金黄色葡萄球菌β-溶血素基因的克隆与序列分析

1989年,金黄色葡萄球菌β-溶血素基因被命名为hlb,其染色体位于4kb Cla I DNA片段并编码300多个氨基酸多肽,其中分子质量为37～39ku的镁依赖神经酯酶可以溶解红细胞。研究表明,牛源金黄色葡萄球菌与人源金黄色葡萄球菌相比大部分携带有β-溶血素,而且还表达该基因的表型。     

奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌溶血素基因型和表现型分析

为调查奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌溶血素基因型和表现型分布,并对两者之间的关系进行研究,采用PCR方法对从奶牛乳腺炎病例中分离的33株金黄色葡萄球菌的溶血素基因进行检测,并分别用牛血琼脂平板和绵羊血琼脂平板检测其溶血性。结果表明,各溶血素hla,hlb,hld,hlg,hlg2基因的检出率分别为90.91%,100%,93.94%,78.79%,66.67%;牛血平板检测表明β溶血占84.85%,绵羊血平板检测β溶血只有57.58%,金黄色葡萄球菌在牛血和绵羊血琼脂平板上均以β血为主,但牛血检测出的β溶血比例更高,表明牛红细胞对金黄色葡萄球菌β溶血素更为敏感。综上表明,金黄色葡萄球菌溶血素基因型和表现型之间无对应关系。     

牛源抗金黄色葡萄球菌β溶血素单链抗体的鉴定及其生物学特性

β溶血素(β-hemolysin,Hlb)在金黄色葡萄球菌感染奶牛乳腺的致病过程中起到了重要的作用,但是关于牛源抗β溶血素的免疫制剂研究较少。本研究首先以金黄色葡萄球菌ATCC25923的DNA为模板,利用PCR技术扩增编码β溶血素的基因hlb,构建原核表达质粒pET32a-hlb,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达重组Hlb蛋白。以纯化的重组Hlb蛋白为包被抗原,从牛源噬菌体单链抗体表达文库中筛选到了一株针对β溶血素高亲和力单链抗体(single-chain variable fragment, scFv),通过构建原核表达质粒pET32a-scFv在大肠杆菌Transetta中诱导表达。结果表明,重组Hlb蛋白具有良好的溶解奶牛红细胞的能力,抗β溶血素单链抗体可以显著抑制重组Hlb蛋白和金色葡萄球菌培养物上清的溶血作用。本研究一方面为研制抗金色葡萄球菌所致奶牛乳腺炎新型抗体制剂提供参考,另一方面也为深入研究β溶血素在金色葡萄球菌致病过程的作用奠定基础。     

奶牛乳腺炎源性金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因的克隆及原核表达

以提取的奶牛乳腺炎源性金黄色葡萄球菌山东分离株(zfb)全基因组DNA为模板,PCR扩增β-溶血素基因(hlb),并与克隆栽体pMD18-T相连接.测序结果表明,扩增片段含有993 bp的ORF,可编码含330个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的金黄色葡萄球菌β-溶血素蛋白的氨基酸同源性为99.4%.构建原核表达载体pET32a+/hlb,SDS-PAGE分析蛋白表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白的相对分子量质为57 000,表达量占菌体总蛋白的23.9%;表明原核表达质粒构建成功,并实现了有效表达.     

湖南部分地区乳源金黄色葡萄球菌耐药性及溶血性分析

为调查湖南省部分地区奶牛场生鲜乳源金黄色葡萄球菌的耐药性及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的检出情况，同时调查金黄色葡萄球菌溶血素基因型与溶血表型的分布情况及二者的关系。采用肉汤稀释法对分离自湖南省部分地区奶牛场生鲜乳的54株金黄色葡萄球菌进行18种常见抗菌药物耐药性检测，采用绵羊血琼脂平板检测细菌溶血性，并采用PCR方法扩增分离菌株mecA基因及5个溶血素基因。结果显示，54株金黄色葡萄球菌均表现不同程度的耐药，耐药谱型达21种；21株金黄色葡萄球菌表现为多重耐药，最高耐药重数为9重；对青霉素耐药最严重，耐药率达85.19%,对头孢西丁、苯唑西林、克林霉素、庆大霉素及大环内酯类药物(红霉素、替米考星)耐药率在20%～30%之间，对多西环素与万古霉素敏感；从24株分离菌中检出mecA基因，鉴定为MRSA。54株分离株在羊血琼脂平板上主要以β和γ溶血为主，α、β及γ溶血率分别为12.9%、44.4%和42.6%;各溶血素基因检出率分别为98.1%(hla)、94.4%(hlb)、96.3%(hld...     

