家蚕幼虫性腺表达序列标签分析（英文）

分别以5龄幼虫的精巢和卵巢构建了2个家蚕cDNA文库。利用表达序列标签方法分析参与家蚕性腺发育的基因,通过测序获得16 737条ESTs（精巢8 407条,卵巢8 330条）,拼接这些ESTs共得到2 107个重叠群（con-tig）和3 532个单拷贝（singlet）。将这些转录物与GenBank非冗余蛋白质库比较,结果显示约34.3%的基因与数据库中蛋白质具有相似性。功能注释表明蛋白质合成相关基因、精巢特异基因等在文库中大量存在。基因本体（gene ontology）功能分类显示精巢与卵巢基因表达谱差异较大。研究结果为理解家蚕性腺发育提供了信息。     

利用抑制消减杂交技术筛选鹅就巢行为相关基因

旨在利用抑制消减杂交技术构建鹅就巢与产蛋cDNA基因文库,筛选就巢母鹅上调与下调表达的基因.以就巢期和产蛋期鹅卵巢组织互为检测子和驱动子,进行正反双向消减杂交,获得鹅卵巢差异表达基因文库.从双向文库随机挑选单菌落进行PCR验证,结果表明文库质量良好.选取654个阳性克隆进行测序分析,获得641条表达序列标签(ESTs).对ESTs进行去除载体序列、质量检测、聚类及拼接,经BLASTn比对,有166条ESTs找到与之匹配的同源序列,其中92个是功能基因.比较就巢与产蛋SSH文库,发现就巢SSH库中参与细胞凋亡、信号转导及细胞结构的基因出现频率较高;产蛋特异性基因文库中参与物质能量代谢、细胞防御的基因较多;尚有许多差异片段属于未知功能蛋白或理论推定蛋白.结果提示,催乳素受体、抗苗勒管激素以及雌激素受体基因在就巢期上调表达可能与鹅就巢行为的启动与维持有关.该结果为进一步研究鹅就巢行为分子调控机制奠定基础.     

家蚕细胞周期素家族基因的克隆及结构特征与表达分析

细胞周期素(cyclin)是推进细胞周期进程最主要的调控因子之一,并与个体发育及肿瘤形成等有关。为研究细胞周期素家族基因在家蚕组织中的表达情况,利用家蚕基因组数据库信息设计引物克隆了家蚕细胞周期素家族的5个基因,对基因序列结构的分析结果表明,cyclinA、cyclinB、cyclinB3基因分别有7个外显子,cyclinE基因有8个外显子,cyclinL1基因只有1个外显子;cyclinA及cyclinE基因存在较多的剪切方式,cyclinA主要包含大小为2 141和2 173 bp的2种转录本,其变化在第7外显子,cyclinE则含有1 422、1 290及1 194 bp等大小不同的序列,变化集中于第5～7外显子,而cyclinB、cyclinB3及cyclinL1基因则相对稳定。克隆的家蚕细胞周期素家族基因的组织表达存在差异:cyclinA基因只在精巢中表达,cyclinB3基因只在精巢和卵巢中有明显的表达,cyclinE基因在丝腺、脑、脂肪体、中肠、马氏管、精巢、卵巢及血液8种组织都有表达,cyclinB和cy-clinL1基因在除丝腺或血液外的其他7种组织检测到表达。研究结果为进一步探究不同细胞周期素在昆虫蜕皮、变态等生理过程中的功能提供了参考。     

桑树幼叶cDNA文库的构建及部分表达序列标签分析

基于为鉴定和克隆桑树功能基因提供基础信息的目的,采用RNA转录5′末端转换(SMART)法构建了桑树幼叶全长cDNA文库。该文库容量为1.02×106pfu/mL,重组率95%,符合构建基因文库的质量要求。从构建的桑树幼叶cDNA文库中随机挑取48个克隆进行表达序列标签(EST)测序,有效序列为32条,经UniGene数据库归并后为32条,UniGene比率为100%;与NCBI核酸数据库进行比对、查询和注释,在32条序列中有29条序列具有同源性,其中16条为全长序列,完整性比率为55.2%;初步发现具有已知功能基因的ESTs 6个,具有推测功能基因的ESTs 5个,未命名或未知功能基因的ESTs 21个。     

家蚕BmE(spl)-like基因的克隆与表达谱分析

从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选到一条新的cDNA序列,生物信息学分析发现其编码的蛋白质序列与果蝇Enhancer of split基因[E(spl)]编码的DNA结合转录调控因子bHLH(helix-loop-helix)有较高的同源性,将该基因命名为BmE(spl)-like(Bombyx mori Enhancer of split like)。该基因的ORF长606 bp,编码201个氨基酸残基,预测蛋白质分子质量22.3 kD,等电点9.7。构建重组表达质粒pET-28a-BmE(spl)-like并在E.coli BL21(DE3)菌株中表达BmE(spl)-like蛋白,经亲和层析和FPLC反向柱纯化融合蛋白His-BmE(spl)-like并制备了抗体效价1∶25 600以上的多克隆抗体。用qRT-PCR方法检测BmE(spl)-like在家蚕成虫发育期的转录水平最高,结合果蝇同源基因的功能,推测该基因与蚕蛾的翅发育相关;该基因在家蚕5龄幼虫各组织中的转录水平以表皮最高,马氏管中最低。Western blotting检测BmE(spl)-like在家蚕5龄幼虫性腺中的表达水平最高,其次是丝腺、表皮、脂肪体、肠组织,在头部、马氏管和气管中的表达水平极低,与qRT-PCR检测的BmE(spl)-like在各组织中的转录水平有些差异。     

