中国犬吉氏巴贝斯虫ssrRNA的序列测定及其在PCR诊断上的应用

用特异引物ＢＧ－１和ＢＧ－２从南京株吉氏巴贝斯虫ｃＤＮＡ文库中克隆出ｓｓｒＲＮＡ序列，测定了该序列的核苷酸组成。通过基因库同源性查询表明，该序列与美洲株吉氏巴贝斯虫ｓｓｒＲＮＡ具有８７％的同源性。本实验通过优化ＢＧ－１和ＢＧ－２引物对ｓｓｒＲＮＡ基因的扩增反应条件，建立了对吉氏巴斯虫的特异、敏感的诊断方法。该方法可广泛用于其他血液原虫的ＰＣＲ诊断。     

三氮脒药物治疗对吉氏巴贝斯虫线粒体Cyt b基因的影响调查

旨在检测患病犬经三氮脒治疗后,吉氏巴贝斯虫线粒体细胞色素b(Cyt b)是否存在基因突变。调查了2010至2020年犬巴贝斯虫病的流行情况,收集了11份自然感染吉氏巴贝斯虫且接受三氮脒治疗的患犬血液样品,采用蛋白酶K消化,苯酚提取法提取血液中基因组DNA,设计引物,通过PCR扩增吉氏巴贝斯虫Cyt b基因片段并进行测序分析。调查发现,自2010年以来,通过三氮脒治疗的吉氏巴贝斯虫病的疗程逐渐延长,复发率也逐渐增加。在11份血样中,吉氏巴贝斯虫的Cyt b基因彼此之间相似性高达99.65%～100%,与日本分离株也有较高的同源性(99.18%～99.54%)。在Cyt b基因nt363基因位点上没有发现基因突变。这些结果说明虽然吉氏巴贝斯虫对三氮脒逐渐产生耐药,但三氮脒对吉氏巴贝斯虫Cyt b基因并不产生影响。     

犬吉氏巴贝斯虫的人工感染及治疗试验

为进一步证实犬吉氏巴贝斯虫（Ｂａｂｅｓｉａｇｉｂｓｏｎｉ）的致病作用,筛选较为理想的治疗药物,将１２只杂种狼犬均分为摘脾组与不摘脾组,进行了吉氏巴贝斯虫人工感染试验。人工感染犬临床症状与自然感染犬无明显差异,表现为体温升高、红细胞减少、Ｈｂ降低及虫血症等,摘脾组较不摘脾组虫血症和症状的出现早１～２ｄ。将此１２只人工感染犬及６７只自然感染犬随机分成４组,分别以贝尼尔（Ｂｅｒｅｎｉｌ）、阿卡普林（Ａ－ｃａｐｒｉｎｕｍ）、蒿甲醚（Ａｒｔｅｍｔｈｅｒｉｎ）和磷酸伯氨喹（Ｐｒｉｍａｑｕｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ）４种药物进行治疗比较试验,结果以蒿甲醚疗效最好,用药后第２天虫体转阴率达７０％,第３天Ｈｂ由２８ｇ／Ｌ上升到６４ｇ／Ｌ,奏效迅速。     

一例犬巴贝斯虫病的诊断及虫种的分子鉴定

为了诊断犬的巴贝斯虫病并鉴定巴贝斯虫的种类,本研究对病犬进行临床检查、生理生化检查、血涂片检查,并应用分子生物学方法对虫种进行鉴定。采取病犬血液做血涂片染色后于显微镜下观察到梨籽形状虫体,初步怀疑是巴贝斯虫,随后进行分子生物学鉴定。结果患病犬血液样本中扩增获得的18S rDNA序列长度为1560 bp与GenBank登录的Babesia gibsoni(MN928823.1)相似度为99.94%。并将该序列与GenBank中不同国家和地区的巴贝斯虫18S rDNA序列构建进化树,通过比对发现获得的序列与各地区B.gibsoni处于同一进化分支中,并与中国西安株序列(MN928823.1)亲缘关系最近。经临床检查、血常规检查和血涂片检查确定该犬患有巴贝斯虫病,经分子生物学方法最终确定感染的巴贝斯虫病原为吉氏巴贝斯虫(B.gibsoni)。     

牛卵形巴贝斯虫PCR检测方法的建立及初步应用

为建立牛卵形巴贝斯虫(B.ovata)快速检测方法,本研究根据GenBank中登录的B.ovata CCTη基因序列设计引物,建立了PCR检测方法。对该方法的最佳反应条件进行优化,并进行特异性、敏感性及临床样本检测试验。结果表明,建立的PCR方法扩增B.ovata CCTη基因片段大小为1 008 bp,与参考株序列同源性为100%。该方法对牛巴贝斯虫、牛双芽巴贝斯虫、牛瑟氏泰勒虫基因组DNA扩增结果均为阴性。最低可以检测样品中34个拷贝的DNA。通过对49份临床样本的检测,该方法比姬姆萨染色镜检阳性率高8.2%。本实验为B.ovata的诊断提供了一种特异、敏感的检测技术。     

