半胱胺对羔羊卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响

实验旨在研究半胱胺对4～8周龄哈萨克羔羊卵母细胞体外成熟和发育能力的影响。在体外成熟培养基中添加不同浓度的半胱胺(0、50、100、200μmol/L),统计卵母细胞卵裂率、囊胚率、成熟率、正常受精率及卵裂和胚泡率,并用SPSS 17.0进行方差分析。结果表明：与空白组相比,添加100μmol/L半胱胺可提高羔羊卵母细胞卵裂率、囊胚率、成熟率、正常受精率、卵裂率及胚泡率(P<0.05),添加100μmol/L半胱胺可提高卵母细胞的正常受精率和滋养层细胞数(P<0.05)。可见,100μmol/L半胱胺可显著改善羔羊卵母细胞的体外成熟、受精和发育能力。     

不同浓度雌二醇对猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活胚胎的影响

为了探讨雌二醇（17β-estrodiol,E2）对猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活后胚胎早期发育的影响,在卵母细胞体外成熟培养基中添加不同浓度雌二醇,研究卵裂率和囊胚率的变化。以未添加雌二醇的基础液为对照组,比较分析各组卵母细胞核成熟效率、孤雌激活后胚胎的卵裂率、囊胚发育率。结果表明,成熟液中添加1μg／mL雌二醇（E2）对猪卵母细胞的体外成熟具有明显的促进作用,而添加100μg／mL雌二醇（E2）对猪卵母细胞体外成熟具有明显的抑制作用。     

胰岛素和白血病抑制因子对猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活胚胎的影响

为探讨胰岛素(Insulin)和白血病抑制因子(Leukemia inhibit factor,LIF)对猪卵母细胞体外成熟(IVM)和猪孤雌激活胚胎(PAEs)的影响,在卵母细胞体外成熟或者胚胎培养基中添加Insulin和LIF,研究卵裂率和囊胚率的变化。结果:添加了5μg/mL Insulin后猪卵母细胞体外成熟效果显著提高,但成熟后孤雌激活发育能力与非添加组相近;而胚胎培养基中添加Insulin对孤雌胚的卵裂和囊胚的形成也没有明显促进作用;添加1 000 U/mL的LIF后,卵母细胞核成熟率没有明显提高,反而孤雌激活后囊胚率急剧下降,但对卵裂率以及囊胚总细胞数影响不大;在胚胎培养基中添加LIF后,孤雌胚的卵裂和囊胚形成并没有明显的提高。表明:Insulin对卵母细胞体外成熟有益,但是对孤雌胚胎的最佳处理程序还需要摸索;本文所采用的LIF处理对猪卵体外成熟以及孤雌胚胎体外发育没有帮助,还需要进一步研究其他浓度和处理程序对猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活胚胎发育能力的影响。     

山羊卵母细胞体外成熟培养液体积筛选

研究在一定卵丘-卵母细胞复合体(COCs)与培养液体积比例条件下,不同体积的培养液对山羊卵母细胞体外成熟的影响。按照COCs 1枚/4μL培养液的比例,采用5种不同体积的培养液,即50,100,250,500和1 000μL,对山羊卵母细胞进行体外成熟培养和孤雌激活。结果:100μL和250μL两组的卵母细胞体外成熟培养24 h后,其卵母细胞成熟率分别为78.10%和74.62%,差异不显著(P>0.05),但高于50μL组(P<0.05)、500μL组(P<0.05)和1 000μL组(P<0.01)组。100μL组孤雌激活胚胎的卵裂率(68.37%)、桑葚胚率(48.78%)和囊胚率(27.61%)都优于其他各组,其卵裂率和囊胚率与250μL组相比差异不显著(P>0.05)。结果表明采用COCs 1枚/4μL培养液的比例条件下培养卵母细胞,宜选用100～250μL范围内的培养液体积进行卵母细胞成熟培养,其卵母细胞体外成熟率可以达到78.10%左右。     

