沙子岭猪GSG1基因克隆、生物信息学分析及组织表达

采用RACE技术克隆猪GSG1(Germ Cell-specific gene 1)基因cDNA1全长并进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR对GSG1基因在沙子岭猪睾丸组织8个不同发育阶段(E90、D1、D30、D60、D90、D120、D150和D180)和30日龄时9个不同组织(睾丸、肌肉、小肠、肺、心脏、肾脏、肝脏、脾脏和脂肪)的表达量。结果表明:GSG1基因cDNA全长为1 257 bp,含1个长993 bp的开放阅读框,编码330个氨基酸。实时荧光定量PCR结果显示,GSG1基因在睾丸组织中的表达量最高,显著高于其余8个组织(P0.05),且其在肌肉、小肠、肺脏、心脏、肾脏和脂肪中的表达水平极低;GSG1基因在睾丸组织的E90、D1、D30和D60这4个发育时期的表达量较低,显著低于D90、D120、D150和D180这4个时期(P0.01)。本试验首次克隆了猪GSG1基因cDNA全长并检测了其在不同组织和不同发育阶段睾丸组织的表达,为进一步研究其调控猪睾丸发育和精子生成的机制奠定了理论基础。     

猪ApoA5基因cDNA的克隆、序列分析及组织表达研究

旨在克隆猪ApoA5基因cDNA全序列,并对其进行序列分析,研究该基因的组织表达规律.试验以山西马身猪肝脏组织为材料,采用RT-PCR与RACE技术,对猪ApoA5基因的cDNA进行克隆,并对其进行了生物信息学分析.采用荧光定量PCR检测并分析了ApoA5 mRNA在2个猪种(马身猪和大白猪)中多个组织的表达规律.结果表明:猪ApoA5基因cDNA全长1 917 bp,包括1 092 bp的开放阅读框(ORF),24 bp的3'-UTR和801 bp的5'-UTR;编码区(CDS)共编码364个氨基酸,与牛、马、人、犬、猴、兔、褐鼠和小鼠氨基酸序列的同源性分别为81.7％、80.0％、78.3％、77.5％、76.5％、73.6％、67.1％和66.7％;ApoA5 mRNA除了在肺脏和脾脏中未检测到外,在其他8种组织中均有表达,其中在肝脏组织中高丰度表达,在皮下脂肪与背最长肌中中等表达,低量表达于小肠、肾脏、心脏、胰脏和胃,并且在皮下脂肪与背最长肌中ApoA5 mRNA的表达量存在显著的品种差异.猪ApoA5基因在动物进化中比较保守,ApoA5 mRNA的表达量受到组织和品种影响,推测ApoA5基因对脂肪沉积性状有一定的影响.     

猪硫辛酸合成酶基因的克隆及组织表达

本试验通过电子延伸及RT-PCR技术克隆猪硫辛酸合成酶(lipoic acid synthase,Lias)基因,并进一步研究了该基因在猪体内组织的表达分布。基于电子延伸序列设计1对引物,成功克隆了猪Lias基因(GenBank登录号:JN797612.1),并进行了序列分析,同时利用RT-PCR方法分析了Lias基因的组织表达规律。克隆的猪Lias基因长度为1119 bp,包括1个完整的开放阅读框,编码372个氨基酸;克隆的猪Lias基因与小鼠、褐鼠、人、牛的核苷酸序列同源性分别为71.5%、69.0%、77.3%、70.4%;推导的cDNA编码区(CDS)的氨基酸序列与小鼠、褐鼠、人、牛的同源性分别为91.5%、79.4%、89.4%、88.2%;构建的系统进化树结果显示,猪与小鼠、褐鼠的亲缘关系最近;组织表达分布结果表明,Lias基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、十二指肠、空肠、直肠、回肠、脂肪、皮肤和肌肉中都有表达;Gel-Pro软件分析结果表明,Lias基因在肾脏和脂肪组织中表达丰度最高,其次是直肠和回肠。     

