梅山猪前体脂肪细胞的分离培养及分化相关基因的表达规律研究

本试验旨在建立梅山猪前体脂肪细胞的体外培养体系,从细胞和分子水平探索梅山猪脂肪组织增生的生物学特征。采集3日龄梅山猪仔猪颈、背部皮下脂肪组织,采用Ⅰ型胶原酶分离前体脂肪细胞,进行前体脂肪细胞的原代和传代培养,并对其进行形态学观察、生长曲线测定、油红O染色鉴定及脂肪含量的测定,且采用实时荧光定量RT-PCR的方法检测脂肪细胞分化关键基因PPARγ、CEBPα、LPL、DLK1、FABP4及ADIPOQ mRNA在梅山猪前体脂肪细胞分化过程中的表达。结果表明:分离的梅山猪原代前体脂肪细胞约6 h开始贴壁,贴壁的细胞呈小梭形或不规则的三角形,经传代后成分均一,贴壁良好,呈成纤维细胞样形态,第1~9天细胞进入指数生长期,细胞生长曲线近似S形;诱导培养第11天细胞充脂率高,油红O染色呈红色,细胞内脂肪含量显著高于未诱导组,具有前体脂肪细胞的典型特征;PPARγ在猪前体脂肪细胞分化早期就有表达,分化第3天高度表达,CEBPα和LPL随着分化过程表达量逐渐增加,而DLK1表达量逐渐下降,FABP4和ADIPOQ在第6天高度表达。综上,本研究成功建立了梅山猪前脂肪细胞的培养方法和诱导分化方法,为进一步研究梅山猪体脂沉积和改善肉品质奠定基础。     

猪肌源性前体脂肪细胞的分离培养和成脂诱导分化研究

本研究旨在建立猪肌源性前体脂肪细胞的体外培养体系,并探究成脂诱导分化过程中相关基因的表达,为进一步研究调控猪肌内脂肪沉积的分子机制提供试验材料。采集15日龄仔猪的背最长肌组织,使用Ⅱ型胶原酶进行消化,分离获得前体脂肪细胞,进行原代、传代培养以及成脂诱导,观察细胞形态、测定生长曲线、油红O染色鉴定以及检测成脂关键基因PPARγ、FABP4、C/EBPα、C/EBPβ、ZFP423、SREBP1、PRDM16和HSL在诱导分化过程中的表达量。结果表明,分离的猪肌源性前体脂肪细胞在6～7 h,发现少量细胞开始贴壁,贴壁的细胞呈似圆型、小梭型以及其它不规则形状,经传代后细胞形态均一,呈典型的成纤维细胞样,细胞的生长曲线呈S型。添加分化培养基进行诱导后,所有基因在细胞分化的早期均有表达,FABP4、C/EBPα、SREBP1与PPARγ基因在分化早期表达量极显著升高(P 0. 01),在后期表达量极显著下降(P 0. 01),C/EBPβ、ZFP423和PRMD16基因的表达量在分化过程中未见显著变化,HSL的表达量随着分化进行极显著降低(P 0. 01)。在诱导分化12 d左右,油红O染色呈现红色。综上表明,本研究成功建立了猪肌源性前体脂肪细胞的分离与培养体系,进行成脂诱导分化,揭示分化过程中关键基因的表达规律,为进一步研究猪肌内脂肪沉积的分子机制和改善肉质品质奠定基础。     