卵丘细胞对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育的影响

为探讨表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)的添加浓度及脱卵丘细胞时间对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育的影响.试验通过在体外成熟液中添加不同浓度(0、10、15、20、30、40 ng/mL)的EGF来研究其对培养44 h的卵母细胞成熟率以及孤雌胚胎发育的影响;在培养开始后的不同时间(18、24、38、44 h)进行脱卵丘细胞处理来研究不同时间脱卵丘处理对培养44 h的卵母细胞成熟率以及孤雌胚胎发育的影响.结果表明,成熟培养基中添加10 ng/mL EGF能显著提高卵母细胞的卵裂率和囊胚率(P <0.05).共培组和独培组卵母细胞培养18 h后脱卵丘细胞成熟率均低于44 h,但差异不显著(P >0.05);共培组卵母细胞培养18 h后脱卵丘细胞的卵裂率和囊胚率显著高于培养44 h(P <0.05);独培组卵母细胞培养18 h后脱卵丘细胞的卵裂率与44 h无显著差异(P >0.05),但囊胚率显著高于培养44 h后脱卵丘细胞(P <0.05).添加10 ng/mL EGF对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育较好;卵母细胞培养18 h后脱卵丘细胞可提高孤雌胚胎早期发育能力.     

人尿促性腺激素、雌二醇及表皮生长因子对牛卵母细胞体外成熟质量的影响

试验旨在研究不同激素配比及表皮生长因子(EGF)浓度对牛卵母细胞体外成熟及卵母细胞质量的影响。将随机分组的卵丘-卵母细胞复合体于添加FSH+LH、HMG、FSH+LH+E₂、HMG+E₂ 4种不同激素组合配比的成熟基础液中培养,对比其体外成熟率,比较了EGF对牛卵母细胞体外成熟率和孤雌胚胎体外发育的影响,并采用TUNEL法检测添加不同浓度EGF的牛孤雌激活囊胚细胞凋亡情况。结果表明,添加HMG的成熟试验结果稳定,E₂对牛卵母细胞成熟有一定的促进作用,HMG+E₂联合使用可以得到高效稳定的成熟结果;在此基础上,在成熟液中添加30 ng/mL EGF对牛卵母细胞的成熟质量、胚胎发育及降低胚胎细胞凋亡都有明显的促进作用。因此,在体外成熟培养液中添加0.075 IU/mL HMG、1 μg/mL E₂和30 ng/mL EGF对牛卵母细胞的成熟和质量较为有益。     

转GFP基因核移植牛胚胎的研究

试验采用脂质体转染法与电穿孔法,以携带绿色荧光蛋白(GFP)-新霉抗性(neo)双标记基因的pMSCV质粒转染胎牛耳成纤维细胞为供体与体外成熟的牛卵母细胞为受体构建克隆胚.研究了体外成熟培养液中添加EGF(表皮生长因子)对转基因胚的影响,不同转染方法构建供体细胞对重构胚发育的影响和在不同体外培养系统中的发育效果.结果显示,体外成熟培养液中添加EGF 30 ng/mL组的卵母细胞成熟率最高.但对后期转基因重构胚的囊胚发育率的影响,以添加EGF 20ng/mL组的最高;以胎牛耳成纤维细胞为供体细胞,不同转染方法转染供体细胞构建重构胚,其囊胚发育率差异不显著(P＞0.05);mSOFaa+颗粒细胞单层细胞共培养体系中的转基因囊胚发育率最好,该体系更适合体细胞核移植法生产转基因牛胚胎.     

表皮生长因子对水牛卵母细胞体外培养核质成熟的影响

为了探讨表皮生长因子（EGF）对水牛卵泡卵母细胞体外培养核质成熟的影响，在以TCM199为基础的成熟液中加入不同浓度的EGF（0、10、25、50、100 ng/ml），体外成熟培养24~26 h，观察第一极体（PB1）的排放；随后进行孤雌激活检测其分裂率、囊胚发育率、囊胚孵化率，并用Hoechst33342染色后计算囊胚的细胞数。结果发现添加EGF各组的卵母细胞第一极体排放率显著提高（P<0.05）；成熟液中添加25 ng/ml EGF时，卵裂率及囊胚发育率（分别为80.0%、44.8%）明显高于对照组（分别为69.3%、31.9%，P<0.05），但对囊胚的细胞数影响不大。EGF不仅促进水牛卵母细胞体外培养的核成熟，而且有利于卵母细胞的胞质成熟，其中EGF的最佳浓度为25 ng/ml。     