猪A-FABP基因的克隆及其组织差异性表达

为了进行猪A-FABP基因的克隆及不同器官组织中的差异表达,试验采用RT-PCR方法从长白猪背最长肌中克隆A-FABP基因的cDNA序列并进行测序比对,分别与人、牛、山羊、家鼠及鸡进行同源性比较,应用半定量RT-PCR方法检测猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、腿肌中A-FABP基因的表达。结果表明:成功克隆得到A-FABP基因的cDNA序列,且比对结果为100%,该序列与人、牛、羊的同源性分别为90.98%、89.97%、89.97%,与鸡的同源性为73.68%。半定量RT-PCR结果为A-FABP基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、腿肌器官组织中均有表达,其中背最长肌和腿肌中A-FABP基因的表达量最高,肺脏内的表达量最低,A-FABP基因在动物进化中具有高度保守性,该基因在猪不同器官组织中的表达具有差异性。     

猪NMMHC-ⅡA基因功能区的克隆及表达特征分析

为了解NMMHC-ⅡA是否与不同品种猪对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的抗性差异有关,本研究克隆了对PRRSV易感的三元杂交猪(杜大长)、抗PRRSV的我国优良地方品种莱芜猪和大蒲莲猪NMMHC-ⅡA基因中含PRRSV结合区(23个氨基酸)在内的羧基端954 bp的cDNA序列,并分析了其在物种间的同源性和在不同品种间的差别,通过RT-PCR法检测了该基因在猪体内的表达特征.结果表明,NMMHC-ⅡA的cDNA序列在哺乳动物中的保守性较高,猪与人、大鼠、小鼠、牛、猴、狗等物种的核苷酸及氨基酸序列同源性均较高；莱芜猪、大蒲莲猪及杜大长杂交猪NMMHC-ⅡA蛋白羧基端的氨基酸序列完全相同,而NMMHC-ⅡA基因的核苷酸序列有3处不同.猪NMMHC-ⅡA基因在猪肝脏、肾脏、脾脏、肺脏、淋巴结、扁桃体、大肠、小肠、胃和肌肉中均有明显的表达,而在心脏和大脑中有弱表达,在小脑及子宫中几乎检测不到其表达.结果显示,对蓝耳病呈现不同抗性的杜大长杂交猪和莱芜猪、大蒲莲猪NMMHC-ⅡA基因的功能区没有区别,该基因在除小脑和子宫外的多种组织中均表达,NMMHC-ⅡA与猪抗蓝耳病的关系需进一步研究.     

猪INSIG2基因cDNA克隆、序列特征分析及差异表达

为了克隆猪胰岛素诱导2(INSIG2)基因,并对其进行序列特征分析和组织差异表达规律研究,试验提取猪总RNA,反转录c DNA后进行PCR反应,对克隆得到的INSIG2序列进行生物信息学分析,并用实时荧光定量PCR检测INSIG2在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、胃、肾脏、肌肉7个器官/组织中的表达情况。结果表明:试验获得1段998 bp的序列,该片段编码区序列长度为678 bp,编码225个氨基酸。INSIG2蛋白分子质量为24.730 9 ku,理论等电点为8.64,不含信号肽;INSIG2蛋白有较强的疏水性,具有5个跨膜螺旋结构。与其他动物的INSIG2基因氨基酸序列一致性在92%以上。INSIG2基因在7个被检测器官/组织中均有表达,且肺脏中表达量最高,肝脏次之,再次是胃,心脏和肌肉的表达量最低。     

