奶牛乳房炎耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性及mecA耐药基因分型研究.

为了解奶牛场乳房炎金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)的耐药性,并对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的耐药基因进行研究,本研究采集奶牛场临床型乳房炎奶样89份进行金黄色葡萄球菌分离鉴定及药敏试验,采用K-B法检测其对常用13种抗生素的敏感性;利用双重PCR扩增MRSA的nuc基因和mec A耐药基因;应用基因外重复回文序列(repetitive extragenic palindromic elements,REP)PCR对分离菌株进行基因多样性分析。结果显示,共分离到16株MRSA;在监测的13种药物中,耐药率超过50%的达到10种,其中对头孢曲松(CRO)、头孢噻肟(CTX)、环丙沙星(CIP)和亚胺培南(IPM)耐药率高达93.75%(15/16),但未见对头孢呃酮(SCF)耐药的分离菌株;耐药基因检测结果显示,16株菌中都携带有mec A耐药基因,除1株外其他15株分离菌都携带特异致病nuc基因。REP-PCR把分离菌株分为13种基因型(A-M),同源性≥90%的只有6株菌。研究结果表明,奶牛乳房炎金黄葡萄球菌的多重耐药比较严重,分子多样性复杂,mec A是其耐甲氧西林类药物的重要机制,本研究为MRSA耐药菌的有效检测及奶牛乳房炎的治疗提供了科学依据。     

乳房炎奶牛金黄色葡萄球菌毒素基因的检测及PFGE分型研究

作者针对临床及亚临床乳房炎奶牛乳汁中金黄色葡萄球菌分离株的毒素基因进行检测和脉冲场凝胶电泳(PFGE)基因分型,比较2种类型乳房炎金黄色葡萄球菌分离株的差异.无菌法采集奶样,采用国际标准方法从中分离金黄色葡萄球菌,用多重PCR方法扩增nuc基因和mecA基因以确证金黄色葡萄球菌(SA)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA).进一步用PCR方法检测SA的各种毒素基因(SEs、ETs、TSST 1和PVL基因等).利用限制性内切酶Sma Ⅰ对SA基因组DNA进行酶切和PFGE分析,最后利用BioNumerics软件进行聚类分析.结果:19.3％(23/119)的临床乳房炎奶样和14.8％(26/176)的亚临床乳房炎奶样确定为金黄色葡萄球菌阳性样品,分别从中分离鉴定出43株和26株金黄色葡萄球菌,其中临床乳房炎分离株中有5株为mecA基因阳性.临床乳房炎奶牛奶样中检测到SA的SEA、SEB、SED、SEJ和PVL毒素基因,检出率分别为3.8％(1株)、11.5％(3株)、19.2％(5株)、7.7％(2株)和31.2％(10株);亚临床乳房炎奶牛乳样中仅检测到SA的SEA和PVL毒力基因,检出率分别为7.0％(3株)和84.1％(37株).表明临床与亚临床乳房炎奶牛乳汁中SA菌株携带的毒素基因不一样,SEs可能是临床乳房炎菌株的重要致病基因,PVL可能是亚临床乳房炎菌株的重要致病基因.69株SA使用Sma Ⅰ酶切分型后,可分为7个大簇、50个基因型,来源相同的SA分型后大部分位于同一簇内.临床乳房炎奶牛乳汁中检测到MRSA菌株,PVL基因在亚临床乳房炎中的检出率为临床乳房炎的2.7倍.PFGE方法能较好的区分临床乳房炎和亚临床乳房炎的SA分离菌株.     

甘肃部分地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的细菌多位点序列分型与毒力检测

为研究甘肃地区牛源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的耐药情况、基因型总体结构特征及毒力因子的分布情况,从甘肃省东、中和西部3个地区的3个县市采集41头罹患临床型乳房炎奶牛的93份乳样,采用鉴别培养基分离纯化细菌。采用K-B法对分离株进行耐药性分析,常规PCR方法检测mecA抗性基因和14种常见毒力基因以及多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)。结果显示,93份乳样中分离出28株金黄色葡萄球菌;分离株有不同程度的耐药且多为多重耐药(16株),多重耐药菌株占57.14%,未发现耐万古霉素菌株(VRSA),万古霉素敏感率为100%;28株分离菌中共检出mecA阳性11株,检出率为39.3%;共获得9个已知ST型;有12种毒力基因不同程度被检出,其中nuc、spa和coa检出率为100%,hlb、set1、clfA、FnBPA和seb阳性检出率均大于50%,sak、seg、PVL和sea的检出率依次为28.6%、7.9%、14.3%和21.4%,而FnBPB、hla基因未检出。研究结果可为甘肃省牛源金黄色葡萄球菌的耐药性评价、溯源分析和治疗提供参考依据。     