甘草酸单铵盐对猪卵母细胞体外成熟及胚胎发育能力的影响

将收集的猪COCs置于添加不同浓度(0.0,0.3,0.6,1.2μmol/L)甘草酸单铵盐(monoammonium glycyrrhizinate, MAG)的卵母细胞体外成熟培养液中培养46 h,统计成熟率，通过免疫荧光染色检测成熟卵母细胞ROS表达水平；对成熟卵母细胞体外受精，于胚胎培养液内体外培养48,120 h,分别统计体外受精胚胎卵裂率、囊胚率，并用Hochest荧光染色检测囊胚总细胞数；结合成熟率及IVF胚胎发育囊胚率选定最佳添加浓度，在体外成熟培养液中添加最适浓度MAG,以0μmol/L MAG为对照组，体外培养46 h后，利用免疫荧光染色检测猪成熟卵母细胞的线粒体膜电位水平和细胞凋亡水平。结果显示，与对照组相比，不同浓度MAG处理组猪卵母细胞体外成熟率均有所提高，但差异均不显著(P>0.05);不同浓度MAG添加均可降低猪卵母细胞ROS水平，与对照组相比，0.3,0.6μmol/L组差异显著(P<0.05),1.2μmol/L组差异极显著(P<0.01)。0.3μmol/L添加组显著提高了猪体外受精囊胚率(P<0.05),但不同MAG添加组对...     

Leptin和ITS对牛卵母细胞体外培养和胚胎生产的影响

利用Leptin和ITS促进体外成熟和体外培养的牛卵母细胞的发育和质量,探讨提高胚胎体外生产的质量和数量的方法和技术。试验1：体外受精胚胎的培养液：添加BSA的KSOM中添加10mL/L浓度的ITS,结果使胚胎的桑椹胚率和囊胚率显著（P〈0.05）高于培养液中不加ITS的对照组（桑椹胚率：43.48%vs29.07%,囊胚率：22.83%vs11.63%）,卵裂率、正常分裂率和8细胞率与对照组差异不显著（P〉0.05）。试验2：在卵母细胞的体外成熟液中添加10μg/L具有生物学活性的重组鸡Leptin成熟肽融合蛋白,Leptin处理组和对照组卵母细胞经体外成熟、受精后转入加有10mL/LITS的KSOM培养液进行体外培养。试验组卵裂率和正常分裂率极显著（P〈0.01）高于对照组（88.96%vs66.81%和61.11%vs29.36%）,8细胞率显著（P〈0.05）高于对照组（84.84%vs69.57%）。Leptin处理的卵母细胞在受精后的桑椹胚率和囊胚率与对照组差异不显著,但最后的囊胚数量较对照组增加1倍多,分别为IVF卵母细胞总数的14.8%和6.4%（P〈0.01）。这说明,添加Leptin对牛卵母细胞体外成熟有促进作用,可显著提高卵母细胞受精后早期胚胎的卵裂率、正常分裂率和8细胞率;加入ITS则能提高桑椹胚率和囊胚率;而Leptin和ITS的按顺序结合使用,则能大大增加体外生产胚胎的桑椹胚和囊胚的数量,从而提高胚胎体外生产的效率。     

转GFP基因核移植牛胚胎的研究

试验采用脂质体转染法与电穿孔法,以携带绿色荧光蛋白（GFP）-新霉抗性（neo-）双标记基因的pMSCV质粒转染胎牛耳成纤维细胞为供体与体外成熟的牛卵母细胞为受体构建克隆胚。研究了体外成熟培养液中添加EGF（表皮生长因子）对转基因胚的影响,不同转染方法构建供体细胞对重构胚发育的影响和在不同体外培养系统中的发育效果。结果显示,体外成熟培养液中添加EGF 30 ng/mL组的卵母细胞成熟率最高,但对后期转基因重构胚的囊胚发育率的影响,以添加EGF 20 ng/mL组的最高;以胎牛耳成纤维细胞为供体细胞,不同转染方法转染供体细胞构建重构胚,其囊胚发育率差异不显著（P>〖JP2〗0.05）;mSOFaa+颗粒细胞单层细胞共培养体系中的转基因囊胚发育率最好,该体系更适合体细胞核移植法生产转基因牛胚胎。     

