黄花苜蓿花药培养再生体系的建立与单倍体鉴定

花药组织培养再生体系的构建是单倍体育种的重要途径之一。本研究对呼伦贝尔黄花苜蓿(Medicago falcate‘Hulunbeier’)进行了花药组织培养研究并建立了花药组培再生体系。结果显示,液体悬浮培养基比固体培养基更适合呼伦贝尔黄花苜蓿花药愈伤组织的培养,其愈伤形成的培养条件为B5培养基+0.5 mg·L~(-1) 2,4-D+0.25 mg·L~(-1) 6-BA+0.4mg·L~(-1) NAA+3.0mg·L~(-1) KT;分化培养基为MS+1.0mg·L~(-1) 2,4-D+0.5mg·L~(-1) 6-BA+2%蔗糖+0.7%琼脂;生根培养基为1/2MS+0.1mg·L~(-1) NAA+2%蔗糖+0.7%琼脂;获得的再生植株经流式细胞仪鉴定,其单倍体比例高达27%。     

长穗偃麦草成熟种胚高频再生体系

以长穗偃麦草(Elytrigia elongata)成熟胚为外植体,在MS基本培养基的基础上,附加不同浓度的2,4-D、6-BA和NAA等植物生长调节剂,开展对其愈伤组织诱导、绿苗分化和生根等的试验研究。结果表明,适宜愈伤组织诱导的培养基为MC (MS+30 g·L~(–1)麦芽糖+1 g·L~(–1) CH+200×5 mL·L~(–1) VB+0.5 g·L~(–1) L-Pro+3 g·L~(–1)植物凝胶)+3 mg·L–12,4-D+0.025 mg·L~(–1) 6-BA,诱导率达77.78%,4周后可见淡黄色愈伤组织;最佳分化培养基为MC (MS+30 g·L~(–1)麦芽糖+1 g·L~(–1) CH+200×5 mL·L~(–1) VB+0.5 g·L~(–1) L-Pro+3 g·L~(–1)植物凝胶)+0.1 mg·L~(–1) 2,4-D+3 mg·L~(–1) 6-BA,分化率达66.67%,4周后出现芽点,同时伴随根毛发生;最佳生根培养基为MR(1/2MS+15 g·L~(–1)麦芽糖+3 g·L~(–1)植物凝胶)+0.5 mg·L~(–1) NAA,移栽后全部成活。从而建立了一套从长穗偃麦草"成熟种胚–诱导愈伤组织–绿苗分化–生根–移栽"的组培再生体系,为进一步研究其抗逆分子机制奠定了重要基础。     

应用正交试验法优化‘新农1号’狗牙根再生体系

以‘新农1号’狗牙根(Cynodon dactylon(L.)Pers.)成熟颖果为材料,通过正交法探讨激素、外源添加物等对狗牙根愈伤诱导、继代及分化的影响,优化‘新农1号’狗牙根再生体系。结果表明:各因子对‘新农1号’狗牙根愈伤诱导的影响程度为2,4-D6-BA脯氨酸;优化诱导培养基为添加2,4-D(2.0 mg·L~(-1))+6-BA(0.01mg·L~(-1))+脯氨酸(200mg·L~(-1))的MS培养基,此时愈伤诱导率达69.5%;对继代增殖而言,各因子对胚性愈伤诱导率、愈伤增殖率、褐化率的影响程度不同,对胚性愈伤诱导率的影响程度为2,4-DABA6-BA,对愈伤增殖率的影响程度为6-BAABA2,4-D,对褐化率的影响程度为2,4-D6-BAABA。综合3个指标结果认为,‘新农1号’狗牙根愈伤继代的优化培养基为2,4-D(2.0mg·L~(-1))+6-BA(0.20 mg·L~(-1))+ABA(2.0 mg·L~(-1))的MS培养基,其胚性愈伤率和愈伤增殖率分别可达71.67%和61.67%,且褐化率较低;对分化而言,优化的分化培养基为MS+6-BA(1.0mg·L~(-1)),小植株形成强度可达49.44%。     