从江香猪肌内前体脂肪细胞分化过程中相关基因的表达研究

试验旨在探讨从江香猪肌内前体脂肪细胞分化过程中相关基因的表达。采集3日龄从江香猪背最长肌,采用Ⅱ型胶原酶消化法分离肌内前体脂肪细胞,进行原代和传代培养,并对其进行形态学观察。诱导培养后,利用油红O染色法对其进行鉴定。采用实时荧光定量PCR方法检测细胞诱导分化0、24、48、72和144h时脂肪相关基因丙酮酸脱氢酶激4(PDK4)、成纤维细胞生长因子10(FGF10)、脂联素(ADIPOQ)、脂肪酸合成酶(FAS)、脂蛋白脂酶(LPL)、CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)、脂肪细胞脂肪酸结合蛋白4(FABP4)、蛋白激酶B(AKT2)的表达,选择诱导0h作为对照组。结果显示,分离的肌内前体脂肪细胞5h开始贴壁,贴壁的细胞呈圆形,胞体透明,经传代后,细胞形态均一,经诱导培养后,油红染色呈红色。实时荧光定量PCR结果显示,PDK4、ADIPOQ、C/EBPα、FAS、FABP4和AKT2基因mRNA表达水平在诱导48h时均呈现较高表达,极显著高于其余各阶段(P0.01);FGF10基因mRNA表达水平在诱导24和48h时均较高;LPL基因mRNA表达水平在诱导72h时极显著高于对照组(P0.01),之后明显下降;PDK4、ADIPOQ和FGF10基因mRNA表达水平在诱导144h时均极显著低于对照组(P0.01);C/EBPα基因mRNA表达水平在诱导144h时显著高于对照组(P0.05);FAS基因mRNA表达水平在诱导144h时显著低于对照组(P0.05);AKT2和LPL基因mRNA表达水平在诱导144h时与对照组差异不显著(P0.05)。本试验成功培养了从江香猪肌内前体脂肪细胞,并检测了不同诱导阶段脂肪相关基因的表达情况,为进一步研究从江香猪脂肪代谢和沉积提供参考依据。     

新西兰兔肌内和皮下前体脂肪细胞原代培养与诱导分化的研究

为建立新西兰兔前体脂肪细胞的体外培养模型,比较新西兰兔肌内和皮下前体脂肪细胞分化过程中相关基因的差异表达,实验采集 1 日龄新西兰兔背最长肌和皮下脂肪组织,采用胶原酶消化方法,分别从 2 种组织中分离前体脂肪细胞,进行细胞原代培养,绘制细胞生长曲线,并对肌内和皮下前体脂肪细胞诱导分化,利用 RT-PCR 检测相关基因的表达变化。结果表明:细胞在分离后 2 h 已经贴壁,24 h 时呈现出短梭形的细胞形态,第 2 天细胞变成长梭形,第 3 天进入对数生长期。肌内和皮下前体脂肪细胞在诱导分化后均被油红O 染色,皮下前体脂肪细胞的脂质积累在诱导分化的第 2 天显著高于肌内前体脂肪细胞(P<0.05);荧光定量结果表明,肌内和皮下前体脂肪细胞 CCAAT 增强子结合蛋白(C/EBPα)基因的表达趋势在诱导分化过程中相同,肌内前体脂肪细胞过氧化物酶体增殖激活受体(PPARγ)第 4 天的表达量显著高于第 6 天,而皮下前体脂肪细胞 PPARγ表达量差异不显著;肌内前体脂肪细胞脂蛋白脂肪酶(LPL)表达量在第 0天和第 2天差异不显著,而皮下前体脂肪细胞第 2 天显著高于第 0 天(P<0.05);肌内前体脂肪细胞脂肪酸合酶(FAS)基因第 0、2、4 天的表达量差异不显著,而皮下前体脂肪细胞第 2、4 天显著高于第 0 天(P<0.05)。本研究成功构建了新西兰兔肌内和皮下前体脂肪细胞的体外培养和诱导分化模型,并发现皮下前体脂肪细胞分化早于肌内前体脂肪细胞,为进一步研究新西兰兔前体脂肪细胞的分化机制和脂肪沉积奠定基础。     