表皮生长因子对水牛胚胎体外发育及凋亡的影响

为了探讨表皮生长因子(EGF)对水牛早期胚胎体外发育及凋亡的影响,通过收集屠宰场卵巢卵母细胞进行体外成熟和体外受精,将假定的受精卵置于含不同浓度EGF(0,25,50和100 ng/mL)的培养液中培养,检查分裂率和囊胚发育率,用细胞凋亡试剂盒(Annexin-V-FluosStaining kit)试剂染色,统计囊胚细胞凋亡率和坏死率。结果表明:50 ng/mL EGF组的孵化囊胚率显著高于对照组(P<0.05),该组细胞凋亡率和坏死率显著低于对照组(P<0.05)。100 ng/mL EGF的卵裂率、囊胚率、D7囊胚率和孵化囊胚率显著低于对照组和其他试验组(P<0.05)。细胞凋亡率和坏死率显著高于其他各组(P<0.05)。提示:一定浓度的EGF可提高囊胚孵化率,并可抑制胚胎细胞的凋亡。     

表皮生长因子、巯基乙醇和亚硫磺酸对山羊体外胚胎生产的影响研究

采用抽吸法收集卵巢上的卵丘 -卵母细胞复合体 (COCs) ,微滴培养法于不同成熟培养液 (n =8)中培养 2 4～ 2 7小时后体外受精 ,然后移入不同胚胎培养液 (n =7)中培养 7天。应用胞核染色、胚胎移植等技术判定并统计成熟率、卵裂率和胚胎发育潜能。结果 :含 5 0ng/mlEGF(表皮生长因子 )组COCs成熟率 (75 4 5 %～ 75 8%)和卵裂率 (72 4 %～ 74.1%)均显著高于其它组 ,含 0 5mmol/LHTAU(亚硫磺酸 )组和或 10 0 μmol/LCYS(β -巯基乙醇 )成熟液组的≥ 8细胞率 (3 2 3 %～ 3 9 0 %)和桑胚率 (2 8 4 %～ 3 3 .8%)均显著高于其它组 (P <0 0 5 )。两只试管羊健康出生。结论 :EGF对COCs体外成熟和卵裂发育具有明显的促进作用 ;CYS对COCs体外成熟和受精卵裂无明显正作用 ,但成熟液含适量CYS有助于改善胚胎的体外发育 ,过量可能对细胞有毒 ;HTAU有益于早期胚胎的体外发育。成熟液中EGF和CYS的优选浓度分别为 5 0ng/ml和 10 0 μmol/L ;胚胎培养液中HTAU的优选浓度为 0 5mmol/L。优化体系所得胚胎具有正常的发育潜能。     

卵泡抑素对牛卵母细胞体外成熟及早期胚胎生长发育的影响

实验通过外源性添加不同浓度的卵泡抑素(FST),研究FST对牛卵母细胞体外成熟和受精卵体外发育的影响。结果表明:在以TCM199为基础培养液的卵母细胞培养体系中添加5、10、20 ng/mL FST对卵母细胞的成熟率无显著影响(P>0.05),但10 ng/mL FST可显著降低囊胚胎率7.5%、5.7%、4.6%(P<0.05)。在共培养体系下的胚胎培养液中添加10、20 ng/mL FST,受精卵的30 h卵裂率和囊胚率显著高于对照组(P<0.05);5、10、20 ng/mL的FST均可以显著提高受精卵的总卵裂率(P<0.05)。     

