陇东野生紫花苜蓿愈伤组织原生质体游离条件的筛选

以陇东野生紫花苜蓿子叶诱导的愈伤组织为材料,研究了酶解时间、酶液组合、酶液中甘露醇浓度、预处理措施及愈伤组织继代培养时间对其原生质体游离效果的影响.结果表明:当酶解时间为10h、酶液组合为2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%离析酶+0.3%半纤维素酶+0.3%崩溃酶、甘露醇浓度为0.60mol/L、预处理措施为CPW-10溶液中浸泡1h、愈伤继代培养天数为12～14d时,游离出的原生质体产量最高,可达19.5×105个/g,存活率高达89.7%.     

甘农4号紫花苜蓿愈伤组织原生质体游离条件的研究

以甘农4号紫花苜蓿下胚轴诱导所得愈伤组织为材料,研究酶液组合,渗透压调节物甘露醇浓度,酶解时间,愈伤组织继代时间及预处理措施对原生质体游离效果的影响。结果表明:当酶液组合为2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%半纤维素酶,渗透压为0.6mol/L甘露醇,愈伤组织继代培养时间为12d,预处理措施为在CPW-11溶液中预质壁分离1h,酶解时间10～12h时,游离出的原生质体产量最高,可达3.34×106个/g,原生质体活力高达82.8%。     

俄罗斯杂花苜蓿愈伤组织原生质体游离与培养条件的优化

对俄罗斯杂花苜蓿(Medicago varia)原生质体游离和培养条件进行优化,建立其原生质体融合的体细胞杂交体系.以下胚轴诱导所碍愈伤组织为材料进行原生质体游离,研究酶液组合、渗透压调节物甘露醇浓度、酶解时间、愈伤组织继代时间及预处理措施对原生质体游离效果的影响,以及激素浓度与培养密度对原生质体培养的影响.结果表明:最佳酶液组合为2％纤维素酶+0.5％果胶酶+0.3％离析酶,最佳渗透压为0.55mol/L,最佳酶解时间为12h,愈伤组织继代培养至14d的游离性最佳;固—液综合培养条件下最适激素组合为1.5mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA,最适原生质体培养密度为3×10 5个/mL.     

草地早熟禾午夜Ⅱ号原生质体培养及植株再生

对草地早熟禾(Poa Pratensis L.)品种-午夜Ⅱ号进行了原生质体培养及其植株再生的研究。以午夜Ⅱ号成熟种子诱导的松软胚性愈伤组织为材料,利用酶解法分离出大量有活力的原生质体。原生质体经培养,持续分裂形成愈伤组织,并分化出再生绿苗和白化苗。研究了不同酶液组成和酶解时间对原生质体游离的影响。结果表明:采用继代培养8-10 d的胚性愈伤组织在1.0%纤维素酶+1.0%离析酶+0.5%果胶酶+0.3%崩溃酶条件下,酶解14-16 h可得到产量和活力较高的原生质体。原生质体以2.0×10⁵-5.0×10⁵个/mL的植板密度,采用液体浅层法在附加1.0 mg/L 2,4-D、0.3 mg/L 6-BA、100 mg/L水解酪蛋白、100 mg/L水解乳蛋白、1.0%蔗糖、0.4 mol/L甘露醇的KM₈P培养基中培养,可形成较小的愈伤组织。愈伤组织经过增殖在分化培养基上(MS+0.5mg/LNAA+2.0 mg/L 6-BA)可诱导芽、根的形成,再生出完整植株。     

地被菊‘紫妍’和‘纽9722’的再生体系建立

本研究以地被菊(Chrysanthemum morifolium)两个品种‘紫妍’和‘纽9722’带腋芽的无菌茎段为外植体,在基本培养基中添加不同浓度的6-BA和NAA诱导叶片分化、茎段增殖以及继代生根,进行两个品种的再生体系建立。结果表明,利用2%NaClO对‘紫妍’和‘纽9722’适宜消毒时间分别为6、8min;诱导‘紫妍’叶片不定芽再生的最适培养基是MS+6-BA 2.0mg·L-1+NAA 1.0mg·L-1,愈伤组织诱导率为100%,分化率为92.22%,出芽数为7.60;‘纽9722’叶片不定芽再生的最适培养基是MS+6-BA 2.0mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1,愈伤组织诱导率为100%,但分化率仅为45.59%;‘纽9722’茎段增殖的最适培养基是MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1,增殖系数高达10.05;‘紫妍’生根的最适培养基是1/2 MS+NAA 0.2 mg·L-1,生根率为100%,生根系数为15.50;‘纽9722’生根的最适培养基为1/2 MS+NAA 0.3mg·L-1,生根率为100%,生根系数为14.87,移栽成活率均为100%。     