胸腺嘧啶依赖型金黄色葡萄球菌小菌落突变株的分离鉴定

本试验对由患慢性奶牛乳房炎奶样中分离出的1株疑似金黄色葡萄球菌小菌落突变株(SCVs)进行形态观察、金黄色葡萄球菌相关保守基因片段(nuc、nucA、16S rDNA) 多重PCR扩增鉴定、药敏试验、生理生化特性研究及补偿试验。结果显示分离出1株金黄色葡萄球菌SCVs,该菌含有金黄色葡萄球菌菌种特异性基因nuc和nucA;与金黄色葡萄球菌质控菌株ATCC 25923的抑菌圈大小明显不同;菌落形态主要表现为菌落细小、生长缓慢、溶血能力下降;凝固酶活性下降;耐盐能力降低;革兰氏染色为革兰氏阳性球菌,呈葡萄状排列;补偿试验鉴定该金黄色葡萄球菌SCVs为胸腺嘧啶依赖型。结果表明成功分离鉴定出1株胸腺嘧啶依赖型金黄色葡萄球菌SCVs,为由金黄色葡萄球菌SCVs引起的奶牛慢性乳房炎的预防和控制及其致病机制的研究奠定前期基础。     

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌荚膜多糖主要血清型的鉴定

为了解内蒙古地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌荚膜多糖的主要血清型,试验从内蒙古地区9个牧场共采集236份奶牛乳房炎患牛的奶样,采用常规微生物方法、生物化学反应方法、动物试验和PCR方法对金黄色葡萄球菌荚膜多糖的血清型进行鉴定。结果表明:经常规微生物学检验分离得到162株葡萄球菌,其中金黄色葡萄球菌(S.aureus)124株、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)29株、腐生葡萄球菌(S.saparophytics)9株。动物试验得到116株致病性S.aureus。PCR方法鉴定出荚膜多糖5型S.aureus23株,占致病性S.aureus的19.83%;荚膜多糖8型S.aureus61株,占致病性S.aureus的52.59%;荚膜多糖5型和8型S.aureus占致病性S.aureus的72.41%。说明5型和8型S.aureus是内蒙古地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌荚膜多糖的主要血清型。     

奶牛临床型乳房炎MRSA新疆流行株耐药基因的检测及MLST分型研究

为了解新疆地区奶牛临床型乳房炎MRSA流行株耐药表型、耐药基因分布及分子分型特征,采用纸片扩散法检测了临床分离的71株金黄色葡萄球菌的耐药表型,并对MRSA进行判定;应用多重PCR方法对MRSA流行株进行耐药基因的检测及MLST分型。结果显示,71株金黄色葡萄球菌中共检出13株MRSA,检出率为18.3%。13株MRSA流行株均检出mecA和linA耐药基因,检出率为100.0%;7株检出tetm耐药基因,检出率为53.8%;4株检出msrB耐药基因,检出率为30.8%;4株检出AacA-Da耐药基因,检出率为30.8%;MLST分型结果发现,13株MRSA可分为6种ST型,分别为ST188、ST9、ST63、ST2700、ST968、ST2373,其中ST9型流行较为广泛。本研究为新疆地区奶牛MRSA流行株的耐药特性及分子特征提供了理论基础,为兽医临床合理用药提供了科学依据。     

牛源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分离鉴定

从奶牛分离得到耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methieillin—resistant Staphylococcus aureus,MRSA）。按常规方法复苏菌株,用血浆凝固酶试验鉴定SA。用KB法、琼脂筛选法、生化鉴定法（VITEK32）、聚合酶链反应等鉴定MRSA。常规分离鏊定的葡萄球菌468株,其中凝固酶阴性葡萄球菌（coagulase negative Staphylococcus,CNS）361株,检出率为77．149,6,金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,SA）105株,检出率为22．44％,MRSA36株检出率为34．29％,2株未定型,占0．42％。而MRSA在乳房炎奶样中检出率高达34．29％,表明新疆兵团部分垦区牛场MRSA已经呈蔓延趋势。     

