漏芦乙醇提取物对奶牛乳腺上皮细胞泌乳信号通路的影响

为了探讨漏芦乙醇提取物对奶牛乳腺上皮细胞泌乳信号通路的影响,试验以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型,先利用CASY细胞活力分析仪检测漏芦乙醇提取物(质量浓度分别为25,50,100,200,400μg/mL)作用于奶牛乳腺上皮细胞后乳腺上皮细胞的活力和增殖能力,选择添加对细胞生长增殖不受抑制即对细胞无毒性的漏芦乙醇提取物浓度来研究其对奶牛乳腺上皮细胞泌乳信号通路信号分子表达的影响。采用确定浓度的漏芦乙醇提取物处理细胞,然后用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测奶牛乳腺上皮细胞泌乳信号通路关键信号分子信号转导与转录激活因子5(STAT5)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、胆固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)、过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ)、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)和葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)基因的mRNA表达水平,以及采用Western-blot技术检测奶牛乳腺上皮细胞泌乳信号通路关键信号分子的蛋白质表达水平。结果表明:较高剂量(200,400μg/mL)的漏芦乙醇提取物显著抑制了奶牛乳腺上皮细胞活力及增殖能力(P0.05),因此选择25,50,100μg/mL的漏芦乙醇提取物来研究其对乳腺上皮细胞泌乳信号通路信号分子表达的影响;25,50,100μg/mL的漏芦乙醇提取物可显著提高细胞泌乳信号通路信号分子STAT5、mTOR、SREBP1、AKT1、GLUT1基因的mRNA表达水平(P0.05)及p-STAT5、p-mTOR、SREBP1、p-AKT1、GLUT1蛋白质表达水平(P0.05),但对PPARγ基因的mRNA表达及蛋白质的表达无显著影响(P0.05)。说明漏芦乙醇提取物能通过调节泌乳信号通路关键信号分子的表达,进而促进奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白、乳脂和乳糖的合成。     

双向电泳分析蛋氨酸对奶牛乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质的影响

为了寻找奶牛乳腺上皮细胞核中与乳蛋白合成相关的重要蛋白质,从翻译水平揭示乳蛋白合成的机理,本试验应用双向凝胶电泳技术和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)的方法,分析添加蛋氨酸后奶牛乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质的变化,并采用Western blotting验证。质谱分析鉴定出5个表达上调的细胞核磷酸化蛋白质,分别是葡萄球菌核酸域包含蛋白质1、甘氨酰-tRNA合成酶、Septin-6、Twinfilin-1和延长因子1-beta,这些蛋白质的功能涉及DNA转录、mRNA翻译、蛋白质合成、细胞分裂、细胞形态发生及细胞周期的调控。     

健康奶牛与临床型乳腺炎奶牛乳腺核蛋白组差异表达分析

亚细胞蛋白质组的优点在于对低丰度蛋白的研究,运用亚细胞蛋白质组学的研究策略,可以提高低丰度蛋白质在双向电泳中的检出数量.通过分析奶牛乳腺炎乳腺与正常乳腺核蛋白组差异表达情况,为奶牛乳腺炎发病机理研究寻找尽可能多的生物标记分子.经超速离心法分离细胞核,双向凝胶电泳分离蛋白,用PDQuest7.4软件分析寻找差异蛋白质斑点,高效液相色谱串联离子阱质谱鉴定蛋白质.从核蛋白组2-DE图谱中筛选出22个差异表达的蛋白质斑点,质谱鉴定出17个差异表达的蛋白质,2个蛋白质在乳腺炎发病过程中下调,7个上调,5个只在正常情况下表达,3个只表达在乳腺炎组织中,筛选出的差异表达蛋白质涉及细胞骨架构成、代谢调节及凋亡调控等许多方面.表明奶牛乳腺炎发生时乳腺组织核结构和代谢状态都发生了的变化.     

健康奶牛与临床型乳腺炎奶牛乳腺线粒体蛋白组差异表达分析

运用亚细胞蛋白质组学的研究策略,分离纯化亚细胞结构再进行蛋白质组学研究,可提高低丰度蛋白在双向凝胶电泳中的检出率。通过对比分析乳腺炎奶牛乳腺与正常奶牛乳腺线粒体蛋白质组的表达变化,为奶牛乳腺炎的生物学治疗及抗病育种工作筛选出目基因和蛋白。超速离心法分离线粒体,双向凝胶电泳分离蛋白,PDQuest7．4软件分析差异蛋白斑点,高效液相色谱串联离子阱质谱鉴定差异蛋白。从奶牛乳腺线粒体蛋白2-DE图谱中筛选出17个差异表达的蛋白质斑点,质谱鉴定出17个差异表达蛋白（6个蛋白在奶牛乳腺炎发生过程中下调,8个上调,1个只在正常情况下表达,2个只在乳腺炎乳腺组织中表达）。筛选出的差异蛋白质涉及到细胞的能量代谢、蛋白质合成、mRNA的加工成熟及调亡调控等许多方面,表明奶牛乳腺炎发生时乳腺线粒体组织结构和代谢状态都发生了明显的变化。     