金黄色葡萄球菌α-溶血素基因的克隆与序列分析

参考Gary S Gray和Michael Kehce在《传染与免疫》杂志上发表的关于金黄色葡萄球菌α溶血素蛋白的基因序列,设计合成1对引物,从分离自牛体的野生株金黄色葡萄球菌中提取细菌总DNA,对α溶血素蛋白基因进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,呈现1条约960 bp的条带,回收纯化后,将其克隆至pMD18 T质粒载体中,进行核苷酸序列分析,然后与报道的α溶血素蛋白基因进行比较。结果表明:所鉴定的野生株金黄色葡萄球菌的α溶血素蛋白基因序列与报道的核苷酸的同源性高达99.99%以上,证实为金黄色葡萄球菌Wood 46株α溶血素蛋白基因。     

金黄色葡萄球菌β-溶血素基因的克隆及原核表达载体的构建

根据GenBank中的金黄色葡萄球菌β-溶血素（hlb）基因序列,设计合成1对引物,采用PCR方法扩增出与预期设计大小相符的hlb基因特异性条带,将扩增出的DNA片段克隆到pMD18-T载体中,转化感受态细胞,经平板筛选,酶切鉴定,获得阳性重组质粒,对重组质粒进行序列测定,结果表明：金黄色葡萄球菌β-溶血素基因全长982bp,不含终止密码子的目的基因,插入的位点、大小与读码框均正确。将hlb基因插入到原核表达pET-32a中,转化到BL-21感受态细胞中,获得了表达hlb基因的阳性重组质粒。     

蜂胶对金黄色葡萄球菌α-溶血素的抑制作用

通过吸光度测量和荧光定量PCR的方法,在体外检测亚抑菌浓度的蜂胶作用下金黄色葡萄球菌α-溶血素活力变化及agrA、hla的mRNA表达量。结果显示,不同浓度蜂胶对金黄色葡萄球菌α-溶血素有不同程度的抑制作用（P〈0.05）;同时荧光定量PCR检测agrA和hla基因表明,蜂胶能够显著减少agrA和hla mRNA的相对表达量,进而抑制α-溶血素的表达。     

中草药连翘提取物抑制金黄色葡萄球菌α-溶血素分泌活性研究

通过乙醇回流提取获得中草药连翘粗提物,利用MIC值测定、溶血活性测定、免疫印迹、RT-PCR、LDH及live/dead等试验方法研究连翘提取物对金黄色葡萄球菌α-溶血素分泌的影响.结果表明:连翘提取物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌质量浓度(MIC)均大于2 048 mg/L,表明连翘提取物不影响金黄色葡萄球菌生长.连翘提取物在16～128 mg/L时,抑制了金黄色葡萄球菌α-溶血素的分泌,而且这种抑制作用呈剂量依赖性.研究结果提示连翘提取物可作为一种潜在的抗金黄色葡萄球菌感染药物,可进一步开发.     

亚抑菌浓度穿心莲提取物对减缓金黄色葡萄球菌α-溶血素介导的A549细胞损伤作用的影响

金黄色葡萄球菌是一种广泛存在的重要致病菌,可引起人类和动物许多严重的感染。另外,α-溶血素是金黄色葡萄球菌最重要的毒力因子之一。本研究通过乙醇回流提取方法,获得中草药穿心莲提取物,然后通过最低抑制浓度(MIC)值测定、溶血活性测定、Western blotting、RT-PCR、LDH及Live/dead等方法研究分析穿心莲提取物对金黄色葡萄球菌α-溶血素分泌的影响及对A549细胞的保护作用。试验结果表明,穿心莲提取物对金黄色葡萄球菌的MIC值为2048 μg/mL,且呈剂量依赖性地抑制金黄色葡萄球菌α-溶血素分泌,并能有效减缓金黄色葡萄球菌菌液上清对A549细胞的损伤。提示,穿心莲提取物是一种潜在的抗金黄色葡萄球菌感染的药物。     