柱花草叶肉原生质体提取与瞬时表达体系构建

柱花草(Stylosanthes guianensis)是一种重要的热区豆科牧草,为利用原生质体瞬时表达体系开展柱花草基因功能研究,以20 d龄期‘热研5号’柱花草子叶为试验材料,通过正交试验考察不同因素对原生质体分离及转化效率的影响。结果表明：采用1.5%纤维素酶、1.25%离析酶、0.5 mol·L^-1甘露醇和4 mmol·L^-1MES酶解液组合,酶解时间为16 h时,原生质体的产量和活性均达到最佳,分别为(4.567×10⁶)个·g^-1和92.271%;原生质体浓度为(6×10⁵)个·mL^-1、质粒浓度为0.6μg·μL^-1,PEG-4000浓度为50%、转化时间为5 min时,转化效率最高,可达52.524%。构建了目标蛋白SgRKL1表达载体pA7-BIUTNT::SgRKL1-GFP,利用PEG介导法将其转入柱花草原生质体,激光扫描共聚焦显微镜检测结果显示SgRKL1蛋白定位于细胞膜上,说明所建立的柱花草叶肉原生质体瞬时表...     

草地早熟禾种间原生质体电融合条件的研究

为改良培育草地早熟禾(Poa pratensis)新品种,拟建立草地早熟禾商用品种与具有优良性状的野生早地早熟禾种间原生质体融合体系。采用电融合法,研究了电融合仪的电场条件和原生质体密度对草地早熟禾种间原生质体融合的影响。结果表明:在交流电场强度和频率分别为20 V/cm和2000k Hz时,原生质体可在较短的时间内形成2~4个原生质体串;最适于草地早熟禾种间原生质体融合的直流脉冲强度为200 V/cm、DC幅宽为40μs、直流脉冲次数为3次,原生质体密度为3×105个/m L,在此条件下,草地早熟禾种间原生质体总融合率和一对一融合率可分别达到25.39%和12.27%。     

华南象草原生质体分离及基因瞬时表达研究

以华南象草(Pennisetum purpureum)幼叶鞘为材料,采用L₁₆(4⁵)正交试验设计,对分离原生质体过程中的纤维素酶浓度、离析酶浓度、酶解液pH、甘露醇浓度、酶解时间5个因素进行筛选,建立了高效的象草叶鞘原生质体分离体系,并进行目标基因的瞬时转化,以期为象草基因功能研究奠定基础。结果表明:叶鞘在含有1.5%纤维素酶R-10,0.75%离析酶R-10,0.5 mol·L^-1 甘露醇,pH为5.8的酶解液中酶解4 h,原生质体产量达5.11×10⁶个·g FW^-1,活力达91.08%,酶解时间对象草原生质体产量和活力的影响最大。用PEG介导法将2个分别带有绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的载体转入原生质体中,转化效率最高可达77.47%,共转化效率为8.79%。所分离的原生质体可用于基因的瞬时表达研究。     

桑树原生质体分离条件的优化试验

为了分离获取高产量、高活力的桑树原生质体,分别以桑树的组培苗细切叶片、胚性悬浮培养细胞、粗切愈伤组织和细切愈伤组织等为材料,采用正交试验和单因素试验的方法对桑树原生质体酶解分离条件中的分离酶液组合、渗透压调节剂、酶解温度、酶解时间等因素进行优化。最佳分离酶液组合为100 U/mL纤维素酶R-10+150 U/mL果胶酶Y-23+6 U/mL离析酶R-10+细胞-原生质体洗液(1 480 mg/L CaCl2.2H2O,27.2 mg/L KH2PO4),以0.6 mol/L甘露醇为渗透压调节剂,在28℃酶解温度条件下酶解6 h,用桑树胚性悬浮培养细胞作分离材料可获得7.8×106个/g的原生质体产量,且原生质体活力达91.4%。研究结果显示,选择合适的分离材料以及酶解分离条件是高效获取高活力桑树原生质体的关键。     

草地早熟禾午夜2号植株再生研究

以草地早熟禾(Poa pratensis L.)品种午夜2号成熟种子为外植体,进行植株再生研究,建立高频再生体系,为草地早熟禾进行原生质体培养和细胞融合奠定基础。结果表明:诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+2,4-D(1mg/L)+6-BA(0.1 mg/L)+3%蔗糖+0.7%琼脂,其诱导率为52.3%;最佳继代培养基为MS+2,4-D(1mg/L)+6-BA(0.3mg/L)+3%蔗糖+0.7%琼脂;最佳分化培养基为MS+NAA(0.5 mg/L)+6-BA(1 mg/L)+3%蔗糖+0.6%琼脂、分化率为57.5%;生根培养基同分化培养基,供体材料经100d的培养后获得再生植株。     