α-硫辛酸对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的影响

为探究α-硫辛酸（ALA）对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的影响，本实验将不同浓度的ALA(0、10、25、50μmol/L)添加至体外成熟培养液（IVM）和胚胎发育培养基（PZM-3）中培养，体外成熟培养42 h后检测卵母细胞第一极体排出率，统计卵母细胞孤雌激活胚胎48 h和168 h卵裂率和囊胚率，筛选出ALA最佳添加浓度，并通过检测成熟卵母细胞内活性氧（ROS）水平、谷胱甘肽（GSH）含量、体外成熟卵母细胞内的促凋亡基因Bax的mRNA以及抗氧化基因SOD1、CAT的mRNA表达量，分析ALA在卵母细胞成熟中的作用。结果表明：与对照组相比，25μmol/L ALA组提高了猪卵母细胞第一极体排出率（P<0.05），随着ALA浓度增加，卵母细胞的第一极体排出率呈下降趋势，50μmol/L ALA组降低了卵母细胞第一极体排出率（P<0.05）；孤雌胚胎发育能力检测显示，25μmol/L ALA组卵母细胞的卵裂率和囊胚率高于对照组（P<0.05）；与对照组相比，25μmol/L ALA孵育组卵母细胞内ROS水平降低（P<0.05），细胞内GSH含量提高（P<...     

不同培养液对牛卵母细胞成熟及核移植效率的影响

在牛卵母细胞成熟液中分别添加促卵泡素(FSH)10μg/L、胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)10μL/mL、表皮生长因子(EGF)10μg/L,配成3种不同体外成熟液对牛卵母细胞进行成熟培养,结果FSH组卵母细胞成熟率84.2%显著高于ITS组75.9%和EGF组70.2%。卵母细胞成熟后构建牛体细胞核移植胚胎,结果FSH、ITS组卵裂率分别为87.2%、81.9%,显著高于EGF组(73.6%),但三组间囊胚率差异不显著(P0.05)。     

曲古抑菌素(Trichostatin)A对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育能力的影响

曲古抑菌素A（Trichostatin A,TSA）是一种组蛋白去乙酰化抑制剂,用TSA处理鼠核移植胚胎可显著提高胚胎的囊胚率。检验TSA对猪卵母细胞体外成熟以及孤雌胚胎发育的影响。在猪卵母细胞体外成熟液及胚胎培养液中添加TSA,比较不同浓度TSA对卵母细胞成熟的影响,不同浓度TSA对孤雌胚胎发育能力的影响以及TSA处理不同时间对孤雌胚胎发育能力的影响。结果发现：（1）5nmol／LTSA处理对卵母细胞体外核成熟无显著影响,却显著提高了卵母细胞孤雌胚胎的卵裂率和囊胚率（P〈0．05）;（2）50nmol／LTSA处理显著提高了孤雌胚胎的卵裂率及囊胚率（P〈0．05）;（3）50nmol／LTSA处理24h能显著提高胚胎的卵裂率及囊胚率（P〈0．05,82．1％&#177;2．6％和37．4％&#177;3．1％）。结果表明TSA对猪卵母细胞的体外成熟及孤雌胚胎发育具有显著的促进作用。5nmol／L的添加量对卵母细胞的体外胞质成熟具有促进作用;胚胎培养基中添加50nmol／LTSA处理24h能提高孤雌胚胎的发育能力。     

兔卵母细胞体外成熟培养影响因素的研究

试验旨在探讨卵丘细胞包裹层数、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)对兔卵母细胞体外成熟培养的影响。分别采用切割法和针刺挤压法取母兔卵巢表面的卵丘卵母细胞复合体(cumulus oocyte complexes,COCS),将获取的COCS在基础培养液中添加不同浓度表皮生长因子(0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL)及不同浓度的谷胱甘肽(0μmol/mL、0.5μmol/mL、1.0μmol/mL、1.5μmol/mL、2.0μmol/mL)进行体外成熟培养并观察第一极体排出率。结果表明:①手术刀切割法和针刺挤压法平均回收卵母细胞率分别为(22.83、39.29)枚,针刺挤压法显著高于手术刀切割法(P<0.05)。②3层以上卵丘细胞包裹的卵母细胞体外成熟率为81.27%,显著高于1~3层卵丘细胞包裹的体外成熟率63.75%和裸卵细胞体外成熟率23.45%(P<0.05)。③添加20ng/mL的EGF对兔卵母细胞体外成熟培养后成熟率为82.14%,效果最好,且显著高于对照组10ng/mL和30ng/mL EGF组(P<0.05)。④添加不同浓度的谷胱甘肽可以促进和提高兔卵母细胞体外成熟率,其中添加1.0μmol/mL的谷胱甘肽时,卵母细胞成熟率为71.44%,与添加1.5μmol/mL组的相比差异不显著(P>0.05),但显著高于其他组(P<0.05)。结论为添加20ng/mL的EGF和1.0μmol/mL谷胱甘肽,对用针刺挤压法获得3层以上卵丘细胞包裹的兔卵母细胞体外培养效果最佳。     