猪糖原合酶激酶3β基因的克隆、染色体定位和组织表达谱分析

糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β, GSK3β)是一种在机体内分布广泛且结构高度保守的丝/苏氨酸蛋白激酶。本研究利用电子克隆的方法克隆了猪GSK3β(sGSK3β)基因的编码区序列;用猪－仓鼠体细胞辐射杂种板(IMpRH)对其进行了染色体定位;用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法,以10个不同组织样品cDNA为模板对sGSK3β的组织表达谱进行了分析。研究结果表明,sGSK3β基因的编码区有1263个核苷酸,编码420个氨基酸,其氨基酸序列与人、大鼠、小鼠和斑马鱼同源性分别为95.6%、98.8%、98.8%、93.3%;sGSK3β基因定位于猪的13q41-46,与标记SW1876紧密连锁。组织表达谱分析结果表明sGSK3β基因在猪的10种组织中存在着表达量的差异,在肝脏和肺脏中高表达,在脂肪、肾脏、脾脏、大脑和小脑中次之,而在心脏、胃和肌肉中只检测到本底表达。     

MC4R基因、SIM1基因在从江香猪不同组织中的mRNA表达规律研究

研究MC4R基因、SIM1基因在从江香猪不同组织中mRNA差异表达规律,探寻影响从江香猪能量代谢和脂肪沉积的数量性状基因座(QTL),为分子标记辅助选择提供依据。研究以从江香猪为试验材料,应用实时荧光定量PCR技术,检测MC4R基因、SIM1基因在从江香猪不同组织的mRNA相对表达量。结果显示,MC4R基因、SIM1基因在从江香猪各组织中均有表达,不同组织之间的相对表达量存在差异,MC4R基因相对表达量依次为:脾脏小肠脂肪肝脏肺胃心脏肾脏背肌,SIM1基因相对表达量依次为:脾脏肾脏脂肪肝脏小肠胃肺心脏背肌。     

猪泛素-B 基因的克隆及组织表达谱分析

从人泛素-B（Ubiquitin B,UbB）基因mRNA序列出发,在猪的ESTs库中进行同源性搜索,通过电子克隆和进一步RT-PCR方法从猪肌肉组织总RNA中扩增出泛素-B基因部分cDNA序列（GenBank登录号：EF688558）,长894bp,其中在89～778bp处包含一个完整的开放阅读框,编码229个氨基酸。猪泛素-B基因由2个外显子和1个内含子构成（GenBank登录号：EF688559）,内含子长657bp,符合GT-AG规则。序列分析结果表明：猪泛素-B基因与已报道的人、黑猩猩、小家鼠、大鼠、鸡等物种的泛素-B基因高度同源,同源性分别为92％、91％、91％、91％、89％,氨基酸序列同源性为100％。半定量RT-PCR结果表明：泛素-B基因在150日龄肥育猪心脏、肝脏、肾脏、小脑中的表达量较高,脾脏、肺脏、胃、膀胱、背最长肌、大脑次之,脂肪和下丘脑中的表达量最低,其在蓝塘与长白猪肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、膀胱、背最长肌等7个组织中的表达量存在差异。     

转抗仔猪腹泻基因α1-盐藻糖转移酶克隆猪的胰岛素样生长因子2表达分析

为探求转基因克隆猪存在早期死亡率高及生长发育异常等原因,本研究首次以转抗仔猪腹泻基因α1-盐藻糖转移酶(fucosyl transferase 1,FUT1)阳性及阴性克隆猪的脾脏、肝脏及腿肌组织为试验材料,利用qRT-PCR技术定量检测影响胎儿及仔猪早期生长发育的印记基因胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2,IGF2)的表达情况,并以普通妊娠分娩猪为对照,分析其差异及变化.结果显示,IGF2基因在3类仔猪中均存在组织表达差异性,其中肝脏组织中表达量最高,腿肌组织中表达量最低.分析发现,IGF2基因在转FUT1阳性克隆猪脾脏组织中的表达量显著高于转FUT1阴性克隆猪(P<0.05),在腿肌组织中则显著低于阴性克隆猪(P<0.05).此外,转FUT1阴性克隆猪的脾脏、肝脏组织IGF2表达量分别极显著低于、高于普通猪(P<0.01).提示IGF2基因的表达变化可能与克隆猪早期生活力弱有关,但与转FUT1基因克隆猪早期死亡率高的关系还需进一步研究.     