提高甘草原生质体游离产量及分裂频率的研究

为探讨影响胀果甘草(Glycyrrhiza inflata Batal.)原生质体游离的因素,提高原生质体游离产量和分裂频率,试验采用纤维素酶、果胶酶、离析酶不同浓度组合的酶解液,在3种酶解方式下对甘草叶片、下胚轴、愈伤组织进行了原生质体游离。结果表明:苗龄11 d的甘草叶片、下胚轴及继代5次的愈伤组织是原生质体游离的良好材料,三者均在2.0%纤维素酶+0.5%果胶酶和2.0%纤维素酶+0.25%离析酶+0.5%果胶酶的酶解液中原生质体游离频率最高,其产量和活力分别为1.25×10⁵~1.26×10⁵个·g^-1,65.7%~70.5%;1.43×10⁵~1.44×10⁵个·g^-1,69.5%~72.8%;1.10×10⁵~1.16×10⁵个·g^-1,61.9%~69.4%;纵向切割的下胚轴平均原生质体产量和活力高于叶片和愈伤组织,分别为1.19×10⁵个·g^-1,65.2%。此外,在40 r·min^-1摇床上处理7 h的酶解混合物中原生质体产量最高;而先静置后缓慢震荡(40 r·min^-1)的酶解方式可得到最佳原生质体产量和活力。将原生质体密度调整到1×10⁵个·g^-1并培养于KM8P培养基中,能获得最高频率的原生质体分裂频率(2.34%)。试验获得了较好的甘草原生质体游离及分裂体系。     

扁蓿豆愈伤组织原生质体分离条件的研究

以扁蓿豆(Melilotoides ruthenica(L.)Sojak)下胚轴愈伤组织为材料,研究酶液组合、酶解时间、酶液渗透压、继代培养时间及预处理措施对其原生质体分离效果的影响,以期确定能够酶解出高数量且高活力的原生质体的酶解条件。结果表明:获得有活力原生质体的最佳酶液组合为2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%半纤维素酶、酶解时间为12 h、酶液渗透压即甘露醇浓度为0.55 mol·L^-1,愈伤培养天数为10~12 d、预处理措施为黑暗24 h。     

霸王的原生质体培养及植株再生研究

本研究建立了霸王原生质体再生植株的试验体系。以子叶切块诱导的松软愈伤组织为材料,通过酶法分离出大量有活力的原生质体,原生质体经培养持续分裂形成了愈伤组织,并分化出再生苗。比较了不同培养基和培养密度对原生质体分裂和再生的影响。结果表明,原生质体以2×10⁵个/mL的植板密度,采用液体浅层法培养在附加1.0 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、0.2 mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)、0.2 mg/L激动素(KT)、500 mg/L水解酪蛋白(CH)、2%蔗糖和0.5 mol/L甘露醇的DPD培养基中,可获得最佳效果,其细胞分裂频率达28.4%左右。转移到附加1.0 mg/L 6-BA、0.5 mg/L萘乙酸(NAA)的MS分化培养基上,获得大量的再生苗。     

垂花百合花器官离体培养

以垂花百合（Lilium cernum）的花器官(花瓣、花托、子房)为外植体进行组织培养,结果表明,3种花器官外植体的愈伤组织的诱导能力和分化能力各不相同,花瓣愈伤组织的诱导率及分化率最高,分别可达57.65%和81.12%;诱导愈伤组织由易到难依次为花瓣>花托>子房;花瓣外植体诱导愈伤组织的最适培养基为MS+6 BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1,子房外植体诱导愈伤组织的最适培养基为MS+6 BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1,花托外植体诱导愈伤组织的最适培养基为MS+6 BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1;最适生根培养基为1/2 MS+IBA 1.0 mg·L-1+ NAA 0.3 mg·L-1+AC 0.5 g·L-1。     

长叶点地梅愈伤组织诱导和植株再生

以长叶点地梅（Androsace longifolia）的无菌实生苗的下胚轴和叶片为外植体,研究不同种类、不同浓度的激素组合培养对愈伤组织诱导、芽诱导和生根的影响。结果表明,诱导下胚轴基部愈伤组织的最佳培养基为MS+0.3 mg·L-1 6 BA+0.1 mg·L-1 NAA,诱导率达85%;诱导叶片愈伤的最佳培养基为MS+0.02 mg·L-1 NAA+0.3 mg·L-1 TDZ,诱导率为80%;下胚轴愈伤诱导芽的最佳培养基为MS+0.5 mg·L-1 6 BA+0.2 mg·L-1 NAA,分化率达92.5%;叶片愈伤诱导芽的最佳培养基为MS+1.0 mg·L-1 6 BA+0.2 mg·L-1 NAA,分化率达82.5%;最佳生根培养基为MS+1.0 mg·L-1 IBA,生根率达100%,移栽成活率达95%。     