杂交狼尾草不同外植体愈伤组织诱导

本研究以杂交狼尾草(Pennisetum americanum×P.purureum)种子和心叶为外植体研究不同质量浓度2,4-D与6-BA组合对愈伤组织诱导及6-BA,NAA对分化的影响。结果表明种子最佳的胚性诱导培养基MS+5.0mg·L-12,4-D+0.4 mg·L-1 6-BA,诱导率为75%,心叶最佳的胚性诱导培养基MS+3.0 mg·L-12,4-D+0.5mg·L-1 6-BA,诱导率为60%;种子愈伤组织诱导高于心叶,为较好外植体。种子分化的最佳培养基为MS+3mg·L-1 6-BA+0.5mg·L-1 NAA,分化率62.5%。该研究建立了稳定有效的再生体系,为杂交狼尾草的遗传转化和定向改良提供了技术支撑。     

扁穗牛鞭草再生体系的建立

以‘雅安'扁穗牛鞭草(Hemarthria compressa)的幼茎和幼叶为外植体,通过胚性愈伤组织建立扁穗牛鞭草的高效再生体系。结果表明:幼叶比幼茎更适合建立再生体系,最佳诱导培养基为MS+2,4-D 1.0 mg·L~(-1),幼叶和幼茎的出愈率分别为100%和86.96%。最佳分化培养基和不定芽增殖培养基均是MS+6-BA 1.0 mg·L~(-1)+NAA 0.2 mg·L~(-1),愈伤分化率分别为100%和72.90%,再生苗增殖系数可达18.6。1/2 MS是最适宜的生根培养基,生根率达100%。     

多年生黑麦草愈伤组织诱导与芽分化的研究

对多年生黑麦草Lolium perenne的2个品种特拉华(Delaware)与尤文图斯(Juventus)进行了愈伤组织诱导以及芽分化的研究.结果表明,在种子和成熟胚2种外植体中,成熟胚的出愈率高,是较好的愈伤诱导材料.愈伤诱导培养基采用MS基本培养基,附加激素4 mg/L 2,4-D 0.025 mg/L 6-BA.特拉华和尤文图斯较适宜的芽分化培养基是MS基本培养基分别附加0.4 mg/L ZT 0.3 mg/L NAA和0.2 mg/L ZT 0.5 mg/L NAA.特拉华在愈伤诱导和芽分化两方面均优于尤文图斯.     

高羊茅胚性愈伤组织诱导及植株再生

对高羊茅2个品种(新秀和夜明珠2号)的再生技术进行了研究,建立了高频再生体系,为遗传转化奠定了基础.该试验以成熟的种子为外植体,诱导胚性愈伤组织.结果表明,2品种胚性愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+2,4-D5.0mg/L+6-BA0.1 mg/L;愈伤组织分化的最佳培养基:新秀为MS+6-BA 2.0ms/L,夜明珠2号为MS+6-BA 1.0mg/L;生根最佳培养基为MS+NAA 0.5 mg/L.     

多年生黑麦草愈伤组织遗传转化受体系统的建立

多年生黑麦草成熟胚为外植体,选择CC+2,4-D 4 mg/L为诱导培养基,NB+6-BA 2 mg/L为分化培养基,1/2 NB+IAA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L为生根培养基,建立了多年生黑麦草胚性愈伤组织高频诱导与再生系统,确定了G418(150~200 mg/L)、Hpt(50 mg/L)、Basta(20~30 mg/L)的筛选临界浓度,确定了最佳分化时间,探讨了建立多年生黑麦草转化受体系统的必要条件。     