鸡β-防御素基因的克隆、序列分析及其在组织中的分布

本研究采用RT-PCR法，分别从鸡肝脏和舌组织中扩增到鸡β-防御素（Gallinacin，Gal）Gal-6、Gal-8与Gal-9基因，经序列测定表明，Gal-6、Gal-8和Gal-9大小分别为201、204和201bp，其成熟肽分别由67、68和67个氨基酸残基组成。组织表达分析表明，Gal-6基因在鸡体内各组织器官中广泛地表达，在鸡皮肤、舌、心脏、小肠、胸肌、肝脏、肾脏、法氏囊、脾脏和胰腺中表达量较高；在肺脏、睾丸和骨髓中也有一定量表达。相比之下，Gal-8在鸡体内的表达较为局限，Gal-8基因仅在舌、小肠、肺脏和肝脏中大量表达。Gal-9基因在鸡体内组织中分布也较广泛，在舌和小肠中大量表达，在气管、肺脏、肝脏、肾脏、骨髓和胸腺有少量表达。     

猪BLM基因N端、C端的克隆及其在不同组织与疾病中的表达分析

为探究猪BLM解旋酶N端、C端的结构功能及其在不同组织和疾病中的相对表达量,本研究采用RT-PCR技术扩增从江香猪BLM基因N端和C端,利用生物信息学软件对克隆所获序列进行分析,同时采用实时荧光定量PCR技术分析BLM基因在猪不同组织及病样中的表达差异。结果显示,试验成功克隆了从江香猪BLM基因N端1 025bp和C端1 300bp序列,与GenBank中猪BLM基因序列(登录号:NM_001123084.1)同源性为100%;生物信息学软件预测显示,猪BLM基因序列长度为4 316bp,包含4 280bp的开放阅读框,编码一个由1 426个氨基酸组成的多肽链;氨基酸序列比对发现,猪BLM基因氨基酸序列与牛的同源性最高(85%);结构域预测表明,猪BLM基因有DEXDc、HELICc、RQC和HRDC 4个结构域;系统进化树分析表明,猪BLM基因与牛亲缘关系最近;实时荧光定量PCR结果显示,以心脏为对照,BLM基因在从江香猪各组织中均有表达,其中在睾丸中的相对表达量最高,其次为肺脏、肝脏、脾脏、心脏、肾脏、小肠和大肠,在睾丸和肺脏中的表达量均极显著高于其他组织(P0.01);BLM基因在患繁殖与呼吸道综合征猪肺脏、患白血病鸡肝脏和患鸭瘟鸭肝脏中的表达水平均极显著或显著高于正常组织(P0.01;P0.05),提示BLM基因的变化可能也会导致动物疾病的发生。本试验结果可为后续畜禽BLM解旋酶原核表达载体的构建及其在重大疾病的发生和预防等研究提供理论依据。     

猪GRP78基因克隆、生物信息学分析及组织表达谱研究

本研究旨在克隆猪葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)基因,并进行生物信息学分析,探讨其在猪不同组织中的表达情况。根据GenBank上公布的猪GRP78基因序列(登录号:XM_001927795.6)设计引物,PCR扩增及测序获得猪GRP78基因CDS序列,使用在线软件分析GRP78的理化性质、跨膜结构、信号肽、疏水性、保守结构域、二级结构和三级结构,并进行同源性比对及系统进化树构建,利用实时荧光定量PCR方法检测猪GRP78基因在各组织中的表达情况。结果显示,猪GRP78基因CDS区长1 965bp,可编码654个氨基酸。生物信息学分析表明,GRP78理论分子质量为72.3ku,等电点(pI)为5.06,半衰期为30h,其水溶液在280nm处的消光系数为30 495,肽链N端为蛋氨酸(Met),不稳定系数为32.39,属于稳定蛋白。脂肪系数为85.40,总平均疏水指数为-0.496,无跨膜结构,存在信号肽序列,说明该蛋白属于分泌型蛋白;GRP78蛋白只包含1个超家族保守结构域:HSP70结构域。蛋白二级结构分析显示,GRP78蛋白中α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别为40.06%、20.49%、8.10%和31.35%。同源性比对结果显示,猪GRP78基因与人(登录号:NM_005347.4)、小鼠(登录号:NM_001163434.1)、大鼠(登录号:NM_013083.2)、山羊(登录号:XM_005687138.3)、牛(登录号:NM_001075148.1)核苷酸序列的同源性分别为93%、91%、90%、95%、95%,氨基酸序列的同源性分别为99%、98%、98%、99%、99%,各个物种之间GRP78基因保守性较高。实时荧光定量PCR结果显示,GRP78基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、胃、卵巢、输卵管、乳腺、小脑、大脑、垂体等组织中均有表达,在心脏、脾脏、肺脏中相对高表达。本研究结果为今后深入研究GRP78基因的生物学功能提供了基础材料。     

