流感病毒PB1-F2蛋白通过激活ERK1/2激酶刺激AP-1转录因子的活化

为探索A型流感病毒PB1-F2蛋白对转录因子AP-1信号通路的调控机制,本研究通过荧光素酶报告基因试验检测PB1-F2蛋白的表达对AP-1转录活性的调控,利用荧光定量PCR和免疫印迹方法检测PB1-F2对c-Fos/AP-1的m RNA转录和ERK1/2磷酸化水平的影响,并以ERK通路特异性抑制剂U0126抑制ERK1/2的活性后,以验证PB1-F2调控AP-1是否通过ERK1/2激酶介导。结果显示:A549和293T细胞中表达PB1-F2蛋白后,AP-1的转录活性均显著升高,并且c-Fos/AP-1的m RNA转录水平呈现显著上调;过表达PB1-F2蛋白同样能够显著上调磷酸化ERK1/2水平;以U0126抑制ERK1/2激活后,PB1-F2上调AP-1转录活性的作用显著下降。本研究表明,流感病毒PB1-F2蛋白能够通过激活ERK1/2激酶诱导AP-1转录因子的活化,为进一步研究PB1-F2蛋白参与调控炎症反应的机制提供了实验依据。     

漏芦通过TLR4/NF-κB通路抑制脂多糖诱导的小鼠乳腺上皮细胞炎症反应

为探讨漏芦醇提物（RUEE）对脂多糖（LPS）诱导的小鼠乳腺上皮细胞（HC11细胞）的抗炎作用及机制,试验利用RUEE(80μg/mL)、LPS(1μg/mL)单独处理以及RUEE(80μg/mL)+LPS(1μg/mL)共处理HC11细胞,采用荧光定量PCR检测炎性细胞因子及Toll样受体4(TLR4)mRNA表达水平,采用Western blotting检测核转录因子κB(NF-κB)通路关键因子的蛋白表达量。结果表明：LPS诱导可明显提高HC11细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、环氧合酶-2(COX-2)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)的mRNA表达水平（P<0.05）;明显上调TLR4 mRNA表达及NF-κB p65和NF-κB抑制蛋白α(IκBα)的磷酸化水平（P<0.05）。RUEE预处理可显著降低LPS诱导的HC11细胞TNF-α、COX-2、IL-6、IL-1β的mRNA表达（P<0.05）;显著下调TLR4 mRNA表达及NF-κB p65和IκBα的磷酸化水平（P<0.05）。由此可知漏芦醇提物可通过抑制TLR...     

高表达线粒体融合蛋白2(MFN2)可抑制高BHBA活化的奶牛肝细胞NF-κB炎性通路

为研究线粒体融合蛋白2(mitofusin 2,MFN2)对高β-羟丁酸(β-hydroxybutyrate,BHBA)活化NF-κB炎性通路的影响,体外培养奶牛肝细胞,添加不同浓度(0.0,1.2,2.4,4.8 mmol/L)的BHBA,并转染过表达MFN2的腺病毒,运用Western blot和qRT-PCR技术检测NF-κB炎性通路关键分子的基因和蛋白表达。结果显示,随着BHBA浓度的增加,IKBα和NF-κB p65的磷酸化水平以及IL-1β、IL-6和TNFα的mRNA表达均显著升高,MFN2的基因和蛋白表达水平则显著降低;过表达MFN2后,显著抑制了高BHBA诱导的IKBα和NF-κB p65磷酸化水平及IL-1β、IL-6、TNFαmRNA表达水平的升高。结果表明,在奶牛肝细胞中过表达MFN2可以显著抑制高BHBA活化的NF-κB炎性通路。     

酵母双杂交筛选人白细胞文库中与A型流感病毒PB1-F2相互作用的蛋白

利用酵母双杂交技术筛选白细胞文库中与A型流感病毒PB1-F2相互作用的宿主蛋白,为研究PB1-F2蛋白的功能提供依据。构建pGBKT7-PB1-F2诱饵重组载体,在证实诱饵蛋白不具有自激活作用的前提下,以酵母双杂交系统筛选人白细胞文库中与PB1-F2相互作用的细胞蛋白。对阳性克隆进行测序和生物信息学分析,并在酵母细胞内验证蛋白的相互作用。Western blot结果表明,酵母表达载体pGBKT7-PB1-F2在酵母中成功表达PB1-F2融合蛋白。酵母双杂交筛选并验证,获得了8个与流感病毒PB1-F2蛋白相互作用的宿主蛋白。本研究有助于在分子水平上探索PB1-F2蛋白的新功能,为揭示流感病毒的致病机理奠定基础。     