牛PPARγ基因对脂肪细胞增殖分化的影响

取郏县红牛第6和第7肋骨间肌间脂肪组织为试验材料,分离并培养原代前体脂肪细胞。在诱导分化牛前体脂肪细胞过程中,添加终浓度为1μmol/L的吡格列酮对脂肪细胞进行药物干预,上调过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferations actirated receptorγ,PPARγ)基因的表达后,通过MTT检测牛前体脂肪的增殖;油红O提取比色法检测牛前体脂肪细胞分化过程中脂滴的分泌;利用real-time PCR技术检测PPARγ基因表达上调后其他参与脂肪分化相关基因的表达情况。结果显示:吡格列酮药物干预后,PPARγ基因表达明显上调(P0.01);PPARγ基因的表达上调后,牛脂肪细胞的增殖能力下降,分化能力增强;脂肪分化相关基因C/EBPA、SREBP11、FABPA、PLIN1、LPL和IGFBP2的表达量明显上调(P0.05),GATA2和FAS基因的表达量没有发生明显变化。结果表明:PPARγ基因的表达可显著影响脂肪细胞的增殖与分化,可能与肉牛脂肪沉积有一定的关系。     

从江香猪肌内前体脂肪细胞分化过程中相关基因的表达研究

试验旨在探讨从江香猪肌内前体脂肪细胞分化过程中相关基因的表达。采集3日龄从江香猪背最长肌,采用Ⅱ型胶原酶消化法分离肌内前体脂肪细胞,进行原代和传代培养,并对其进行形态学观察。诱导培养后,利用油红O染色法对其进行鉴定。采用实时荧光定量PCR方法检测细胞诱导分化0、24、48、72和144 h时脂肪相关基因丙酮酸脱氢酶激4（PDK4）、成纤维细胞生长因子10（FGF10）、脂联素（ADIPOQ）、脂肪酸合成酶（FAS）、脂蛋白脂酶（LPL）、CCAAT增强子结合蛋白α（C/EBPα）、脂肪细胞脂肪酸结合蛋白4（FABP4）、蛋白激酶B（AKT2）的表达,选择诱导0 h作为对照组。结果显示,分离的肌内前体脂肪细胞5 h开始贴壁,贴壁的细胞呈圆形,胞体透明,经传代后,细胞形态均一,经诱导培养后,油红染色呈红色。实时荧光定量PCR结果显示,PDK4、ADIPOQ、C/EBPα、FAS、FABP4和AKT2基因mRNA表达水平在诱导48 h时均呈现较高表达,极显著高于其余各阶段（P<0.01）;FGF10基因mRNA表达水平在诱导24和48 h时均较高;LPL基因mRNA表达水平在诱导72 h时极显著高于对照组（P<0.01）,之后明显下降;PDK4、ADIPOQ和FGF10基因mRNA表达水平在诱导144 h时均极显著低于对照组（P<0.01）;C/EBPα基因mRNA表达水平在诱导144 h时显著高于对照组（P<0.05）;FAS基因mRNA表达水平在诱导144 h时显著低于对照组（P<0.05）;AKT2和LPL基因mRNA表达水平在诱导144 h时与对照组差异不显著（P>0.05）。本试验成功培养了从江香猪肌内前体脂肪细胞,并检测了不同诱导阶段脂肪相关基因的表达情况,为进一步研究从江香猪脂肪代谢和沉积提供参考依据。     

小尾寒羊前体脂肪细胞分化过程相关基因表达规律的研究

为了探究小尾寒羊脂肪细胞分化过程中相关基因的变化规律,试验采集2月龄小尾寒羊腹股沟白色脂肪组织,通过酶消化法体外分离小尾寒羊前体脂肪细胞。培养前体脂肪细胞布满细胞板后,分别用诱导Ⅰ液、诱导Ⅱ液对细胞进行诱导分化,使其成为成熟的脂肪细胞。利用油红O染色法验证成熟脂肪细胞并检测脂滴含量。分别在增殖期细胞增殖70%、90%及分化期诱导Ⅰ液处理48 h、诱导Ⅱ液处理48 h、完全培养液处理48 h时(2、4、6、8、10 d)提取细胞总RNA,反转录成cDNA。采用实时荧光定量PCR检测PPARγ、C/EBPα、LPL、SREBP1、KLF5、KLF6、FABP4、STAT5、ACSS2、IGF1、ADD1、FOXO1、ACACA、DGAT1、CPT1A基因的表达规律。结果表明,试验成功分离并诱导前体脂肪细胞变为成熟的脂肪细胞,细胞内部具有明显脂滴;实时荧光定量PCR结果表明,上述基因在细胞分化阶段具有明显波动,峰值出现的时间均不相同;C/EBPα、FOXO1基因表达峰值出现在第6天,可能在细胞分化早期发挥作用;PPARγ、LPL、SREBP1、KLF5、KLF6、FABP4、STAT5、ADD1、ACSS2基因表达峰值出现在第8天,但表达倍数与趋势均不相同;ACACA基因表达量出现上下波动;IGF1、DGAT1基因表达峰值出现在第10天;CPT1A基因表达量则一直下降;FABP4基因表达倍数显著高于其他基因。本研究全面检测了小尾寒羊前体脂肪细胞在分化过程中关键基因的表达规律,可为探究小尾寒羊脂肪分化过程分子机制、挖掘参与脂肪分化新的关键基因、提高小尾寒羊肌间脂肪含量等研究提供一定的理论参考。     