土木香提取物抑制金黄色葡萄球菌毒力因子分泌作用的研究

本研究旨在分析土木香提取物对金黄色葡萄球菌主要毒力因子分泌的影响及机制研究,以耐药性金黄色葡萄球菌USA 300为研究对象,通过醇提法获取土木香提取物,根据主要毒力因子蛋白表型功能(溶血活性和TNF-α含量释放分析),利用蛋白免疫印迹和荧光定量PCR分析检测不同浓度土木香提取物对金黄色葡萄球菌主要毒力因子分泌的影响及机制。无抗菌活性的土木香提取物与金黄色葡萄球菌共培养后可显著抑制培养物上清溶血活性及其诱导小鼠脾淋巴细胞TNF-α释放活性,蛋白免疫印迹分析表明,土木香提取物处理可显著降低金黄色葡萄球菌α-溶血素、肠毒素A和中毒休克综合征毒素-1(TSST-1)的分泌,荧光定量PCR试验结果进一步表明土木香提取物与金黄色葡萄球菌共培养后降低金黄色葡萄球菌α-溶血素、肠毒素A和TSST-1编码基因的转录及金黄色葡萄球菌二元调控系统agr的转录。本研究结果表明,土木香提取物通过抑制agr二元调控系统转录及其毒力因子编码基因的转录而降低毒力因子的分泌,土木香提取物是一种潜在的新型抗金黄色葡萄球菌感染先导化合物。     

厚朴总酚对金黄色葡萄球菌的抑菌作用及抗溶血作用

为了研究厚朴总酚对乳房炎致病菌(主要为金黄色葡萄球菌)的抗菌活性和抗感染机制,首先通过肉汤稀释法检测厚朴总酚对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度,通过溶血试验、蛋白质免疫印迹试验、荧光定量PCR试验和LDH释放试验从不同层次和角度验证了厚朴总酚对金黄色葡萄球菌致病力的影响。结果显示,厚朴总酚对金黄色葡萄球菌具有一定的抗菌活性,其对金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度范围为8~16μg·mL-1。另外,本研究结果表明亚抑菌浓度的厚朴总酚可抑制α-溶血素的表达从而降低金黄色葡萄球菌的致病力,并可明显缓解金黄色葡萄球菌α-溶血素介导的细胞的损伤作用。     

奶牛乳房炎葡萄球菌菌种的鉴定及其mecA基因与耐药性关系分析

从209份奶牛乳房炎阳性乳样分离葡萄球菌,用PCR扩增Tuf和16S rRNA基因片段,根据序列同源性进行种的鉴定,用PCR检测mecA基因,用标准方法进行药敏试验。结果显示,分离的104株葡萄球菌分为14个种,包括金黄色葡萄球菌和13种凝固酶阴性葡萄球菌,后者主要为阿氏葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌和产色葡萄球菌,不同于国外的研究报道;松鼠葡萄球菌和溶血葡萄球菌的mecA基因检出率高达66.7%,表皮葡萄球菌达42.9%,金黄色葡萄球菌达35.7%,显著高于国内外报道;大部分葡萄球菌的β-内酰胺类抗生素耐药性与mecA基因检测不相符,可能与其他mec基因有关。     

食品中金黄色葡萄球菌单增李斯特氏菌和副溶血性弧菌的MPCR法检测

为快速检测食品中的金黄色葡萄球菌(SA)、单增李斯特氏菌(LM)和副溶血性弧菌(VP),根据各菌的相关基因设计引物,分别扩增金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因-nuc、单增李斯特氏菌溶血素O上的hlyA基因和副溶血性弧菌的热稳定直接溶血素基因-tdh,建立一种MPCR快速检测食品中致病菌的方法,结果表明,三条特异性扩增片段分别为279bp、243bp和202bp,经DNA测序证明其序列与模板被扩增片段一致。该方法具有良好的灵敏性和特异性。     

槲皮素抑制金黄色葡萄球菌α-溶血素所诱导的微血管内皮细胞凋亡

本文旨在探究黄酮类化合物槲皮素对金黄色葡萄球菌α-溶血素所引起的大鼠肺微血管内皮细胞(RPMVECs)凋亡的影响。采用贴块法培养原代细胞后用磁极纯化法选获取纯化的RPMVECs,并通过CD31免疫荧光进行鉴定。通过WST-1检测α-溶血素对RPMVECs的细胞毒性,筛选作用浓度。将槲皮素与α-溶血素共同作用RPMVECs 24 h后,通过流式细胞术检测细胞凋亡率。结果表明采用磁极纯化法可得到CD31阳性率高的RPMVECs。2μg/mLα-溶血素对RPMVECs具有毒性,并可诱导RPMVECs凋亡。槲皮素可以抑制金黄色葡萄球菌α-溶血素所诱导的RPMVECs凋亡,对细胞具有一定保护作用。     