重组RTB蛋白对巨噬细胞活化及对NF-κB信号通路的影响

采用重组RTB蛋白刺激RAW264.7细胞,对iNOS、IL-6和TNF-αmRNA表达及IκB-α和NF-κBp65磷酸化蛋白表达进行分析,探讨重组RTB蛋白对巨噬细胞活化及对NF-κB信号通路的影响。结果显示,重组RTB蛋白组RAW264.7细胞iNOS、IL-6和TNF-αmRNA的表达显著高于对照组(P<0.01),并呈现时间和计量依赖性;加入NF-κB抑制剂BAY后,iNOS、IL-6和TNF-αmRNA表达降低(P<0.05或P<0.01)。随RTB刺激RAW264.7时间的延长,IκB-α蛋白的磷酸化程度增强,NF-κBp65磷酸化蛋白表达逐渐增高,表明重组RTB蛋白具有促进巨噬细胞活化及活化NF-κB信号通路的功能。     

壳聚糖抗无乳链球菌引起的奶牛乳腺上皮细胞炎性反应

本研究旨在研究壳聚糖(CTS)对无乳链球菌(S. agalactiae)引起的奶牛乳腺上皮细胞(bMECs)炎性反应的抑制作用和分子机制。试验用含不同浓度(0、15.625、31.250、62.500、125.000、250.000、500.000和1 000.000 mg/mL) CTS的脑心浸出液(BHI)培养基培养S. agalactiae,通过测定600 nm吸光度(OD)检测细菌活性;试验用含不同浓度(0、31.25、125.00和250.00 mg/mL)CTS的细胞培养基培养bMECs 24 h后,用S. agalactiae刺激细胞6 h,使用荧光定量PCR的方法检测白细胞介素-6 (IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-8(IL-8)、Toll样受体2(TLR2)、髓样分化因子88(MyD88)、白细胞介素-1受体相关激酶4(IRAK4)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)和转化生长因子激酶1(TAK1)的mRNA表达量,使用Western blot的方法检测核因子-κB抑制蛋白-α(IκB-α)、磷酸化核因子-κB-蛋白65(p-NF-κB-p65)、磷酸化蛋白38(p-p38)、磷酸化的细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)和磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)的蛋白表达量。结果表明:1) CTS呈浓度依赖性抑制S. agalactiae的活性。2)S. agalactiae极显著提高了bMECs的IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-8 mRNA表达量(P0.01);31.25、125.00和250.00 mg/mL的CTS显著或极显著降低了S. agalactiae诱导的bMECs的IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-8 mRNA表达量(P0.05或P0.01)。3)S. agalactiae极显著提高了bMECs的TLR2、MyD88、IRAK4、TRAF6和TAK1 mRNA表达量(P0.01);31.25、125.00和250.00 mg/mL的CTS显著或极显著降低了S. agalactiae诱导的bMECs的TLR2、MyD88、IRAK4、TRAF6和TAK1 mRNA表达量(P0.05或P0.01)。4)S. agalactiae显著提高了bMECs的IκB-α、 p-NF-κB-p65、 p-p38和p-JNK蛋白表达量(P 0. 05);31.25、125.00和250.00 mg/mL的CTS显著或极显著降低了S. agalactiae诱导的bMECs的IκB-α、p-NF-κB-p65、p-p38、p-ERK1/2和p-JNK蛋白表达量(P0.05或P0.01)。综上所述,CTS可以呈浓度依赖性抑制S. agalactiae活性。CTS通过抑制核因子-κB(NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的转导,减少了炎性细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-8 mRNA表达,从而减弱S. agalactiae诱导的bMECs的炎性损伤作用。     

重组UBC13对RAW264.7炎症因子mRNA表达的影响

为了研究重组蛋白UBC13对RAW264.7小鼠巨噬细胞炎症因子mRNA表达量的影响,采用噻唑蓝(MTT)法检测UBC13对RAW264.7细胞活力的影响,qPCR法检测不同浓度UBC13(20、10、5μg/mL)在不同时间点(3、6、9、12、24h)对RAW264.7细胞产生的IL-6、IL-1β、TNF-α和COX-2 4种炎症因子mRNA表达量的影响。结果表明,在整个试验时间范围内IL-6、IL-1β、TNF-α和COX-2mRNA表达量呈现逐步降低的趋势;与细胞对照组组相比,在24h时IL-6、IL-1β、TNF-α和COX-2mRNA表达量显著降低(P0.05)。说明重组蛋白UBC13作用于RAW264.7细胞24h时能够明显抑制RAW264.7细胞中IL-6、IL-1β、TNF-α和COX-2的mRNA表达,并且具有药物剂量依赖性。     

GST-P58IPK融合蛋白的表达、纯化及活性鉴定

以RT-PCR方法扩增目的基因P58IPK,将其克隆至原核表达质粒pGEX-6p-1.将所构建的pGEX-6p-1-P58IPK重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)并诱导表达,利用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和柱进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE、Western-blot及体外活性鉴定.结果显示,大肠杆菌细胞经诱导表达出相对分子质量约为85 000的蛋白,与GST-P58IPK融合蛋白大小相符;Western-blot显示该融合蛋白能够被抗GST的抗体特异性识别,磷酸化试验表明GST-P58IPK融合蛋白能够抑制PKR的体外磷酸化.结果表明,在大肠杆菌表迭系统中表达了有活性的GST-P58IPK融合蛋白,为PKR信号通路的研究奠定了基础.     