莱芜猪前体脂肪细胞的原代培养及诱导分化研究

为了建立莱芜猪前体脂肪细胞的体外培养体系,探索猪脂肪组织增生的生物学特征。本研究采集1日龄莱芜猪仔猪颈、背部皮下脂肪组织,采用胶原酶与胰蛋白酶相结合的方法,分离原代前体脂肪细胞,进行前体脂肪细胞的原代和传代培养,以及前体脂肪细胞诱导分化的研究,并采用Real-time PCR方法检测前体脂肪细胞分化过程中关键基因PPARγ的表达。结果表明,分离的猪原代前体脂肪细胞约8h后开始贴壁,贴壁的细胞呈短梭形或不规则的三角形,第3天多数细胞进入指数生长期,呈成纤维细胞样形态,细胞生长曲线近似S形;诱导培养结果显示,少量细胞在第2天开始出现脂滴,大多数细胞在第3天出现脂滴,第7～8天小脂滴逐渐融合成大脂滴,在第12天左右融合成大脂滴,油红O染色呈橘红色。在前体脂肪细胞分化过程中PPARγ基因mRNA的表达量逐渐增加,在诱导后的48h表达量最高,随后其表达丰度逐渐下降。本试验成功建立了莱芜猪前体脂肪细胞培养体系和体外诱导分化模型,为进一步研究莱芜猪前体脂肪细胞增殖与分化机制和猪体脂肪的沉积奠定基础。     

Wnt10b对山羊前体脂肪细胞分化相关基因表达的影响

旨在利用RNA干扰技术,明确Wnt10b基因对山羊前体脂肪细胞分化的影响。设计合成山羊Wnt10b siRNA序列,利用胶原酶消化法获得山羊皮下和肌内前体脂肪细胞。利用有效的siRNA序列干扰山羊皮下和肌内前体脂肪细胞Wnt10b基因表达后,检测其对细胞分化及脂肪细胞分化标志基因表达的影响。结果表明,筛选获得有效的山羊Wnt10bsiRNA序列,转染山羊皮下和肌内前体脂肪细胞后,Wnt10b被显著干扰,其mRNA表达量分别下调63%(P0.01)和67%(P0.01);油红O染色结果显示,干扰Wnt10b基因可明显抑制山羊皮下和肌内脂肪细胞的脂滴积聚;且干扰Wnt10b基因后,在皮下前体脂肪细胞分化过程中C/EBPβ、PPARγ、SREBP1和Pref1基因出现极显著下调(P0.01),LPL出现显著下调(P0.05);而在肌内前体脂肪细胞分化过程中,AP2和LPL基因出现极显著下调(P0.01),C/EBPβ出现显著下调(P0.05),Pref1出现极显著上调(P0.01)。本试验发现,Wnt10b基因可能通过调控C/EBPβ、PPARγ、SREBP1和LPL的表达来促进山羊皮下前体脂肪细胞分化,通过调控AP2、LPL、C/EBPβ和Pref1的表达来促进山羊肌内前体脂肪细胞分化。     