铁线莲‘Blekitny Aniol’组织培养及再生体系建立

对铁线莲(Clematis florida‘Blekitny Aniol’)的带芽茎段进行诱导产生无菌苗,并对其叶片和茎段进行愈伤组织诱导成苗的分化研究,成功建立了铁线莲组织培养再生体系。结果表明,带芽茎段诱导腋芽最佳培养基为MS+1mg·L~(-1)6-BA+0.05 mg·L~(-1)NAA,腋芽萌发率为100.0%;茎段诱导愈伤最适宜培养基为MS+2 mg·L~(-1)6-BA+0.01mg·L~(-1)NAA,诱导率为78.3%;叶片诱导愈伤组织最适宜的培养基为MS+1 mg·L~(-1)6-BA+0.1 mg·L~(-1)NAA,诱导率为81.7%;愈伤组织分化的最佳培养基为1/2MS+1 mg·L~(-1)6-BA+0.05 mg·L~(-1)NAA,分化率可达25.0%;最适宜不定芽的增殖培养基为1/2MS+3 mg·L~(-1)6-BA+0.1 mg·L~(-1)NAA,增殖倍数为4.94;筛选出最优的生根培养基组合为1/2MS+0.05 mg·L~(-1)NAA,生根率为70.2%。本研究将为铁线莲的推广应用提供参考,也为其他铁线莲属植物引种和开发利用奠定了基础。     

海滨雀稗再生体系的建立

以海滨雀稗(Paspalum vaginatum cv.Sea spray)的成熟种子为外植体,运用正交试验设计,在MS基础培养基上添加不同浓度的2,4-D、6-BA、NAA、KT、CuSO4、AHC等外源物质,分析其对愈伤组织诱导、胚性愈伤组织分化的影响,建立海滨雀稗高频再生体系,为基因工程育种奠定基础.试验结果表明,在MS培养基中添加2.0 mg/L 2,4-D和0.5g/L AHC 能提高种子的发芽率至97.50％;最佳胚性愈伤诱导培养基为:MS +2,4-D 3.0mg/L+CuSO4 15.0 mg/L+AHC 1.0g/L,其胚性出愈率为66.88％;最佳分化培养基为:MS+6-BA 8.0mg/L+KT 0.05 mg/L+CuSO4 10.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L,其分化率为95.00％.     

野生黄花苜蓿组织培养及再生体系研究

以呼伦贝尔草原野生黄花苜蓿(Medicago falcata L.)无菌苗的子叶和下胚轴为外植体,对其组织培养及再生体系进行系统的研究,以期为其下一步转基因试验提供良好的受体。结果表明:最佳愈伤诱导培养基为MS+1.5 mg·L^-1 2,4-D+0.4 mg·L^-1 6-BA+3%蔗糖+0.7%琼脂,下胚轴和子叶的最佳愈伤诱导率均可达到100%。最佳胚性愈伤形成培养基为MS+0.5 mg·L^-1 KT+0.1 mg·L^-1 NAA+2%蔗糖+0.7%琼脂,胚性愈伤形成率为81.5%;最佳分化芽形成培养基为MS+0.25 mg·L^-1 KT+0.05 mg·L^-1 NAA+2%蔗糖+0.7%琼脂,分化芽形成率为36.5%。最佳生根培养基为1/2MS+0.5 mg·L^-1 NAA+1.5%蔗糖+0.7%琼脂,生根率为93.3%。愈伤诱导结果显示,供试黄花苜蓿材料个体间组织培养再生性存在较大差异,在同一激素水平上有大约1/3植株的愈伤状态优于其他植株。     