奶牛源MRSA菌株的分离鉴定和耐药性分析

本研究对部分奶牛场采集的502份隐性乳房炎试验（california mastitis test,CMT）检测呈阳性的奶样进行细菌分离、鉴定,运用多重PCR方法筛选出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）,并对分离出的MRSA用纸片扩散法进行药敏试验,检测其对19种抗菌药物的敏感性。结果显示,分离到细菌的奶样有452份,其中检出葡萄球菌338株,MRSA 89株;MRSA分离株主要对万古霉素、磷霉素、氯霉素和克拉霉素敏感,对青霉素、多黏菌素、大观霉素及头孢他啶具有较强的耐药性。本研究为指导奶牛乳房炎用药、MRSA菌株的快速鉴定及制定MRSA感染的防控措施提供参考。     

奶牛源MRSA流行株的耐药特性SCCmecA分型研究

为了了解引起奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌分离株的耐药性及其分子流行病学特征,本研究采用纸片扩散法检测临床分离的71株金黄色葡萄球菌的耐药特性,并对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant staphylococcus aureus,MRSA)进行判定;应用多重PCR方法对MRSA进行SCCmec分型。结果显示:在新疆地区71株金黄色葡萄球菌临床分离株中共检出13株MRSA,检出率为18.3%;金黄色葡萄球菌对呋喃妥因、利福平100%敏感,MRSA对头孢类、氟喹诺酮类和大环内酯类抗菌药物的耐药率明显高于甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin sensitive staphylococcus aureus,MSSA);MRSA的SCCmec基因型共以SCCmecⅠ和SCCmecⅣa型为主,均占76.9%,另外,1株MRSA仅有1种SCCmecⅢ型,1株MRSA有SCCmecⅠ、SCCmecⅢ和SCCmecⅣa型。本研究结果表明,MRSA耐药性多样,新疆地区MRSA主要流行株为SCCmecⅠ和SCCmecⅣa型。     

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌对四环素耐药性分析

为分析奶牛乳房炎中分离的金黄色葡萄球菌(S.aureus)四环素耐药机制,本研究以K-B法和常量肉汤法测定最低抑菌浓度(MIC)值,并对26株奶牛乳房炎S.aureus进行四环素耐药表型检测及加入利血平后的MIC值检测;以PCR检测四环素耐药基因tetM、tetO、tetL和tetK,对扩增产物进行序列分析。检测结果表明:26株菌株中,7株对四环素耐药,19株敏感;利血平能显著降低部分耐药株对四环素的MIC值;在7株耐药菌株中,1株检测出tetM基因,6株检测出tetK基因,没有检测到tetL和tetO基因;tetK基因与S.aureus质粒pT181同源性为100%,tetM基因与转座子Tn916序列同源性为99.9%。实验研究表明,26株奶牛乳房炎S.aureus四环素耐药表型与耐药基因相符,耐药机制以外排蛋白介导为主,并在国内牛源S.aureus中首次检测到tetK基因。     

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的分离鉴定与耐药分析

为了解本地区规模化奶牛场奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的流行与耐药情况，本研究采集了300份奶牛乳房炎奶样，进行金黄色葡萄球菌的分离、培养，利用荧光PCR方法鉴定，同时对分离出的阳性菌株采用纸片扩散法进行耐药性分析。结果表明：从奶牛乳房炎样品中分离出42株金黄色葡萄球菌，分离率为14%；耐药性分析表明分离的金黄色葡萄球菌对青霉素、磺胺异噁唑耐药率超过70%，对庆大霉素、氧氟沙星、头孢哌酮敏感性大于90%。本研究为本地区奶牛乳房炎的防控与临床用药提供了依据。     

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的分离鉴定及毒力基因检测

为研究奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌毒力基因的分布情况,本试验通过MALDI Biotyper系统对分离自3个奶牛场的25株金黄色葡萄球菌进行鉴定及聚类分析,并采用PCR方法对25株金黄色葡萄球菌的nuc、clfA、fnbA、fn-bB、tsst-1、sea、seb和sec等14种毒力基因进行检测。结果显示,25株金黄色葡萄球菌被分为3个类群,各个类群之间及类群内菌株遗传距离较远。14种毒力基因中有7种被检出,检出率分别是nuc(100%)、fnbA (100%)、seg(64%)、clfA(52%)、fnbB(32%)、tsst-1(16%)和sea(4%),其余未检出。结果表明,不同奶牛场甚至同一奶牛场内存在多种金黄色葡萄球菌的流行株,且金黄色葡萄球菌携带毒力基因的数量和种类不同,并存在多种毒力基因组合,为奶牛金黄色葡萄球菌性乳房炎的防治提供基础研究。     

