重组rSD01H9N2禽流感病毒感染A549细胞及其诱导的免疫反应

为了解禽流感病毒(AIV)与其他病毒重组带来的风险,本试验利用反向遗传技术,以H9N2A/Chicken/Shandong/01/2008(SD01)株为骨架,将其PA基因替换为H1N1A/swine/Shandong/07/2011(SD07)株的PA基因,构建了1株重组病毒rSD01-PA。以A549细胞为模型,感染H9N2AIV SD01及其重组株rSD01-PA。通过间接免疫荧光(IFA)和荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法,检测H9N2AIV及其重组株在A549细胞上的复制情况,以及4种模式识别受体(TLR-3、TLR-7、RIG-I和MDA-5)和4种细胞因子(IFN-β、IL-6、MX和OAS)。结果显示:SD01和重组株rSD01-PA在A549细胞上均能有效复制,且重组株rSD01-PA复制能力较强。同时2株毒均能引起4种模式识别受体和4种细胞因子显著上调。在病毒感染的过程中,rSD01-PA感染A549细胞引起的炎性细胞因子IFN-β、IL-6和MX的表达水平较SD01更高。本试验结果将有助于进一步认识H9N2亚型AIV与其他病毒重组带来的风险以及病毒感染后宿主的防御机制及感染反应。     

利用CRISPR/Cpf1技术构建HEK293细胞DDX21基因稳定敲除株及功能鉴定

利用CRISPR/Cpf1基因编辑技术构建DDX21基因稳定敲除的细胞株,并检测其生物学功能。设计、构建靶向DDX21基因向导RNA表达载体,与Cpf1表达载体共转染HEK293细胞,通过流式筛选、基因测序、Western blot和细胞增殖能力检测鉴定细胞株;荧光定量PCR检测病毒感染后模式识别受体(TLR-3、TLR-7、MDA-5)、Ⅰ型干扰素、IL-6以及抗病毒蛋白OAS mRNA水平表达情况。结果显示:成功筛选到2株DDX21基因敲除的细胞株,蛋白免疫印迹显示DDX21蛋白不表达;与野生型(wild type,WT)相比敲除株形成细胞单层的时间明显延长(P<0.01);H9N2亚型禽流感病毒感染试验表明,模式识别受体TLR-3、MDA-5的mRNA表达水平上调,TLR-7表达水平无明显差异,IFN-α、IFN-β、IL-6及抗病毒蛋白OAS的mRNA表达水平下调,表明DDX21基因敲除阻断了DDX21-TRIF-MyD88信号通路;TCID_(50)测定结果显示,差异最高可达到WT的3.01倍,表明DDX21基因敲除后流感病毒复制增加。本研究利用CRISPR/Cpf1系统获得2株DDX21基因稳定敲除的HEK293细胞株,为深入研究DDX21基因功能、病毒感染的天然免疫应答和调控研究奠定理论基础。     

两种中药制剂对IPEC-1细胞因子表达的影响

为研究戈戈健和本草劲方对猪肠上皮细胞因子表达的影响,本实验分别以200μg/m L的戈戈健和500μg/m L的本草劲方溶液处理猪肠上皮细胞,培养后收集细胞,提取总RNA,反转录成c DNA,通过荧光定量PCR测定各种相关细胞因子m RNA表达水平。结果显示,戈戈健能显著上调IFN-β(P0.05)、IL-6(P0.05)、IL-8(P0.01)、TNF-α(P0.05)和TGF-β(P0.05)m RNA表达水平;本草劲方能显著上调IFN-α(P0.05)、IFN-β(P0.01)和TGF-β(P0.05)m RNA表达水平,显著下调IL-6(P0.05)和TNF-α(P0.01)m RNA表达水平。表明这两种中药制剂均能通过诱导I型干扰素产生而发挥抗病毒作用;戈戈健能通过促进抗炎因子IL-6、IL-8和TNF-α分泌来增强细胞免疫,同时上调抑炎因子TGF-β表达来防止过度炎症;本草劲方能抑制促炎因子IL-6和TNF-α的产生并促进抑炎因子TGF-β的分泌,从而增强细胞的抗炎能力。本研究为戈戈健和本草劲方用于预防和治疗猪场病毒病提供了理论依据。     

猪圆环病毒2型感染猪皮肤源树突状细胞炎性反应能力的变化

用PCV2 B1株经鼻腔接种40日龄SPF仔猪,于接种后3、7、14 d宰杀,收集皮肤源树突状细胞(DC).利用实时荧光定量PCR技术对感染仔猪皮肤源DC的IL-10、TNF-α、IFN-α、IL-8、趋化因子受体1(CCR1)、CCR5在mRNA转录水平的变化进行定量分析.结果表明,IFN-α在接种后3 d(3DPI)显著下调(P＜0.05),TNF-α、IL-10在7DPI时显著上调(P＜0.05);趋化因子IL-8在3、7、14 DPI时均下调,差异接近显著;MCP-1在感染后3、14DPI下调,7DPI均上调,但不显著;MIP-1β在3、7DPI明显上调,14DPI恢复正常;趋化因子受体CCR1、CCR5在3、7和14DPI均上调,且7DPI显著上调(P＜0.05).以上结果表明PCV2在感染早期可抑制DC炎性反应的能力,免疫应答失调,影响了动物机体的细胞和体液免疫功能的发挥.     