小窝蛋白-1在猪前体脂肪细胞分化中的作用及其机理

以体外培养1日龄猪皮下前体脂肪细胞为研究对象,通过脂质体LipofectamineTM2000介导小窝蛋白-1（Caveolin-1,CAV1）过表达载体pEGFP-N1-CAV1及CAV1的干扰片段siRNA-CAV1分别转染猪皮下前体脂肪细胞,采用RT-PCR定量分析转染后24、48、72、96h的CAV1mRNA表达量以及转染后72h脂肪细胞分化相关基因的mRNA表达量;其后又进行了CAV1过表达或干扰且诱导分化后甘油三脂含量以及脂肪细胞分化相关基因的mRNA表达量测定。结果显示,过表达CAV1基因上调前体脂肪细胞分化相关基因PPARγ、C/EBPβ、AP2、GPDH的表达量,干扰CAV1基因下调C/EBPβ、PPARγ、AP2、LPL、VLDLR的表达量;诱导分化后干扰组C/EBPβ、LPL、VLDLR的表达量仍显著降低,而甘油三脂含量检测结果说明过表达CAV1基因能促进脂肪细胞分化,提示CAV1可能通过C/EBPβ、LPL、VLDLR等基因影响猪前体脂肪细胞分化。     

猪甘油三酯水解酶和激素敏感脂酶基因表达规律的研究

利用半定量RT-PCR法分析比较了甘油三酯水解酶(Triacylglycerol hydrolase,TGH)和激素敏感脂酶(Hormone-sensitive lipase,HSL)基因在不同猪种、不同发育阶段及不同部位脂肪组织中转录表达的差异,探讨其在猪脂肪组织的表达规律。结果显示,脂肪型个体TGHmRNA表达丰度显著低于瘦肉型和杂交型个体,成年猪较初生仔猪低,皮下、腹膜和内脏脂肪组织中TGH表达量依次递增;其变化规律与HSL相同。此外,对分离培养的原代前体脂肪细胞通过诱导分化和油红O染色区分分化状态,分析TGHmRNA表达的时序变化,发现TGH在前脂肪细胞中不转录表达,诱导分化后开始表达,且在诱导分化第4天表达量最高,分化第10天表达量下降,达到峰值的时间较HSL早。结果表明,TGH的表达与个体肥胖程度、年龄、脂肪组织部位以及脂肪细胞分化程度相关,同时,在脂肪细胞分化过程中,TGH表达峰值早于HSL,提示TGH在脂肪细胞发育过程中可能较早承担基础脂解作用。     

AMPK调控绵羊肌内前体脂肪细胞分化的研究

旨在研究AMPK在羔羊肌内前体脂肪细胞分化中的作用及机制。本研究采集3日龄羔羊背最长肌,采用差速贴壁法分离肌束膜中原代细胞。改变AMPK与Wnt信号通路的活性并诱导细胞成脂分化,采用qRT-PCR和Western blot方法检测脂肪细胞分化关键基因及蛋白的表达,应用油红O染色观察成熟脂肪细胞的油滴情况。结果表明,AMPK激活明显减少了油红的着色,极显著抑制了PPARγ、C/EBPα和aP2成脂关键基因的mRNA表达及降低了对应的蛋白含量(P0.01),而抑制AMPK活性则表现出相反的结果。激活Wnt信号通路活性抑制了肌内前体脂肪细胞的分化,极显著降低PPARγ(P0.01)和C/EBPα(P0.01)mRNA表达,显著减少aP2的mRNA表达(P0.05),极显著降低了对应蛋白的含量(P0.01),而抑制Wnt信号通路活性则促进了细胞的成脂分化。AMPK的活性变化未影响β-catenin的转录,但极显著改变了β-catenin的蛋白表达水平(P0.01)。进一步研究表明,AMPK活化后极显著增加了GSK3β的磷酸化水平(P0.01),降低了其活性。结果显示,AMPK通过改变GSK3β的磷酸化水平影响胞内β-catenin稳定性,进而影响羔羊肌内前体脂肪细胞的成脂分化。     