橙皮素对金黄葡萄球菌α-溶血素表达的抑制作用

α-溶血素在金黄葡萄球菌的致病过程中发挥着不可或缺的作用。本研究采用最小抑茵浓度测定、茵液上清溶血活性以及α-溶血素含量测定、荧光定量PCR及细胞毒性的测定等相关试验验证了橙皮素对金黄葡萄球菌α-溶血素表达的影响。结果显示，无抗茵活性的橙皮素在较低质量浓度下即可抑制金黄葡萄球菌α-溶血素的表达及其编码基因的转录，是-种潜在的以毒力因子为靶标的前导化合物，并可进一步开发用于抗金黄葡萄球茵感染。     

长春部分地区犬猫源葡萄球菌的高通量测序分析

为了解长春地区犬猫源金黄色葡萄球菌(Staphylococcu saureus,S.aureus)和伪中间型葡萄球菌(Staphylococcus pseudintermedius,SP)耐药基因和毒力基因携带情况,利用高通量测序技术对17株S.aureus与38株SP所携带的耐药基因与毒力基因进行分析,根据Kirby-Bauer纸片扩散法的结果分析耐药基因型与表型的关系,同时进行了MLST分型。结果表明S.aureus和SP对常规抗菌药物表现中介或耐药,但对呋喃妥因敏感率为100%;β-内酰胺类耐药基因bla_Z检出率较高,分别为100%和57.9%;各有1株同时携带bla_Z和bla_NDM;S.aureus中检出2株携带磷霉素类耐药基因fosA;SP中检出21株携带多药耐药基因cfr;各检出3株携带多药外排耐药基因mdfA;共检出4株MRSA和11株MRSP;优势ST型分别为ST25和ST1430;在大多数分离菌中携带有γ-溶血素hlgB、黏附素clf、fnb、杀白细胞素LukF-PV、LukS-PV等毒力基因。分离株耐...     

胡椒碱抑制金黄色葡萄球菌α溶血素的表达研究

为了测定胡椒碱对金黄色葡萄球菌USA300α溶血素(α-Hemolysin, Hla)溶血活性的抑制作用并初步阐明其机制,为胡椒碱治疗金黄色葡萄球菌感染提供依据,试验选择Hla为靶标,通过溶血活性试验测定不同浓度胡椒碱对金黄色葡萄球菌USA300共培养物上清液溶血活性的影响,通过最低抑菌浓度(MIC)试验及生长曲线试验考察胡椒碱对金黄色葡萄球菌生长的影响,通过免疫印迹分析试验初步阐明胡椒碱抑制金黄色葡萄球菌USA300溶血活性的机制,通过乳酸脱氢酶(LDH)试验考察胡椒碱对共培养物上清液介导的细胞损伤的抑制作用。结果表明:胡椒碱可显著降低金黄色葡萄球菌Hla的表达,抑制金黄色葡萄球菌USA300培养物上清液的溶血活性,不同浓度胡椒碱均不影响金黄色葡萄球菌USA300生长,且可保护A549细胞免于培养物上清液介导的细胞损伤。说明胡椒碱能够通过抑制Hla的表达而缓解培养物上清液介导的A549细胞损伤,可用于治疗金黄色葡萄球菌感染。     

粤北三黄鸡β-防御素基因的表达及其生物活性研究

采用RT-PCR 方法从三黄鸡肝脏中扩增β-防御素 Gal-6基因的 cDNA 片段,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-GAL-6,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21进行原核表达。结果表明,成功获得201 bp的鸡β-防御素基因,SDS-PAGE 电泳分析表明,原核表达的重组鸡融合蛋白分子质量约为32 kD。此外,表达的该重组蛋白对金黄色葡萄球菌有较高抗菌活性。     

重庆市部分养殖场金黄色葡萄球菌耐药性分析及ESBL基因检测

为了解重庆市部分养殖场动物源性金黄色葡萄球菌的耐药及携带超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrumβ-lactamases,ESBLs)基因情况,从重庆部分养殖场采集共1 371份样品,经前处理、增菌,划线接种,挑取疑似菌落,PCR扩增金黄色葡萄球菌特异性nuc基因,对分离鉴定的金黄色葡萄球菌进行药物敏感性试验,并检测菌株中携带的ESBL基因。结果显示:从1 371份样品中分离到89株金黄色葡萄球菌,包括25株猪源菌株、32株鸡源菌株、6株牛源菌株、10株羊源菌株和16株兔源菌株。89株菌对青霉素类药物耐药最为严重,其次为四环素类、大环内酯类和喹诺酮类。除2株兔源菌株外,其余分离菌均为多重耐药,耐药数量从2种到21种不等,猪源菌株的多重耐药最为严重。ESBL基因检测结果显示共有86株细菌携带blaTEM-1a基因,携带率高达96.6%。分离的金黄色葡萄球菌菌株耐药严重,且广泛携带TEM-1a型ESBL基因。