石膏样小孢子菌感染小鼠的Dectin-1、TLR-2和TLR-4及细胞因子动态变化

本试验旨在研究石膏样小孢子菌经皮肤感染小鼠后皮肤损伤组织中模式识别受体Dectin-1、TLR-2和TLR-4及细胞因子动态变化规律。通过对C57BL/6小鼠皮下接种大熊猫源石膏样小孢子菌,分别在第3、7和14天取病变皮肤组织,经PAS染色和HE染色观察孢子定植部位和病理损伤;分别在第3、6和12小时取病变皮肤组织,用荧光定量PCR检测受体mRNA的转录表达量;分别在第1、3、7和14天取样,用荧光定量PCR检测细胞因子mRNA的转录表达量。结果表明:石膏样小孢子菌感染小鼠后导致皮下脓肿,大量的炎性细胞浸润,并伴有角质层增厚。试验中模式识别受体Dectin-1、TLR-2和TLR-4的转录表达量增加(P0.01),细胞因子IL-6、IL-1β、IL-23、 TGF-β、IL-17A、IL-17F和IL-22的转录表达量增加(P0.01)。模式识别受体通过识别病原菌表面模式识别分子而引发免疫反应。本研究表明,机体感染石膏样小孢子菌后,模式识别受体表达显著增加,并通过识别菌体表面模式识别分子从而激活Th17途径,分化成熟的Th17细胞分泌细胞因子IL-22、IL-17A和IL-17F,从而发挥抗菌作用。     

鳗弧菌免疫诱导牙鲆IL-1β、IFN-γ和TNF-α基因表达变化

黏膜免疫是鱼类免疫系统的重要组成部分。多聚免疫球蛋白受体(p Ig R)能够介导黏膜抗体的转运和分泌,而细胞因子IL-1β、IFN-γ和TNF-α对p Ig R表达具有调节作用。本研究利用实时荧光定量PCR技术(q PCR)测定了牙鲆(Paralichthys olivaceus)组织中TNF-α、IL-1β和IFN-γ基因的表达动态。结果显示:浸泡和腹腔注射两种免疫方式皆可诱导3种基因发生显著上调表达;3种基因的上调表达在96 h内先上升,后降低到对照组水平,其中IL-1β和IFN-γ的上调幅度高于TNF-α,免疫后在牙鲆组织内的表达量分别比对照组高10~60倍和6~30倍,而TNF-α仅比对照组高2~4倍;不同免疫方式诱导的牙鲆各组织中3种基因的应答表达存在差异,浸泡免疫对黏膜免疫组织皮肤和鳃中的基因表达影响较大,显著上调达到峰值的时间短且峰值高,而注射免疫对系统免疫组织脾、头肾以及肝脏中的基因表达影响较大,其中在脾和头肾中注射免疫引起的IL-1β和IFN-γ的变化分别比对照组高50~60倍和30倍,浸泡组比对照组分别高15倍和10倍;前肠、中肠和后肠中,两种免疫方式诱导的3种细胞因子的上调表达量相近或浸泡组稍低。这些结果为进一步研究鱼类细胞因子IL-1β、IFN-γ和TNF-α对p Ig R的表达调节提供了资料。     

不同时间强度冷刺激对大鼠血清中炎症相关细胞因子的影响

将170只SPF级Wistar大鼠随机分为常温对照组及冷刺激试验组,冷刺激试验组又分为急性应激组及慢性应激组.急性冷刺激时间为3、6、12、24 h,慢性冷刺激时间为3、6、9、12d.试验大鼠均于人工气候室中饲养,对照组及冷刺激试验组的饲养温度分别为(24±0.05)C和(4±0.05)C.经不同时间强度的冷刺激后,采用心脏采血,采集大鼠血液,并分离血清,利用Luminex xMAP技术检测大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10以及IP-10的含量.结果显示,冷刺激能够提高各试验组大鼠血清中IL-6的含量,急性应激组与对照组相比TNF-α、IP-10 、L2和IL-4的含量变化水平呈上调趋势,而慢性应激组TNF-α、IL-2和IL4的含量变化呈下调趋势,IFN-γ和IP-10的含量在冷刺激9、12d时显著增强(P＜0.05).研究结果表明,冷刺激能够引起大鼠炎症相关细胞因子以及辅助性T细胞亚群的分泌,随着应激时间的延长,细胞免疫(Th1)向体液免疫(Th2)漂移,从促炎症细胞因子(特点是IL-1和TNF-α的升高)向抗炎症细胞因子(特点是伴随IL-4和IL-10的增强)转化,机体产生细胞免疫并刺激机体产生体液免疫.     