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌8种毒力基因的PCR检测

为研究奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)主要毒力因子的分布情况,本试验利用PCR对70株临床型乳房炎、55株隐性乳房炎金黄色葡萄球菌的8种主要毒力基因进行检测。结果显示,nuc、ClfA、TSST-1、PVL、Hla、Hlb、FnBPA和FnBPB 8种毒力基因在临床型乳房炎SA菌株中的检出率分别为:100.0%(70株)、100.0%(70株)、0(0株)、5.7%(4株)、100.0%(70株)、11.4%(8株)、97.1%(68株)和100.0%(70株);在隐性乳房炎SA菌株中的检出率分别为:100.0%(55株)、100.0%(55株)、0(0株)、70.9%(39株)、98.2%(54株)、9.1%(5株)、100.0%(55株)和100.0%(55株)。结果表明,nuc、ClfA、Hla、Hlb和FnBPA 5种毒力基因是引起奶牛乳房炎的SA的最主要毒力基因;PVL基因可能是引起隐性乳房炎的重要致病基因。     

奶牛乳房炎病原菌多重PCR检测方法的建立

为了同时检测奶牛乳房炎多种病原菌,试验采用金黄色葡萄球菌(S.aureus)nuc基因、牛支原体(M.bovis)oppD/F基因、大肠杆菌(E.coli)16S-23S rRNA基因内转录间隔区作为靶标设计3对特异性引物,在优化单菌退火温度的基础上确定多重PCR的退火温度,建立S.aureus、M.bovis和E.coli的多重PCR检测方法,验证多重PCR的重复性、特异性、敏感性及实用性。结果表明:基于单一PCR三者共同的最佳退火温度(55.3℃、56.5℃、57.8℃)优化多重PCR退火温度,最终确定57.8℃为三者最佳的退火温度。该方法能扩增出长度为237 bp(S.aureus)、333 bp(M.bovis)、634 bp(E.coli)的基因片段;靶标菌特异性扩增而非靶标菌无扩增条带,最低检测浓度分别为S.aureus 1 pg/μL、M.bovis 1 pg/μL、E.coli 100 fg/μL;正常乳样和临床乳房炎乳样均检出S.aureus(25.9%、53.8%)、M.bovis(10.3%、17.9%)和E.coli(32.8%、71.8%),但乳房炎乳样的阳性检出率高于正常乳样。说明本研究建立的多重PCR方法特异性和敏感性强、稳定性和实用性高,具有良好的推广应用前景。     

生产群奶牛金黄色葡萄球菌毒素基因检测及PFGE分型研究

隐性乳房炎患牛与健康牛外观无异,不易判断,对奶牛业造成的损失严重.金黄色葡萄球菌是引起隐性乳房炎的重要病原菌,准确判断金黄色葡萄球菌型隐性乳房炎是预防和控制乳房炎的重要途径.目前国际上普遍采用乳中体细胞数(SCC)作为检测隐性乳房炎的主要指标,但是约40％的金黄色葡萄球菌型乳房炎牛乳汁中SCC低于20万/mL.笔者依据相邻两月SCC差值高低,采集两个奶牛场荷斯坦牛生产群第一胎泌乳牛奶样65头份,从中检出有6头份含金黄色葡萄球菌.用PCR方法扩增金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的特异基因nuc和mecA,结果发现,nuc基因检出率为100％(12/12),未检测到mecA基因.进一步用多重PCR方法检测金黄色葡萄球菌各种毒素基因,其中PVL基因在高SCC与低SCC奶样中的检出率分别为33.3％和100％,差异显著,这可能与PVL破坏白细胞有关.PFGE分型结果表明,所检测到的金黄色葡萄球菌可分为4个簇、5种类型,其中P2型(PVL)为流行株.结果提示,在荷斯坦牛生产群中,如果奶牛产奶量有所下降而SCC也不高时,应辅以分子检测手段来判断是否患有金黄色葡萄球菌型隐性乳房炎.     

石河子地区奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌的分离鉴定及耐药性分析

金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的主要致病菌之一,为调查引起新疆石河子地区规模化奶牛场奶牛乳房炎中金黄色葡萄球菌的感染情况及其对常用药物的敏感性,于石河子地区部分奶牛场采集85份临床型或隐性乳房炎奶牛的奶样进行金黄色葡萄球菌的分离、鉴定及耐药性试验。结果表明:从85份奶样中分离到9种共计127株细菌,经选择性培养基培养、生化试验和16S rRNA PCR鉴定,其中60株为金黄色葡萄球菌,占47.24%;还有腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌属、假单胞杆菌属、肠球菌属等。药敏试验结果表明:所有菌株对杆菌肽、青霉素、头孢氨苄和强力霉素高度耐药,耐药率分别为100%、71.67%、66.67%和76.67%;对氯霉素、氟苯尼考和阿米卡星的敏感率分别达80.00%、83.33%和66.67%;除此之外也有一些菌株对新霉素表现为既不明显耐药也不敏感现象。     