猪MyD88基因的克隆及组织表达谱分析

本研究旨在克隆猪MyD88的基因序列,并研究其在不同组织中的表达差异.利用RT-PCR技术从猪肠系膜淋巴结组织总RNA中克隆出猪MyD88的cDNA序列,用相关软件进行了基因结构和功能预测,并利用Real-time PCR技术对MyD88基因的组织表达谱进行了分析.序列分析结果表明克隆到的序列全长为897 bp(EF198416),其882 bp的开放阅读框编码的293个氨基酸残基组成猪髓样分化因子88(MyD88);推导的氨基酸序列分析显示:猪MyD88蛋白具有典型的死亡结构域和TIR结构域,相似性分析结果显示,MyD88在进化过程中具有高度保守性,与人、牛、褐鼠和小鼠的氨基酸序列相似性分别为88.4%、85.7%、78.8%和78.2%;Real-time PCR结果表明:MyD88在11个组织中的相对表达水平存在差异,其在派伊氏小体和肠系膜淋巴结中表达量相对较高,在心脏和肌肉组织中表达量较低.猪MyD88基因的克隆和表达研究为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

CREB-H基因在猪不同组织中表达谱及肝脏中的表达规律

本研究旨在分析环腺苷酸应答元件结合蛋白H(cyclic AMP-responsive element-binding protein 3-like 3,CREB-H)在猪不同组织中的表达谱及其在马身猪和大白猪肝脏中的发育性表达规律。采用实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测1日龄猪12个组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、小肠、小脑、下丘脑、背最长肌、股肌和腰肌)中CREB-H基因的表达谱,以及CREB-H在1、30、60、90、120、150和180日龄马身猪和大白猪肝脏中的表达规律。结果显示,CREB-H基因mRNA在马身猪的12个组织中广泛表达,其中在肝脏和小肠中高表达;CREB-H蛋白在肝脏组织中的表达量显著高于其他组织(P0.05),在心脏、脾脏和小脑中不表达。猪肝脏CREB-H基因mRNA和蛋白的发育表达受日龄、品种、品种与日龄相互作用的影响(P0.01)。马身猪和大白猪肝脏中CREB-H基因mRNA和蛋白的表达量均在1日龄时达到最大值。在各发育阶段,马身猪CREB-H蛋白的表达量均极显著高于大白猪(P0.01),且CREB-H主要在猪肝脏中表达。CREB-H在两猪种肝脏中的表达存在时空差异,可能与猪在不同发育期的脂质代谢能力有关,本试验结果为研究猪的脂质代谢调控机制提供一定的理论依据。     