热应激对猪PBMC中NOD样受体及炎性因子mRNA转录水平的影响

NOD样受体是重要的天然免疫识别受体,其与革兰氏阳性菌的肽多糖等配体结合后,能够诱导多种炎性因子的表达,参与多种疫病的调控。为探究NOD样受体是否参与了热应激致病过程,本研究选取2月龄(15±1 kg)土杂猪12头,随机分为对照组和热应激组,并在热应激的第0、7 d、14 d和21 d的4个时间点采集其外周血,分离外周血单核细胞(PBMC)。荧光定量PCR检测了PBMCs中NOD1、NOD2及炎性因子TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10和IL-1βmRNA的转录水平。结果显示,与对照组相比,NOD1和NOD2 mRNA转录水平在热应激的第7 d和14 d显著上调(p0.01),但在第21 d时显著下调(p0.05)。炎性因子TNF-α、IFN-γmRNA转录水平在热应激的第7 d、14 d、21 d显著上调(p0.05),IL-10 m RNA转录水平在热应激的第14 d、 21 d显著上调(p0.05),IL-1βm RNA转录水平在热应激的第7 d和14 d极显著上调(p0.01),在21 d时显著下调(p0.01)。IL-6mRNA转录水平在热应激的第7 d显著上调(p0.05),14 d差异不显著,21 d时极显著下调(p0.01)。研究表明热应激后短期内显著上调猪PBMC中NOD1、NOD2及炎性因子的转录水平,这为进一步阐述热应激的致病过程提供了依据。     

PCV2人工感染对猪肺泡巨噬细胞干扰素信号通路的调控研究

通过建立PCV2亚临床感染模型,探究感染仔猪肺泡巨噬细胞中干扰素的变化及其调控,为PCV2复制和发病机制研究提供补充。30日龄猪圆环病毒2型(PCV2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原和抗体均为阴性的仔猪15头,随机分成PCV2阴性对照0d组、PCV2感染14d组和PCV2感染28d组。感染后荧光定量PCR方法检测肺泡巨噬细胞中干扰素、模式识别受体和模式识别受体接头分子mRNA水平。结果显示,IFN-β和IFN-γmRNA转录水平在14和28d均显著高于对照组(P0.05);模式识别受体RIG-1、MDA-5、TLR4和TLR9mRNA转录水平在14和28d显著升高(P0.05);DAI mRNA转录水平在14d显著升高(P0.05),但28d迅速下降;TLR3、TLR7和TLR8mRNA转录水平无明显变化。接头分子MAVS、MyD88、IRF3和IRF7mRNA转录水平在14和28d均显著高于对照组(P0.05)。以上结果表明,PCV2亚临床感染仔猪后导致肺泡巨噬细胞内IFN-β和IFN-γ的表达量上调,其上调和PCV2激活的TLR4/TLR9/MyD88和RIG-1/MDA-5/DAI/MAVS/IRF3信号通路有关。     

3类CpG ODNs正调节猪IP-10基因的表达研究

CpG ODN诱导不同物种先天性免疫反应的分析结果表明,诱导细胞因子(CK)分布的种类和水平存在明显的异同。试验对3类CpG ODNs(A、B、C类)如何激活猪先天性免疫生物标记及猪免疫细胞在体内外培养(含CpGODNs)中的先天性免疫反应动力学进行了研究。利用实时定量PCR(SYBR Green)分析了细胞因子和趋化因子基因的mRNA表达水平。结果发现,A-类CpG ODN可显著诱发IFN-γ、IL-12(P40)、IL-6、IL-4、TNF-αmRNA的瞬间表达;C-类CpG ODN可显著诱发IFN-γ、IFN-α、IL-12 mRNA的表达,并使IL-4(Th-2型)mRNA降至最低表达水平,GCODNs可刺激使一些细胞因子的表达水平降至最低;B-classGpC ODN7909能显著影响IL-12(P35)mRNA表达水平。值得注意的是,12 h时3类CpG ODNs刺激均可显著诱导IP-10的mRNA表达。体内外试验结果表明,IP-10可作为CpG ODNs诱发猪免疫活性的生物标记。