胰岛素、催乳素和氢化可的松对奶牛乳腺上皮细胞增殖和凋亡的影响

本研究旨在探讨胰岛素(A)、催乳素(B)和氢化可的松(C)三种泌乳激素对奶牛乳腺上皮细胞增殖和凋亡的影响。将正常的荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞进行体外培养,采用L9(34)正交试验设计,以无血清无激素培养基作为对照,研究了在培养液中添加不同浓度的三种泌乳激素组合对奶牛乳腺上皮细胞增殖和凋亡的影响。结果表明,泌乳激素的添加能够促进奶牛乳腺上皮细胞的增殖,48 h之前,A2B3C1组合最有利于奶牛乳腺上皮细胞的增殖,60 h之后最优组合为A3B2C1即50 ng/mL催乳素、500 ng/mL胰岛素和0.1 ng/mL氢化可的松,三种激素对试验结果影响的主次顺序为A>C>B;泌乳激素对奶牛乳腺上皮细胞凋亡的影响不大,但A1B2C2,即500 ng/mL催乳素、50 ng/mL胰岛素和0.1 ng/mL氢化可的松组能减少凋亡细胞数量。说明,在正常的奶牛乳腺中,泌乳激素主要是通过促进奶牛乳腺上皮细胞的增殖为进一步的泌乳和乳品质的提高奠定坚实的生理基础。     

胰岛素、催乳素和孕酮对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的影响

具有泌乳功能的乳腺上皮细胞系可作为乳腺发育学、乳腺病理学、泌乳生物工程学研究的细胞模型,本研究测定了激素对奶牛乳腺上皮细胞系泌乳功能的影响,为阐述泌乳机制提供工作基础。应用HPLC方法对体外培养奶牛乳腺上皮细胞的酪蛋白和乳糖的分泌情况和细胞培养液中的酪蛋白、乳糖含量进行测定,以确定胰岛素、催乳素和孕酮处理后的奶牛乳腺上皮细胞的泌乳功能。试验结果表明：奶牛乳腺上皮细胞具有酪蛋白和乳糖的分泌能力,在72h内,随着细胞培养时间延长,胰岛素处理组细胞中的酪蛋白和乳糖的升高趋势不明显,孕酮处理组升高趋势较明显,催乳素处理组升高趋势很明显;胰岛素处理组、催乳素处理组和孕酮处理组细胞培养液中酪蛋白升高趋势均很明显,乳糖含量均很高,三组激素比较而言,胰岛素处理组乳糖含量最高。此外,三组激素对乳腺上皮细胞活力影响均很大,在72h之内,总体变化为：催乳素处理组和孕酮处理组细胞活力均升高,胰岛素处理组细胞活力下降。     

奶牛乳腺上皮细胞的原代培养及其生物学特性分析

旨在从奶牛乳腺组织中分离原代乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells,BMECs）并传代培养后探究其生物学特性。本研究从屠宰场采集健康泌乳奶牛乳腺并采用改进的酶消化法从乳腺中分离得到原代奶牛乳腺上皮细胞,通过形态学观察、免疫荧光以及染色体核型分析的方法对其进行鉴定。同时,研究第3、第6和第9代乳腺上皮细胞的生长曲线、群体倍增时间和冻存复苏活力,检测不同代次细胞分泌乳蛋白、乳脂、乳糖的功能及泌乳相关基因的表达。结果表明,所分离的奶牛乳腺上皮细胞纯度较好,细胞生长呈现S型,3个代次细胞的群体倍增时间依次为34.87、41.45和65.04 h,冻存复苏活力为88%~93%;在细胞分泌功能方面,诱导培养2 d后均能检测到酪蛋白、甘油三酯和乳糖,且各代次间无显著差异;此外,3个代次的细胞诱导后均能表达乳成分合成相关基因。本研究成功培养了原代奶牛乳腺上皮细胞,并证明直到第9代细胞仍然具有正常的生物学功能,为体外探究乳腺细胞增殖与分化机制提供了良好的试验材料和技术支撑。     

奶牛乳腺上皮细胞原代培养、纯化及鉴定技术研究进展

奶牛乳腺上皮细胞不仅具有合成和分泌乳汁的功能,而且在乳腺的先天免疫中扮演着重要角色,对泌乳机制、乳房炎发病机制的研究,以及药物筛选具有重要意义。原代培养的奶牛乳腺上皮细胞适宜建立细胞模型,可作为生理、病理、药理等方面研究的良好介质,解决体内试验周期长、成本高、个体差异大的难题。作者主要从奶牛乳腺上皮细胞原代培养的发展历程、培养技术、纯化技术及鉴定方法等方面的最新研究情况进行综述,以期为奶牛乳腺上皮细胞培养相关研究提供参考。     