miR-130b靶向PPARγ抑制家兔前体脂肪细胞分化

旨在探究miR-130b是否可通过靶向PPARγ抑制家兔前体脂肪细胞的分化。采集初生新西兰仔兔肾周脂肪细胞进行原代培养,鸡尾酒法诱导分化后,用RT-qPCR分别测定前体脂肪细胞分化第0、第2、第6、第10天miR-130b表达量及PPARγ(Peroxisome Proliferators-Activated Receptorγ,PPARγ)和C/EBPα(CCAAT/enhancer binding proteinα,C/EBPα)mRNA的表达量,生物信息学软件鉴定miR-130b的同源性,预测miR-130b的靶基因;前体脂肪细胞转染miR-130bmimic和miR-130binhibitor后,检测miR-130b、PPARγ和C/EBPα的表达差异,用油红O染色鉴定前体脂肪细胞分化程度。结果表明:1)在前体脂肪细胞分化过程中,miR-130b、PPARγ和C/EBPα表达量存在差异;分化第8天时,油红染色发现大量橘红色脂滴;生物信息学软件预测PPARγ可作为miR-130b的靶基因,且miR-130b在哺乳动物中具有较高的同源性。2)过表达miR-130b后,mimic组PPARγ和C/EBPα的表达量极显著低于NC组(P0.01)。3)抑制表达miR-130b后,inhibitor组PPARγ的表达量极显著高于inhibitor NC组(P0.01),inhibitor组C/EBPα表达量显著高于inhibitor NC组(P0.05)。4)油红O染色显示分化程度:inhibitor组NC组mimic组。综上所述,miR-130b在家兔前体脂肪细胞分化过程中差异表达,且可通过靶向PPARγ抑制前体脂肪细胞分化。     

小尾寒羊前体脂肪细胞分化过程相关基因表达规律的研究

为了探究小尾寒羊脂肪细胞分化过程中相关基因的变化规律,试验采集2月龄小尾寒羊腹股沟白色脂肪组织,通过酶消化法体外分离小尾寒羊前体脂肪细胞。培养前体脂肪细胞布满细胞板后,分别用诱导Ⅰ液、诱导Ⅱ液对细胞进行诱导分化,使其成为成熟的脂肪细胞。利用油红O染色法验证成熟脂肪细胞并检测脂滴含量。分别在增殖期细胞增殖70%、90%及分化期诱导Ⅰ液处理48 h、诱导Ⅱ液处理48 h、完全培养液处理48 h时（2、4、6、8、10 d）提取细胞总RNA,反转录成cDNA。采用实时荧光定量PCR检测PPARγ、C/EBPα、LPL、SREBP1、KLF5、KLF6、FABP4、STAT5、ACSS2、IGF1、ADD1、FOXO1、ACACA、DGAT1、CPT1A基因的表达规律。结果表明,试验成功分离并诱导前体脂肪细胞变为成熟的脂肪细胞,细胞内部具有明显脂滴;实时荧光定量PCR结果表明,上述基因在细胞分化阶段具有明显波动,峰值出现的时间均不相同;C/EBPα、FOXO1基因表达峰值出现在第6天,可能在细胞分化早期发挥作用;PPARγ、LPL、SREBP1、KLF5、KLF6、FABP4、STAT5、ADD1、ACSS2基因表达峰值出现在第8天,但表达倍数与趋势均不相同;ACACA基因表达量出现上下波动;IGF1、DGAT1基因表达峰值出现在第10天;CPT1A基因表达量则一直下降;FABP4基因表达倍数显著高于其他基因。本研究全面检测了小尾寒羊前体脂肪细胞在分化过程中关键基因的表达规律,可为探究小尾寒羊脂肪分化过程分子机制、挖掘参与脂肪分化新的关键基因、提高小尾寒羊肌间脂肪含量等研究提供一定的理论参考。     