牛膝多糖对仔猪肠上皮细胞免疫应激的调控及其作用机制

本试验旨在考察牛膝多糖(ABPS)对脂多糖(LPS)免疫应激下仔猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)促炎细胞因子分泌和表达的影响,并探讨ABPS调控IPEC-J2免疫应激可能的作用机制。选用4~5代的IPEC-J2,培养基中分别添加0(对照)、300、600、900、1 200μg/m L ABPS和10μg/m L LPS,每组12个重复,每孔为1个重复。培养72 h后,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测ABPS对促炎细胞因子白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)分泌量的影响,采用实时定量PCR测定Toll样受体4(TLR4)、核转录因子κB(NF-κB)的mRNA表达量,采用Western blot法测定TLR4、NF-κB、磷酸化核转录因子κB(p-NF-κB)蛋白表达量。结果显示:与对照组相比,300、600、900和1 200μg/m L ABPS组能显著减少IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α的分泌量(P0.05);300μg/m L ABPS组能显著减少p-NF-κB蛋白的表达量(P0.05),900和1 200μg/m L ABPS组能显著减少TLR4、NF-κB的mRNA和NF-κB蛋白的表达量(P0.05)。由此可见,ABPS通过TLR4/NF-κB信号转导途径来调控促炎细胞因子的分泌,从而缓解免疫应激,低浓度ABPS通过直接抑制NF-κB磷酸化过程来降低免疫应激,高浓度ABPS则是通过抑制TLR4 mRNA、NF-κB mRNA和NF-κB蛋白的表达量来缓解免疫应激。     

应用酵母双杂交系统筛选与流感病毒PB2蛋白相互作用的宿主蛋白

流感病毒PB2蛋白可以作用于病毒mRNA转录起始阶段,辅助病毒mRNA引物的合成,并能够影响病毒的宿主范围,参与禽流感病毒在哺乳动物宿主体内的适应过程。本研究利用2009甲型H1N1流感病毒PB2蛋白作为"诱饵"蛋白,通过经典酵母双杂交系统筛选由Calu-3、A549、THP-1和U251 4种细胞构建的cDNA文库,筛选到多个与PB2蛋白相互作用的宿主蛋白。针对其中筛选到的一种宿主蛋白FHL2,进行免疫共沉淀(Co-IP)和激光共聚焦(Confocal)试验,证实了PB2蛋白和FHL2蛋白二者之间存在相互作用,并且转染瞬时过表达FHL2发现该蛋白可以负调控流感病毒复制,为进一步研究PB2蛋白与FHL2蛋白互作及影响病毒复制的分子机制奠定了基础。     

PrP蛋白与Shadoo蛋白研究进展

朊蛋白(PrP蛋白)在传染性海绵状脑病中具有重要作用,但其生物学功能至今没有明确。Shadoo蛋白是一种与朊蛋白在N端结构上极为相似的新蛋白,SPRN是Shadoo蛋白的结构基因。由于Shadoo蛋白与PrP蛋白具有相同的生物学性质,且它们在脑组织中重叠表达,因此也被认为是研究朊蛋白的关键因素。文章主要探讨PrP蛋白与Shadoo蛋白在基因结构、蛋白功能、朊病毒感染方面的关系。     

ASIP蛋白与AgRP相关蛋白生物信息比较分析

利用生物信息学的方法研究人、绵羊和牛等18个物种Agouti信号蛋白（ASIP）和Agouti相关蛋白（AgRP）的编码区及其对应氨基酸序列的相关特征，以期探明两种蛋白的遗传分化特点。结果表明，在ASIP与AgRP均为399bp的CDS序列中，其核苷酸保守区域的位置分别在262～399bp和230～399bp处；ASIP和AgRP在各自CDS序列多态位点变异的各项指标数值及其百分率大小上均极为接近；在46条ASIP的CDS序列及32条AgRP的CDS序列中，二者的单倍型数分别为22种和23种，ASIP和AgRP在基因的进化以及不同物种的遗传分化上具有相似性；两者的氨基酸序列在98～140aa片段处保守性较高，该区域同时富含半胱氨酸（Cys）；ASIP和AgRP一级结构的理化性质表现为共性与差异并存；二者的肽链C端具有相似的三维结构，但各自也具有其结构特异性。     