猪ADAR1基因cDNA全长克隆、序列信息及组织表达分析

旨在克隆猪作用于RNA的腺苷脱氨酶1基因(ADAR1)cDNA全长序列,检测该基因在大白猪不同组织及不同日龄背膘中的表达情况。本研究利用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)克隆大白猪ADAR1基因mRNA全长序列,并对其进行生物信息学分析;采用荧光定量PCR方法检测ADAR1在不同组织中的表达水平,并探究不同日龄背膘中ADAR1的表达规律。结果表明,猪ADAR1基因cDNA全长6259bp,编码1145个氨基酸,与人、黑猩猩、猕猴、长臂猿、黄牛、山羊和绵羊的氨基酸序列一致性均不低于85%。该基因编码的蛋白具有2个Zα结合结构域,3个双链RNA结合结构域和1个脱氨酶结构域。ADAR1在心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、小肠和背部脂肪组织以及7、60、120和180日龄个体背膘组织中均表达,其表达量总体上表现出随个体发育先下降后上升的趋势。综上所述,本研究成功克隆了猪ADAR1基因cDNA全长序列,发现其在猪体内广泛表达,并且在不同日龄猪背膘组织中表达水平存在差异,为今后深入研究ADAR1的功能奠定了理论基础。     

莱芜猪PID1基因的功能分析及表达谱研究

为进一步了解莱芜猪PID1基因的结构和功能,本研究以莱芜猪为试验对象,分析PID1基因的结构和功能,并利用SYBR-Green实时荧光定量PCR方法,分析该基因在莱芜猪10个不同组织(心脏、背最长肌、脾脏、肝脏、肺脏、小肠、大肠、脑、脂肪、脊髓)的表达谱信息.生物信息学分析表明:PID1基因编码含217个氨基酸的蛋白,...     

HSL与FAS基因在苏太猪不同组织器官中的表达研究

为了探究HSL及FAS基因在苏太猪不同组织器官中的相对表达水平,试验运用实时荧光定量PCR法检测HSL及FAS基因在苏太猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、皮下脂肪和背最长肌8个不同组织器官中的相对表达量。结果表明:HSL与FAS基因在苏太猪各组织器官中均有一定的表达。HSL基因在皮下脂肪中的表达水平最高,在背最长肌中的表达水平最低,表达水平顺序依次为皮下脂肪肺脏心脏脾脏肾脏肝脏胃背最长肌。FAS基因在皮下脂肪中的表达水平最高,在背最长肌的表达水平最低,表达水平顺序依次为皮下脂肪脾脏肺脏胃肝脏肾脏心脏背最长肌。     

马身猪和大白猪不同组织DECR1基因的表达

旨在研究DECR1基因在猪不同组织和品种中mRNA和蛋白水平的表达规律,探讨该基因与脂肪代谢的关系。以山西马身猪与大白猪为试验材料,提取肝脏、心脏、肾脏、脾脏、肺脏、胃、小肠、皮下脂肪和背最长肌组织的总RNA和总蛋白,应用实时荧光定量PCR技术检测DECR1基因在2个品种各组织中mRNA的相对表达量,采用Western blot技术对各组织中DECR1蛋白进行半定量分析。实时荧光定量PCR结果显示:DECR1基因在各组织中均有表达,组织之间的表达量存在极显著差异(P<0.01),DECR1基因在肝脏、皮下脂肪与心脏中为高丰度表达;在不同品种的皮下脂肪组织中,大白猪DECR1的mRNA表达极显著高于马身猪(P<0.01)。Western blot检测结果显示:DECR1在各组织中均有表达,不同组织的表达量存在极显著差异(P<0.01),在皮下脂肪、肝脏与小肠中高表达;不同品种的皮下脂肪组织中,大白猪DECR1蛋白的表达显著高于马身猪(P<0.05)。猪DECR1基因在不同组织的表达差异可能与脂肪代谢和脂肪沉积有关。     

猪BMP-6基因在不同组织中的表达谱分析

为了研究猪BMP-6基因的组织表达特性,试验采用实时定量PCR技术分析了BMP-6基因在猪脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、小肠、大肠、肌肉、卵巢等11种组织中的相对表达情况。结果表明:BMP-6基因表达谱广泛,其中BMP-6基因在卵巢中的表达量最高,肝脏中的表达量次之,胃和小肠中的表达量最低。说明BMP-6基因可能与繁殖性状相关。