共培养体系中猪骨骼肌卫星细胞对肌内前体脂肪细胞脂质沉积的影响

本试验旨在研究共培养体系中猪骨骼肌卫星细胞对肌内前体脂肪细胞脂质沉积的影响。试验分离培养了猪骨骼肌卫星细胞和肌内前体脂肪细胞,2种细胞分离培养鉴定后,接种于Transwell细胞小室共培养板进行共培养,待细胞密度达到90%以上分别进行诱导分化。骨骼肌卫星细胞诱导分化8 d后,检测肌内前体脂肪细胞分化水平、分化标志基因的表达以及脂质代谢关键酶的表达。结果显示:与肌内前体脂肪细胞单独培养相比,共培养体系内肌内前体脂肪细胞的脂滴数量和脂滴面积极显著减少(P0.01),肌内前体脂肪细胞增殖分化转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ和CCAAT增强子结合蛋白的基因和蛋白表达水平极显著下降(P0.01),肌内前体脂肪细胞的乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合成酶的基因和蛋白表达水平极显著下降(P0.01)。由此可见,共培养体系中猪骨骼肌卫星细胞对肌内前体脂肪细胞脂质沉积具有抑制作用。     

ADIG诱导牛成肌细胞转分化及相关基因的表达分析

旨在通过在牛成肌细胞中过表达ADIG基因,诱导成肌细胞向成脂转分化,探讨该牛脂肪分化转录因子ADIG基因在脂类代谢过程中的功能,为阐明牛脂肪细胞分化转录因子ADIG基因在牛脂肪组织生长发育过程中发挥的作用提供证据。本研究用AD-ADIG腺病毒原液诱导转分化初生荷斯坦牛的成肌细胞,并在诱导分化后第2、4、6、8、10、12、14天进行油红O染色观察诱导成脂情况,同时收集细胞提取总RNA,利用实时荧光定量PCR分别检测ADIG、PPARγ、C/EBPα、SREBPF1、FABP4、FAS、MyoD基因的表达量变化。实时荧光定量PCR检测结果表明,ADIG基因在第2、4、6、8、10、12、14天均有高水平表达,且随着诱导天数增加脂滴明显增多。成脂相关的基因PPARγ、SREBPF1和FAS在后期AD-ADIG组中表达量均高于空白组,成肌相关的基因MyoD相对表达量在初期就显著下降,且AD-ADIG组明显低于对照组。综合脂滴染色和相关基因表达量方面的研究结果,说明ADIG基因在诱导牛成肌细胞分化向成脂转分化过程中发挥着重要作用,而且牛成肌细胞有向脂肪细胞分化的倾向。     

腺病毒载体介导Smad3基因在秦川牛前体脂肪细胞中的过表达和沉默

旨在通过在秦川牛前体脂肪细胞中过表达和沉默Smad3基因,探讨其在秦川牛前体脂肪细胞分化过程中的生物学功能,从而为阐明TGF-β信号通路在牛脂肪组织生长发育过程中发挥的作用提供理论依据。本试验采用Ad5腺病毒改建的AdMaxTM重组腺病毒包装系统成功重组获得了过表达腺病毒pDC316-EGFP-bSMAD3和干扰腺病毒pDC316-EGFP-ShRNA-bSMAD3-1405。感染牛前体脂肪细胞后,利用实时荧光定量检测Smad3基因及脂肪形成相关基因mRNA的表达。结果表明,将获得的具有较高滴度的过表达腺病毒pDC316-EGFP-bSMAD3感染秦川牛前体脂肪细胞3、6、9d后,分别较对照组Smad3基因表达量显著上调了1 031、1 286、633倍(P0.001)。与对照组相比,高滴度干扰腺病毒pDC316-EGFP-ShRNA-bSMAD3-1405感染牛前体脂肪细胞3、6、9d后,Smad3基因的表达量分别下调了70%、55%、57%(P0.01)。油红O染色和实时荧光定量结果均证明,Smad3基因抑制了前体脂肪细胞脂质积累并促使标志基因PPARγ、FABP4、C/EBPα和C/EBPβ的表达显著下调。综上所述,腺病毒载体介导体外表达载体可以成功的实现Smad3基因在秦川牛前体脂肪细胞中的过表达和沉默,并对秦川牛前体脂肪细胞的成脂分化具有一定的调控作用。     