雌激素处理的奶牛乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质组学分析

雌激素调节多种生理过程,包括乳腺生长发育、形态发生、增殖和分化及乳蛋白的表达。许多磷酸化蛋白调节乳蛋白合成,如磷酸化Stat5和mTOR,但在乳蛋白合成的转录和翻译后水平的调节鲜有报道。为了阐述雌激素在奶牛乳腺上皮细胞中的作用机制,本试验利用双向电泳和质谱分析,鉴定了雌激素调节的细胞核磷酸化蛋白质。在雌激素处理24h后,鉴定出7个表达上调的蛋白质,包括以前报道过的甘氨酰-tRNA合成酶,属于氨基酰-tRNA合成酶家族Ⅱ;这些蛋白质涉及翻译起始因子、GTP结合的核蛋白、热休克蛋白、泛素-蛋白酶体系统。这些筛选出来的蛋白质,揭露了雌激素影响奶牛乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质,为进一步研究乳合成的分子机制提供一个新的途径。     

奶牛乳腺中4F2hc基因的表达模式及亮氨酸对其表达的调控研究

为了研究4F2hc在奶牛乳腺中的表达模式及调控方式,进一步明确氨基酸在奶牛乳腺上皮细胞中的跨膜转运过程,本研究采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术检测了4F2hc在泌乳期和干奶期奶牛乳腺组织中的表达变化;在体外培养的泌乳期奶牛乳腺上皮细胞中添加亮氨酸,采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术检测其对奶牛乳腺上皮细胞中4F2hc表达的影响;采用雷帕霉素抑制剂抑制mTOR信号通路,使用Western blotting方法检测mTOR信号抑制后奶牛乳腺上皮细胞中4F2hc表达以及乳蛋白合成的变化。结果显示,在泌乳期的奶牛乳腺组织中4F2hc的mRNA和蛋白表达水平均显著或极显著高于干奶期(P0.05,P0.01);在体外培养的奶牛乳腺上皮细胞中添加亮氨酸可以极显著提高乳腺上皮细胞中4F2hc的mRNA和蛋白质表达水平(P0.01);亮氨酸刺激可以激活细胞内的mTOR信号通路(P0.05),而雷帕霉素处理则可以显著抑制mTOR信号分子的磷酸化并极显著抑制亮氨酸诱导的4F2hc的表达(P0.05,P0.01),进而极显著抑制β-Casein的合成(P0.01)。以上研究结果表明,4F2hc基因的表达与奶牛乳腺的泌乳活性之间呈正相关,亮氨酸可以通过激活mTOR信号通路来调节4F2hc基因的表达,进而影响乳蛋白的合成。     

Study on Expression of SYK in Dairy Cow Mammary Gland

To investigate the relationship between the expression of SYK and dairy cow mammary gland development and lactation, the expression of SYK in lactating dairy cow mammary gland with high or low quality milk and dry period Holstein dairy cow mammary gland was detected by Western blotting and laser confocal microscope.The results showed that SYK expression in dry period mammary gland was significant higher than that in lactating mammary gland (P<0.05).There was no SYK differential expression detected between lactating mammary gland with high quality milk and low quality milk (P>0.05).SYK was mainly located in the cytoplasm of ductal epithelial cells in dry period mammary gland.In lactating mammary gland, SYK was existed in acinar epithelial cells.All these results revealed that SYK was a regulator in mammary epithelial cell proliferation and differentiation.It participated in mammary gland reconstitution in dry period.     

脾源性酪氨酸激酶基因在奶牛乳腺中的表达研究

为探讨脾源性酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,SYK)的表达与奶牛乳腺发育和泌乳功能之间的关系,试验采用Western blotting和激光共聚焦显微技术对泌乳期高乳品质、低乳品质及干乳期的中国荷斯坦奶牛乳腺组织中SYK的表达含量和表达部位的变化进行研究。结果表明,干乳期奶牛乳腺组织中SYK的表达显著高于泌乳期奶牛乳腺组织(P<0.05),泌乳期高乳品质、低乳品质奶牛乳腺组织中SYK的表达差异不显著(P>0.05);在干乳期SYK主要在乳腺导管上皮细胞的胞质中表达,而在泌乳期SYK在腺泡上皮细胞中表达。结果提示SYK是乳腺上皮细胞增殖与分化的调节因子,主要参与干乳期乳腺组织的重建过程。     

Expression of parathyroid hormone-related protein (PTHrP) mRNA in mammary gland of periparturient cows