使用蛋白质原料的困惑

欧洲饲料配方师在使用蛋白原料时碰到了困惑，目前正致力于寻找新的优质蛋白原料用于仔猪日粮中。一种理想的原料应该具有适合动物胃口的要求和营养价值。这种原料最好不是动物性产品或鱼粉，而且也不含转基因（GMO）的物质。产生这种困扰主要是由于欧洲人普遍关心食品安全性尤其是疯牛病（BSE）的发生。首先是GMO问题，欧洲消费者反对GMO食品，从而大部分非GMO豆粕必须用于生产人类食品中，这种豆粕价格高。有些蛋白质供应商确实提供非GMO豆粕用于饲料生产，但因资源供应不足而使其价格昂贵。整个欧盟（EU）国家禁止饲料厂将血浆蛋…     

苜蓿蛋白质及影响苜蓿粗蛋白含量的主要因素

作为一种重要的豆科牧草,苜蓿具有营养丰富、粗蛋白含量高的显著特点,在我国农业体系中扮演着重要的角色.本文综述了近年来关于苜蓿蛋白质,不同因素对苜蓿粗蛋白含量的影响这两方面的研究进展.     

苜蓿蛋白质及影响苜蓿粗蛋白含量的主要因素

作为一种重要的豆科牧草,苜蓿具有营养丰富、粗蛋白含量高的显著特点,在我国农业体系中扮演着重要的角色。本文综述了近年来关于苜蓿蛋白质,不同因素对苜蓿粗蛋白含量的影响这两方面的研究进展。     

胃膜蛋白与血浆蛋白在乳猪料中的试验

胃膜蛋白是用猪胃粘膜提取胃膜素后的膜浆,经中和浓缩而成,由于它含高量的胃蛋白酶和其它消化酶,可明显促进幼小动物消化系统的早日成熟及完善,并能改善饲料的消化吸收,降低饲料更换的应激综合反应.胃膜蛋白中残留的胃膜素,在动物胃内形成膜,能覆盖于溃疡面,对胃和十二指肠溃疡面能在生理上保护和润滑,是一种高品质动物性功能蛋白质.     

热休克蛋白的研究进展

热休克蛋白(Heatshock proteins,HSP),是生物受到环境中物理、化学、生物、精神等刺激时产生应激反馈而合成的蛋白质。作为进化保守的蛋白家族之一,普遍存在于各种生物体中,并在生物体内发挥着重要的生理功能。HSP因具有丰富强大的分子伴侣、抗应激、调节细胞凋亡、抗氧化、参与机体免疫等生物学功能,决定了其广泛的用途。大量的试验表明,近年来HSP在相关领域的应用研究已获得了重要的突破与进展,特别是在疾病免疫和药物开发中的应用研究。文中在阐明HSP分子调控的基础上,综述了近年来热休克蛋白家族(HSP90、HSP70、HSP60和小分子HSP)在功能和应用方面的研究进展,为进一步完善对HSP的研究提供一定的参考。     

含硫氨基酸蛋白与GFP融合基因的表达分析

提高饲用植物中的含硫氨基酸水平已成为动物营养学家关注的焦点,含硫氨基酸对奶制品、肉类及羊毛产量有重要影响.γ-zein和zeolin(γ-zein和菜豆球蛋白的融合基因)编码2种含硫氨基酸蛋白基因,利用基因轰击法将质粒pCBzein、pCBzeolin和pCAMBIA1302分别转入洋葱(Allium cepa L.)表皮细胞,激光共聚焦扫描显微结果表明γ-zein和zeolin在洋葱表皮细胞的细胞核、内质网及细胞壁中均有表达.采用冻融法分别将表达载体pCBzein、pCBzeolin和pCAMBIA1302导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404,利用该菌株转化烟草(Nicotiana tabacum);在Hygromycin选择压力下获得烟草抗性不定芽和再生植株;激光共聚焦扫描显微结果表明γ-zein和zeolin蛋白以颗粒的形式不均匀地分布在烟草原生质体中,并验证表达载体pCBzein和pCBzeolin的选择基因、目的基因和报告基因均得到了表达,为进一步开展豆科牧草营养品质改良奠定了基础.     

新型的动物蛋白饲料资源

在自然界中可供食用的昆虫就达3650余种。大量研究证明：昆虫蛋白质含量高、低脂肪、低胆固醇、肉质纤维少、易吸收、微量元素丰富,是优于肉蛋类的最大的动物蛋白资源。