TNF-α对猪脂肪细胞脂肪分解及其相关基因转录表达的影响

为探讨TNF-α对猪脂肪细胞脂肪分解的调控作用及其机制,用1、10、100 ng·m-1种剂量TNF-α作用体外培养的猪原代脂肪细胞24 h,及10 ng·mL-1TNF-α处理脂肪细胞1、6、12、24、48 h.使用甘油试剂盒,检测细胞甘油的释放量,RT-PCR检测ATGL、TGH-2、HSL、LPL、MGL和perilipinA表达量变化.结果表明,TNF-α以浓度和时间依赖性的方式促进猪原代脂肪细胞甘油的释放(P<0.05);同时下调ATGL、TGH-2、HSL、LPL、MGL和perilipin A mRNA表达量.说明:TNF-α主要通过下调perilipin A的表达,降低其对脂滴的保护作用,增加脂肪分解酶和脂滴的接触,促进了猪脂肪细胞的脂解作用.     

血清对猪前脂肪细胞分化过程中聚脂相关基因表达的影响

为了探讨血清对猪前脂肪细胞诱导分化的影响,筛选更优的诱导方法.采用胶原酶消化法分离猪皮下前脂肪细胞,用含50 nmol·L~(-1)胰岛素、100 nmol·L~(-1)地塞米松、0.25 mmol·L~(-1)3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、100nmol·L~1罗格列酮及添加(对照组)或不添加(试验组)10%FBS的分化培养液1和2对前脂肪细胞进行诱导分化,借助实时定量RT-PCR方法检测了细胞分化过程中聚脂相关基因PPARα、C/EBPα、FASN、ACOX1、GPAT和ENPP2的表达模式.结果显示:血清对PPARγ和FABP4两基因的表达有极显著的上调作用(P<＜0.01),而对其他6个基因的表达有极显著的下调作用(P＜0.01).试验组中FASN、GPAT和ACOX13个基因诱导分化各时间点的综合表达景均极显著高于对照组(P＜0.01),3基因表达量变化趋势间均达到极显著相关(P＜0.01).试验组中PPARα、PPARγ、C/EBPα和ACOX1 4个基因的基因表达最变化趋势间均达到显著或极显著正相关.研究表明:前脂肪细胞分化过程中,细胞内脂肪酸的生物合成和β氧化均在发生,细胞内脂肪含量积聚的快慢取决于2个途径力量的对比;PPARα、PPARγ、C/EBPα和ACOX14个基因间存在极强的协同表达现象;在细胞内脂肪积聚快慢上,含血清的分化培养液1要优于不含血清的分化培养液2.     

过表达FGF10促进山羊皮下前体脂肪细胞分化

本研究在构建山羊FGF10过表达腺病毒载体的基础上,阐明过表达FGF10基因对山羊皮下前体脂肪细胞分化的影响及可能的作用机制。本试验利用胶原酶消化法分离获得山羊皮下前体脂肪细胞,采用AdEasy腺病毒包装系统成功构建过表达腺病毒pAdTrack-CMV-FGF10,并感染细胞。采用油红O染色方法从形态学上观察FGF10对成脂分化的影响;利用qPCR技术检测脂肪细胞分化标志基因、脂代谢相关基因、成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptors,FGFRs)和Kruppel样因子家族(Kruppel like factors,KLFs)mRNA的相对表达变化。结果显示,在过表达FGF10后的第2天,皮下脂肪细胞中脂滴聚集显著多于对照组,C/EBPα、LPL、ACACA、FGFR1和FGFR3的相对表达水平极显著上调(P0.01),FASN和ATGL的相对表达水平分别出现显著上调(P0.05)和显著下调(P0.05),同时,过表达FGF10显著上调KLF家族成员KLF8-10、16和17基因mRNA相对表达水平(P0.05),显著下调KLF1、2、4和15基因的相对表达水平(P0.05)。结果表明,过表达FGF10基因可能通过调控C/EBPα、LPL、FASN、ACACA、ATGL和KLFs部分成员的表达促进山羊皮下前体脂肪细胞的分化及脂滴聚集,结果为进一步阐明其调控山羊不同部位脂肪沉积的分子机理提供重要的数据支撑。