青绿苔草(Care breviculmis)愈伤组织诱导与再生体系的建立

为建立青绿苔草高效的再生体系,本研究以青绿苔草的种子为外植体,探究不同植物激素配比对愈伤组织诱导、愈伤分化和生根的影响。结果表明:MS+1.5 mg·L^-1 NAA+0.5 mg·L^-1 6-BA+2.0 mg·L^-1 2,4-D为诱导愈伤的最佳培养基,诱导率可以达到68.3%,愈伤表现为松散的黄色颗粒;MS+1.0 mg·L^-1 NAA+1.0 mg·L^-1 6-BA为最佳分化培养基,分化率为93.8%,不定芽数量达到40个,长势良好;不定芽在1/2 MS培养基中生根效果最好,其根长、株高和生根数量均显著高于其他处理。本研究建立了高效的青绿苔草再生体系,为研究青绿苔草的遗传转化及应用生物技术育种奠定了基础。     

多年生黑麦草高频丛生芽增殖培养体系的研究

选取多年生黑麦草(Lolium Perenne L.)的3个优良品种:里加(Regal)、贝尔勒(Belle)、马拉松(Marathon)作为植物材料,以无菌苗的茎尖为外植体,对多年生黑麦草丛生芽的诱导、增殖进行研究,以其建立多年生黑麦草丛生芽高频增殖体系,并在此基础上确定丛生芽离体培养的最适筛选剂及其浓度。结果表明:当2,4-D和6-BA浓度分别为0.5 mg·L^-1和2.0 mg·L^-1时有利于茎尖诱导产生丛生芽;丛生芽增殖的最适6-BA浓度为2.0 mg·L^-1;继代培养时间过长对丛生芽块的生长不利;基因型对丛生芽的诱导和增殖有很大影响;适宜的生根培养基为1/2 MS+NAA 0.1 mg·L^-1。此外,还确定了丛生芽的最适筛选剂为G418和Hyg,其浓度分别为150 mg·L^-1和75 mg·L^-1。从而,建立了一种诱导率和增殖率较高并且实验周期短的丛生芽高频增殖培养体系,并进一步探讨了建立多年生黑麦草遗传转化受体系统的必要条件。     

外源激素对紫穗狼尾草愈伤组织诱导及分化的影响

以紫穗狼尾草(Pennisetum alopecuroides)幼芽基部为外植体,研究了外源激素对其愈伤组织诱导及分化的影响,筛选适宜的激素种类及浓度配比,为狼尾草无性系抗性育种奠定基础。结果表明,2,4 D对愈伤组织诱导的作用最显著,生长素NAA和KT的作用相近,均以0.5~1.0 mg·L-1为宜;NAA对愈伤组织分化的作用较明显,以0.5~1.0 mg·L-1与3.0 mg·L-16 BA配合效果最佳,KT的作用不明显。最佳诱导培养基为MS+2,4 D 3.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1 +KT 1.0 mg·L-1;最佳分化培养基为MS+NAA 0.5 mg·L-1 +6 BA 3.0 mg·L-1。     

红豆草组织培养及植株再生体系的优化

以红豆草（Onobrychis viciifolia Scop.）无菌苗的上胚轴、真叶和下胚轴为外植体,根据正交试验设计方法,研究不同植物激素对红豆草组织培养及植株再生体系的影响。结果表明：激素对愈伤诱导的影响程度为萘乙酸（Naphthylacetic acid,NAA）>玉米素（Zeatin,ZT）> 6-苄氨基嘌呤（6-Benzylaminopurine,6-BA）,诱导外植体产生愈伤组织的最佳培养基为MS+1.0 mg·L^-1 6-BA+0.5 mg·L^-1 NAA+0.2 mg·L^-1 ZT,诱导率达94.5%;对不定芽分化率的影响程度为NAA > 6-BA > ZT,诱导愈伤组织分化不定芽的最佳培养基为MS+0.5 mg·L^-1 6-BA+2.5 mg·L^-1 ZT,诱导率达88.9%;诱导不定芽生根的最佳培养基为1/2 MS+0.5 mg·L^-1 NAA+0.2 mg·L^-1吲哚丁酸钾（Indole-3-butyric acid potassium,IBA-K）,诱导率高达45%。     