新疆、内蒙古部分地区乳房炎奶样中金黄色葡萄球菌的流行性与耐药性分析

为确定患乳房炎奶牛乳中金黄色葡萄球菌的流行性和耐药性状况,试验自2018年4月至2018年5月采集了新疆地区70例和内蒙古地区50例患乳房炎奶牛生鲜乳样。通过对奶样中金黄色葡萄球菌进行增菌培养、分离纯化,KB纸片扩散法药敏试验及PCR耐药基因检测发现,新疆和内蒙古地区奶样中金黄色葡萄球菌分离率分别为28.6%和54.0%;新疆地区分离的金黄色葡萄球菌菌株对青霉素G的耐药性最高(75.0%),其次是磺胺异噁唑(60.0%)、林可霉素(55.0%);内蒙古地区的金黄色葡萄球菌菌株同样对青霉素G高度耐受,耐药率为70.4%,其次为林可霉素(63.0%)、克林霉素(51.9%);两地区所分离菌株中,88.9%以上携带多种耐药基因,呈现多重耐药性;两地区所检出的高频耐药基因分别是新疆地区的ermA(30.0%)、dfrS1(30.0%)基因和内蒙古地区的lnuA(46.2%)基因。     

新疆、内蒙古部分地区乳房炎奶样中金黄色葡萄球菌的流行性与耐药性分析

为确定患乳房炎奶牛乳中金黄色葡萄球菌的流行性和耐药性状况,试验自2018年4月至2018年5月采集了新疆地区70例和内蒙古地区50例患乳房炎奶牛生鲜乳样。通过对奶样中金黄色葡萄球菌进行增菌培养、分离纯化,KB纸片扩散法药敏试验及PCR耐药基因检测发现,新疆和内蒙古地区奶样中金黄色葡萄球菌分离率分别为28.6%和54.0%;新疆地区分离的金黄色葡萄球菌菌株对青霉素G的耐药性最高(75.0%),其次是磺胺异噁唑(60.0%)、林可霉素(55.0%);内蒙古地区的金黄色葡萄球菌菌株同样对青霉素G高度耐受,耐药率为70.4%,其次为林可霉素(63.0%)、克林霉素(51.9%);两地区所分离菌株中,88.9%以上携带多种耐药基因,呈现多重耐药性;两地区所检出的高频耐药基因分别是新疆地区的ermA(30.0%)、dfrS1(30.0%)基因和内蒙古地区的lnuA(46.2%)基因。     

牛奶源金黄色葡萄球菌耐药基因分布特征的研究

研究旨在了解江苏省牛奶源金黄色葡萄球菌分离株中抗生素耐药基因的分布特征。经耐热核酸酶基因(nuc)和甲氧西林耐药决定子A基因(mec A)的PCR检测,78个牛奶源菌株中18株为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA),60株为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)。采用PCR方法检测了所有菌株中氨基糖苷类耐药基因aac(6')/aph(2″)、aph(3')-Ⅲ和ant(4',4″),大环内酯类耐药基因erm A、erm C和msr A,四环素类耐药基因tet M和tet K,上述8种耐药基因的检出率分别为32.1%、20.5%、41.0%、16.7%、44.9%、12.8%、29.5%和28.2%。除erm C在MSSA菌株中的检出率高于MRSA菌株之外,其余7种耐药基因的检出率均为MRSA菌株显著高于MSSA菌株。MRSA菌株携带2种及以上耐药基因的百分率较MSSA菌株高,MRSA菌株多重耐药情况更加普遍。     

牛源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测

本研究旨在了解甘肃地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的耐药性和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的感染情况,为奶牛乳房炎的防制提供理论依据。采用KB纸片扩散法,检测17株金黄色葡萄球菌对8种不同抗菌药物的敏感性;再用琼脂稀释法检测了苯唑西林、万古霉素对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MICs);头孢西丁纸片扩散法和PCR扩增特异性mecA耐药基因对所有受试菌株进行全面的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测。结果表明,菌株对青霉素、磺胺异恶唑具有较强抗性,而对环丙沙星、头孢唑啉、万古霉素和苯唑西林全敏感;头孢西丁纸片扩散法未能检测出表型为MRSA的阳性菌株,而PCR方法却检测出8株mecA基因阳性菌株,且这些菌株的苯唑西林MIC均小于2 μg/mL。菌株的耐药情况较严重,对甲氧西林敏感而携带mecA基因的菌株高频存在于被调查地区的奶牛场中。