The expression of parathyroid hormone-related protein (PTHrP) mRNA was examined in mammary gland with or without lactation, and during periparturient period in a Holstein cow and a Jersey cow. In the lactating mammary gland, PTHrP was detected in alveolar epithelial cells and the lumen by immunohistochemical analysis. The relative expression levels of PTHrP mRNA in mammary gland from lactating cows were significantly higher than those from non-lactating cows (P<0.05). During periparturient period, relative PTHrP mRNA level was remarkably low before the parturition in a Jersey and a Holstein cow, however, both levels were gradually increased and reached a peak level at 5-6 weeks after the parturition. In addition, the peak level in a Jersey cow was approximately 3-fold higher than that in a Holstein cow. From these results, PTHrP was synthesized and secreted in alveolar epithelial cells in mammary gland and increased subsequently with the lactation, suggesting a possible mechanism for the regulation of local calcium homeostasis.     

双向电泳检测奶牛乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质方法的建立

为研究不同激素或营养素对乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质的影响,本实验建立细胞核磷酸化蛋白质提取方法及双向电泳实验技术。结果表明,细胞核磷酸化蛋白纯化结合双向电泳技术是乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质组学研究的有效方法,可为进一步研究乳腺上皮细胞机理提供技术基础。     

IGF-Ⅰ在奶牛乳腺的表达及其对乳腺上皮细胞泌乳功能的影响

为研究IGF-Ⅰ表达和奶牛乳腺发育与泌乳之间的关系,采用qRT-PCR检测奶牛乳腺组织中IGF-Ⅰ的表达情况,应用细胞培养、qRT-PCR、MTT法检测IGF-Ⅰ对奶牛乳腺上皮细胞的影响。结果显示,在青春期奶牛乳腺组织中IGF-Ⅰ的表达量最高;添加IGF-Ⅰ后,乳腺上皮细胞IGF-ⅠR表达增加,细胞增殖能力提高,β-酪蛋白表达增加。研究结果表明,IGF-Ⅰ可通过促进IGF-ⅠR的表达,从而促进乳腺上皮细胞增殖和提高乳中β-酪蛋白含量。     

王不留行增乳活性单体对奶牛乳腺上皮细胞增殖及泌乳性能的影响

应用CASY细胞分析仪及HPLC分别检测王不留行邻苯二甲酸二丁酯对乳腺上皮细胞增殖、细胞活力及乳腺上皮细胞分泌β-酪蛋白、乳糖的影响,研究王不留行增乳活性单体邻苯二甲酸二丁酯对奶牛泌乳中期乳腺上皮细胞增殖和泌乳性能的影响。试验结果表明,王不留行增乳活性单体成份邻苯二甲酸二丁酯对奶牛乳腺上皮细胞的增殖和细胞活力提高均显著(P0.05);能显著提高乳腺上皮细胞β-酪蛋白的表达(P0.05),也能提高乳糖的分泌(P0.05,P0.05)。因此,王不留行增乳活性单体邻苯二甲酸二丁酯可显著提高乳腺上皮细胞的增殖和泌乳能力。     

奶牛乳腺免疫细胞防御机理研究进展

奶牛乳腺中的初级吞噬细胞、嗜中性粒细胞(PMN)和巨噬细胞构成了抵御病原体入侵的第1道防线。在健康奶牛的乳腺中,巨噬细胞占主导地位且充当哨兵的角色。当病原体侵入乳腺时,巨噬细胞及乳腺上皮细胞就会释放出直接将PMN迁移到该区域的趋化剂,使PMN从循环中迅速流入并吞噬和杀灭细菌,起到保护的作用。抵御病原体入侵的第2道防线是由记忆细胞和免疫球蛋白组成的网络,它们与第1道防线相互作用。随着分子生物学技术的发展,更好地了解炎症反应的调节机制可为研究和调节宿主与病原体的相互作用提供理论基础,因此本文就奶牛乳腺免疫细胞防御机理的研究进展进行了综述。     

环状RNA Circ0000316在大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎症模型中的表达研究

奶牛乳腺炎是奶牛场的多发病和常发病,在世界各地的养殖场均有很高的发病率。环状RNA(circular RNA,circRNA)作为近年来被广泛研究的非编码RNA在奶牛乳腺炎发生过程中也发挥了一定的作用。采集患有乳腺炎的奶牛乳腺组织和健康乳腺组织检测circ0000316的表达量,同时采用大肠埃希氏菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)刺激奶牛乳腺上皮细胞,建立奶牛乳腺上皮细胞炎症模型,检测炎症模型中circ0000316的表达量。结果显示,成功建立了奶牛乳腺上皮细胞炎症模型,且circ0000316在奶牛乳腺炎组织和奶牛乳腺上皮细胞炎症模型中均呈现低表达,为研究circRNA在乳腺炎发生过程中的作用奠定了基础。