没食子酸对黄牛卵母细胞体外成熟的影响

试验旨在研究没食子酸(gallic acid,GA)对黄牛卵母细胞体外成熟及早期胚胎发育的影响,进一步优化黄牛卵母细胞体外成熟体系。在卵母细胞体外成熟液(M液)中添加不同浓度没食子酸(0、10、30、50、100μmol/L),成熟22~24h后,统计卵丘扩展情况及卵母细胞成熟率;同时,对成熟的卵母细胞进行正常体外受精(IVF),统计早期胚胎的分裂率、囊胚率、囊胚卵裂球数及卵裂球细胞凋亡率。根据试验结果,选择最优浓度,使卵母细胞在含该浓度没食子酸的成熟液中成熟24h后,检测其细胞内的活性氧水平(ROS)和总谷胱甘肽(TGSH)含量。结果显示,M液中添加30μmol/L没食子酸组卵丘扩展分值和成熟率显著高于对照组(0μmol/L)(P0.05),其他处理组与对照组无显著差异(P0.05);成熟的卵母细胞体外受精后进行后续胚胎培养,其中10和30μmol/L组的分裂率均显著高于对照组和100μmol/L组(P0.05),50和100μmol/L组分裂率较对照组也有所提高,但差异不显著(P0.05);早期囊胚率统计发现,与对照组相比,30和100μmol/L能够显著提高囊胚发育率(P0.05),10和50μmol/L浓度组则无显著差异(P0.05);与对照组相比,30、100μmol/L没食子酸均能显著提高IVF胚胎的早期囊胚卵裂球数(P0.05);但囊胚卵裂球凋亡率与对照组无显著差异(P0.05);对卵母细胞内活性氧和总谷胱甘肽含量检测时,发现30μmol/L没食子酸可显著降低细胞内活性氧水平(P0.05),且显著提高总谷胱甘肽含量(P0.05)。综上所述,在黄牛卵母细胞体外成熟液中添加适量的没食子酸能有效降低卵母细胞内活性氧水平,提高总谷胱甘肽含量,进而提高卵母细胞成熟的质量及其后续IVF胚胎发育能力。     

黄芩苷对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

氧化应激是阻碍胚胎体外发育的重要因素之一,减少氧化应激可能是提高胚胎体外培养效果的途径。本文探讨了不同浓度黄芩苷对小鼠卵母细胞体外成熟及早期胚胎发育的影响,为体外抗氧化性研究及抗氧化物选择提供参考。试验选择4～6周龄雌性昆明小鼠获取GV期卵母细胞,在体外成熟培养液中分别添加不同浓度(0、20、40、60μmol/L)的黄芩苷,经37℃、5%CO₂、饱和湿度培养条件体外成熟12 h,统计卵母细胞第一极体排出率,检测卵母细胞胞质内活性氧(ROS)和还原型谷胱甘肽(GSH)含量以及培养液中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和总抗氧化能力(T-AOC),并采集8～10周龄雄性昆明小鼠精液,进行体外受精(IVF),分别于受精后6、24、96 h统计受精率、卵裂率和囊胚率。结果表明：体外成熟液中添加40、60μmol/L黄芩苷后,卵母细胞第一极体排出率较对照组显著提高(P<0.05),且浓度为40μmol/L极体排出率显著高于60μmol/L,但对成熟后的卵母细胞体外受精率、卵裂率、囊胚率无显著性影响(P>0.05),卵母细胞胞质RO...