多年生黑麦草高频再生体系的建立及农杆菌介导PEPC基因的转化

以多年生黑麦草(Lolium perenne L.)成熟种子作为外植体,建立其高频再生体系,通过农杆菌介导法将磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因转入,为多年生黑麦草的抗逆转基因工作奠定基础。结果表明:种子充分灭菌后在附加6.0 mg·L^-1 2,4-D的培养基中诱导愈伤组织,诱导率可达61.33%。愈伤组织在2,4-D浓度减半的培养基上继代培养长势良好,分化培养基为MS培养基附加1.0 mg·L^-16-BA,分化率最高达到61.33%,在1/2 MS+0.5 mg·L^-1 NAA培养基中进行生根培养,生根率达100%。以该再生体系为基础,将获得的愈伤组织作为外植体进行遗传转化,经筛选培养后得到再生植株,通过PCR及实时荧光定量(Real-Time)PCR验证表明PEPC基因已成功转入,转化率为8.67%。试验结果将为多年生黑麦草抗性品种的研究奠定基础。     

草地早熟禾午夜2号植株再生研究

以草地早熟禾(Poa pratensis L.)品种午夜2号成熟种子为外植体,进行植株再生研究,建立高频再生体系,为草地早熟禾进行原生质体培养和细胞融合奠定基础。结果表明:诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+2,4-D(1mg/L)+6-BA(0.1 mg/L)+3%蔗糖+0.7%琼脂,其诱导率为52.3%;最佳继代培养基为MS+2,4-D(1mg/L)+6-BA(0.3mg/L)+3%蔗糖+0.7%琼脂;最佳分化培养基为MS+NAA(0.5 mg/L)+6-BA(1 mg/L)+3%蔗糖+0.6%琼脂、分化率为57.5%;生根培养基同分化培养基,供体材料经100d的培养后获得再生植株。     

红三叶新品系组织培养和植株再生

利用红三叶(Trifolium pratense L.)新品系无菌苗不同部位,通过愈伤组织诱导及分化途径获得再生植株。结果表明:子叶、下胚轴、叶柄、叶片及根段在MS+0.5mg·L^-1 6-BA+1～2mg·L^-1 2,4-D培养基上都极易诱导出愈伤组织。最佳继代培养基为MS+0.5mg·L^-1 6-BA+1.0mg·L^-1 2,4-D,添加2,4-D比NAA更利于愈伤的增长和保存;最佳分化培养基为MS+0.75mg·L^-1 6-BA+0.5mg·L^-1 NAA,最高分化率为16.67%,且分裂素6-BA优于KT,6-BA与NAA组合比与IBA组合更有利于红三叶愈伤组织的分化;茎芽增殖最佳培养基为MS+0.5mg·L^-1 6-BA+1.0mg·L^-1 IBA,再生苗的增殖效果IBA>NAA,2,4-D不利于茎芽生长;最佳生根条件为50mg·L^-1浓度的IBA中浸泡1h后植入含0.5mg·L^-1 IBA的MS中,生根率达80%,红三叶新品系IBA生根最大极限浓度为0.75mg·L^-1,浓度过高表现出对根系生长的毒害。     

正交设计在多年生黑麦草组织培养中的应用

以多年生黑麦草的成熟种子为外植体,应用正交设计方法,对愈伤组织的诱导和分化培养基进行了优化筛选。结果表明,愈伤组织诱导的最佳因素组合:2,4-D(7mg/L) 6-BA(0.1mg/L) NAA(0.3mg/L) CH(0.1g/L)(特拉华);2,4-D(7mg/L) 6-BA(0)(尤文图斯、托亚)。特拉华愈伤组织分化的最佳因素组合:6-BA(0.1mg/L) NAA(0.8mg/L) ZT(0.1mg/L) Cu2 (8.96mg/L);6-BA为0.2mg/L时,托亚的愈伤组织分化率最高。比较三个品种的出愈率和分化率:特拉华最高,托亚次之,尤文图斯最低。