桑树内生真菌Macrophomina phaseolina MOD-1原生质体制备条件的优化试验

为了应用原生质体技术改良桑树内生产油真菌Macrophomina phaseolina MOD-1的产油性能,对影响MOD-1原生质体制备的酶液组分、菌龄、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂种类等因素进行优化。通过正交试验得到最佳酶液组合为:20mg/mL纤维素酶+20 mg/mL溶菌酶+5 mg/mL蜗牛酶。在此基础上应用响应面分析法获得影响MOD-1原生质体产量的显著因素有菌龄和渗透压稳定剂浓度,且均产生负效应。以此作为中心点进一步优化原生质体制备条件为:培养44.58 h的MOD-1菌丝,用0.66 mol/L KCl作渗透压稳定剂,30℃条件下酶解4 h。在此优化条件下,获得的MOD-1菌株原生质体产量可达7.06×106个/mL,优化条件具有实用价值。     

匍匐翦股颖叶肉细胞原生质体瞬时表达体系的建立

为了建立稳定、高效的匍匐翦股颖（Agrostis stolonifera L.）叶肉细胞原生质体瞬时表达体系，本研究以匍匐翦股颖‘Penn-A4’的叶片为材料，分析不同因素对其叶肉细胞原生质体分离的影响，确定其原生质体分离的最佳条件。结果表明：苗龄为4周的翦股颖无菌苗叶片在甘露醇为0.6 mol·L^-1的酶解液中，28℃酶解4 h后，可分离得到较高活力原生质体、提取量约为6.75×10⁶个·g^-1；为进一步检测该原生质体是否可有效的应用在蛋白功能研究中，构建了热激蛋白基因AsHSP26.8-GFP重组质粒，并在聚乙二醇（PEG-4000）介导下将其导入叶肉细胞原生质体中进行了亚细胞定位；通过激光共聚焦显微镜观察到AsHSP26.8定位于叶绿体。综上所述，本研究建立了一套较为完整的匍匐翦股颖叶肉细胞原生质体分离与瞬时表达体系，为探究匍匐翦股颖的功能基因组学研究奠定了基础。     

多花黑麦草特高和多年生黑麦草四季高频组培再生体系的优化与建立

对在贵州地区广泛种植的多花黑麦草特高(Lolium multiflorum‘Tetragold’)和多年生黑麦草四季(L.perenne‘Four seasons’)的成熟种子进行了愈伤组织诱导及植株再生的研究,建立了两个品种的胚性愈伤组织高频诱导与再生体系。结果表明,剥去成熟种子的颖壳,切除1/3胚乳端,将特高接种于CC+7mg·L~(-1) 2,4-D+0.5mg·L~(-1) 6-BA、四季接种于CC+5mg·L~(-1) 2,4-D+0.5 mg·L~(-1) 6-BA的培养基中,在明显降低组培污染率的同时,能分别得到65.52%和63.55%的最高愈伤组织诱导率;将两个品种诱导出的愈伤组织转移在MS+0.5 mg·L~(-1) 2,4-D+0.5mg·L~(-1) 6-BA+1.25mg·L~(-1) CuSO4+1.0g·L~(-1) CH的继代培养基上,能促进质量较好的Ⅱ型胚性愈伤组织的形成;根据后续转化试验所选用的植物表达载体pCAMBIA 1300的抗性特点,30~40mg·L~(-1)的潮霉素是两个品种愈伤组织最佳的筛选剂和临界浓度;特高的胚性愈伤组织接种在MS+2.0 mg·L~(-1) 6-BA+0.5 mg·L~(-1) NAA+0.1mg·L~(-1) TDZ的培养基上,可以产生86.37%的最高分化率,四季的胚性愈伤组织接种在MS+6.0 mg·L~(-1) 6-BA+0.3mg·L~(-1) NAA+5.0mg·L~(-1) KT的培养基上,能得到85.40%的最高分化率;生根培养基1/2MS+0.5 mg·L~(-1)NAA+0.5mg·L~(-1) IAA能让两个品种分化出的不定芽形成100%的生根率;以腐殖土∶蛭石∶砂壤土=1∶1∶1的混合材料作为营养土,能保证组培再生苗达到99%以上的成活率。优化建立的高频组培再生体系为下一步的遗传转化奠定了基础。