各组外周血白细胞中iNOS在mRNA水平上的表达情况并进行分析。序列分析结果显示,最后获得的cDNA片段共3704bp,包含74bp的5'端非编码区,246bp的3'端非编码区,一个3384bp的完整的开放阅读框(ORF),共编码1127个氨基酸。序列同源性分析结果显示,该序列与鲫鱼iNOS基因同源性高达100%;实时荧光定量PCR结果显示,经LPS、ConA刺激的试验组外周血白细胞中iNOS表达量均升高,且短时间(4h)刺激的表达量高于长时间(LPS12h;ConA24h)刺激的表达量。综上所述,在LPS、ConA刺激过程中,iNOS在外周血白细胞中表达量均有上调,结果提示存在炎症反应的动态变化。     

柞蚕蛹全长cDNA文库的构建和随机EST测序

采用RNA转录5′末端转换(SMART)技术构建了柞蚕(Antheraea pernyi)蛹的全长cDNA文库。所构建cDNA文库的容量为5×105个独立克隆,插入片段长800~2500 bp,且90%的插入片段大于1 kb。随机挑取288个克隆进行表达序列标签(EST)测序,有效序列为250条,根据EST测序结果计算文库重组率达95%。经序列拼接得到175个unigenes,通过序列比对发现其中97个unigenes与GenBank中的已知基因高度同源,且有88条全长序列,基因的完整性比率达90%。在随机EST测序中获得了具有5′端和3′端非编码区的延伸因子-1α基因(Gen-Bank登录号:FJ788508),该基因cDNA全长1743 bp,有一个1392 bp的开放阅读框,编码含463个氨基酸残基的蛋白,蛋白的理论分子质量为50.4 kD,等电点8.96。EST测序分析表明,柞蚕蛹cDNA文库符合构建基因文库的质量要求,该文库的构建将有助于柞蚕功能基因的克隆和研究。     

家蚕质型多角体病毒感染应答的假定蛋白基因全长cDNA克隆与表达特征分析

在感染家蚕质型多角体病毒(BmCPV)的家蚕中肠组织中发现一个差异表达的假定蛋白基因。利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了该假定蛋白基因的全长cDNA。用生物信息学方法进行基因序列与结构分析表明:该基因全长cDNA序列为486bp,包含108bp的5′端非翻译区序列(5′-UTR)和153bp的3′端非翻译区序列(3′-UTR),开放阅读框(ORF)为225bp,编码74个氨基酸,蛋白分子质量为6.888kD,等电点为5.27;该基因由3个外显子和2个内含子组成,ORF位于第2外显子内,编码蛋白含二次跨膜结构,多肽链表现为疏水性,在多肽链上的第15～16氨基酸残基可能是信号肽的切割位点。RT-PCR结果显示该基因在家蚕5龄幼虫的丝腺、血液、脂肪体、生殖腺及中肠组织中均有表达;荧光定量PCR结果表明该基因在感染Bm-CPV的家蚕中肠组织中的表达水平为正常家蚕中肠组织的6.28倍。研究结果为进一步解析该基因的功能奠定了基础。     

具有还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶功能的家蚕l(3)neo18基因的克隆与表达特征

果蝇l(3)neo18基因可以通过P转座子诱发致死突变,编码的蛋白质具有还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶(ND)的功能。利用生物信息学、cDNA末端快速扩增(RACE)和反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等方法,克隆了家蚕l(3)neo18同源基因,分析了基因结构与表达谱。Bm-l(3)neo18基因(EU826676)的cDNA全长为868 bp,由573 bp的完整开放读码框(ORF)序列、25 bp的5′端非翻译区序列(5′-UTR)和251 bp的3′端非编码区序列(3′-UTR)组成,编码蛋白质为190个氨基酸残基,分子质量22.7 kD,pI 9.60。Bm-l(3)neo18基因由3个外显子和2个内含子组成,定位于家蚕第3染色体,位于nscaf2930的1 203.8-1 205.6 knt。Bm-l(3)neo18蛋白质在1-185氨基酸残基位置为ND的SGDH亚基保守区,在61-83氨基酸残基位置具有一个保守的跨膜区域。采用Clustal W进行多序列比对发现,Bm-l(3)neo18与埃及伊蚊等昆虫ND具有50%以上的蛋白质同源性,ND的保守区域高度一致,NJ法分子进化分析也显示Bm-l(3)neo18与昆虫ND进化上同源。该基因除在家蚕卵期的表达量较低外,在幼虫、蛹和蛾期均有较高表达,且存在组织差异性。