南京地区犬的巴贝斯虫病病原形态学观察及免疫荧光鉴定

对我国南京地区犬的巴贝斯虫病的病原形态学进行了系统观察.结果发现,该虫在红细胞内呈多形性,其中圆点状、指环形和小杆形虫体为最常见.间接免疫荧光染色表明,该虫与抗吉氏巴贝斯虫血清可发生明显的特异性反应.结合虫体的形态特征,认为流行于南京地区犬的巴贝斯虫病病原为吉氏巴贝斯虫.     

吉氏巴贝斯虫多个GPI锚定蛋白基因的筛选与生物信息学分析

吉氏巴贝斯虫是一类红细胞内专性寄生的血液原虫,犬一旦感染终生带虫,治疗后时有复发,因此需要简便快捷的临床诊断方法及时确诊治疗。GPI锚定蛋白是虫体表面重要的抗原分子,是很好的潜在诊断标识,在虫体粘附、识别以及入侵红细胞等过程中具有非常重要的作用。为了筛选吉氏巴贝斯虫GPI锚定蛋白基因,通过搜索NCBI、Uniprot以及PiroplasmaDB数据库中吉氏巴贝斯虫表面抗原,与武汉株吉氏巴贝斯虫数据库作比对,筛选出可能的吉氏巴贝斯虫武汉株的GPI锚定蛋白基因,并通过bigPI、PredGPI、GPI-SOM网站预测其GPI锚定位点。运用生物信息学分析软件预测其氨基酸信号肽、跨膜区、疏水区以及结构域和抗原表位等,分析其生物信息特性。通过分析确定了5个吉氏巴贝斯虫武汉株的GPI候选抗原,分别命名为BgP50-WH、BgP47-WH、BgP45-WH、BgP32-WH、BgP12-WH,其GPI锚定位点均位于C端,长度约为21～22个氨基酸,均有信号肽并含有4个抗原表位。分析结果表明,这5个GPI抗原均有望成为吉氏巴贝斯病的诊断标识,其中BgP47-WH和BgP50-WH与抗体亲和力最强,最具有成为诊断标识的潜力。     

一例斗牛犬吉氏巴贝斯病的诊治

<正>巴贝斯虫病是由巴贝斯科、巴贝斯属的梨形虫寄生于马、牛、羊、犬等家畜的红细胞内引起的血液原虫病。寄生于犬的虫种主要是犬巴贝斯虫和吉氏巴贝斯虫,犬吉氏巴贝斯虫病发生、流行于多个省区,是流行于我国的主要虫种。笔者对我校动物医院接诊的一例斗牛犬吉氏巴贝斯虫病的临床表现、病原学、血常规、血液生化、诊断与治疗过程进行分析,旨在提高对犬吉氏巴贝斯虫病的诊断与治疗水平。1材料与方法1.1病犬临床检查与治疗     

吉氏巴贝斯虫cDNA探针的制备及杂交试验

本实验将－６．６ｋｂ的吉氏巴贝斯虫ｃＤＮＡ片段以光照活化法标记光敏生物素，制备成光敏生物素探针。与吉氏巴贝斯虫基因组ＤＮＡ、伊氏锥虫基因组ＤＮＡ、犬白细胞ＤＮＡ的斑点杂交试验表明，该探针可与０．００１ｎｇ以上量的吉氏巴贝斯虫ＤＮＡ杂交，而不与任何浓度的伊氏锥虫ＤＮＡ和犬ＤＮＡ杂交，具有很高的敏感性和特异性。     

PCR法检测血清I型马立克氏病病毒及其敏感性试验的研究

以人工合成的针对血清Ｉ号马立克氏病病毒（ＭＤＶ１）Ａ抗原基因（ｇＡ）部分序列的两端寡聚核苷酸为聚合酶链反应（ＰＣＲ）的引物，分别对马立克氏病病毒血清Ｉ型（京－１株，ＭＤ１１／７５Ｃ株）；２型（ＳＢ－１株）；３型（火鸡疱疹病毒的ＦＣ１２６株）毒株和ＧＡ株ＢａｍＨＩ Ｂ片段的ＰＡＣＹ１８４克隆重组质粒ＤＮＡ进行基因扩增反应及其敏感性试验。结果表明，该引物不仅对ＭＤＶ１具有较强的特异性，而且由此引物引导