家蚕Mod基因的序列分析及表达与亚细胞定位研究

已知多数含BTB/POZ结构域的锌指蛋白对生物体的发育、分化及染色体重组等具有重要的调节作用。从已构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选到一条编码MOD(mdg4)蛋白的基因序列(GenBank登录号:DN237077)。该基因序列的ORF长1 080 bp,编码359个氨基酸残基,蛋白含有BTB保守结构域和FLYWCH保守结构域,与黑腹果蝇、冈比亚按蚊、赤拟谷盗和埃及伊蚊的MOD多序列比对,其同源性不超过40%。表达、纯化带有His标签的家蚕MOD蛋白(BmMOD),并用纯化的融合蛋白免疫新西兰兔获得多克隆抗体。实时荧光定量PCR显示BmMod基因mRNA转录水平在家蚕蛾期及5龄幼虫的卵巢最高,推测BmMod基因在家蚕生殖腺发育过程中产生一定作用。利用纯化的BmMOD蛋白多克隆抗体进行Western blotting分析也表明该蛋白在家蚕蛾期及5龄幼虫卵巢中的表达量最高,验证了BmMod在家蚕生殖腺发育中的功能。亚细胞定位结果显示BmMOD蛋白几乎完全定位于家蚕卵巢上皮细胞(BmN)的细胞核中。     

家蚕微孢子虫cDNA文库的构建及部分EST同源性分析

以成熟的家蚕微孢子虫 (Nosemabombycis,N .b)为实验材料 ,以λTriplEx2为载体 ,构建了滴度为 1 86× 10 6pfu/mL ,插入片段平均在 5 0 0bp以上的较高质量的家蚕微孢子虫cDNA文库。从cDNA文库中随机挑取 180个克隆进行EST测序 ,得到了 130个有效序列。经BLASTn、BLASTx同源性分析后发现 ,7个ESTs编码基因在氨基酸水平上与脑孢虫有较高的同源性 ,推定为家蚕微孢子虫基因 (putativegene) ,同时获得了 2 7个未知序列。     

籽鹅卵巢组织差异表达基因的研究

本研究旨在筛选产蛋前期和产蛋期籽鹅卵巢组织差异表达的基因,并进行功能分析,从而探讨鹅产蛋的分子调控机理。利用抑制性消减杂交技术筛选籽鹅卵巢组织中的差异表达基因,用GOTM软件将所得ESTs从分子功能水平进行GO分类。结果表明,所构建的籽鹅卵巢组织消减cDNA文库的削减效率在20倍以上,片段大小主要在300～750bp;挑选86个阳性克隆测序,获得15个ESTs,其中有11个为已知的ESTs,4个未知的ESTs;11个已知的ESTs被分成结合功能、催化活性、酶调节活性、转运蛋白活性和其它功能。本研究成功构建了籽鹅卵巢组织消减cDNA文库,并筛选得到了15个可能在产蛋前期和产蛋期籽鹅卵巢组织中差异表达的ESTs,它们可能在鹅产蛋过程中起着重要的调控作用。     

家蚕卵巢肿瘤基因Bmotu及其可变剪接

已知卵巢肿瘤基因(ovarian tumor gene,otu)在果蝇(Drosophila melanogaster)卵巢发育过程中发挥极其重要的作用,该基因突变会扰乱卵子形成的正常过程。为探究家蚕(Bombyx mori)是否具有类似果蝇生殖发育相关基因otu的同源基因,以及基因存在的可变剪接形式,在电子克隆的基础上,应用RT-PCR从家蚕精巢组织中获得了4条不同长度的Bmotu cDNA片段(GenBank登录号:HQ831341,HQ831342,HQ999998,HQ831343),其中3条由于无义突变导致翻译提前终止;而从卵巢组织中仅获得了1条Bmotu cDNA片段,该片段序列与精巢中扩增的登录号为HQ831343片段序列的5'端相同。结果表明Bmotu基因存在可变剪接,且雌、雄之间的剪接方式可能存在差异。生物信息学分析发现Bmotu基因编码蛋白与果蝇Otu的结构类似,含有半胱氨酸蛋白酶结构域(Otu结构域)、Tudor结构域、脯氨酸基序。研究结果有助于进一步探讨家蚕生殖发育机制。     

猪TIMP-2基因克隆、序列特征和表达分析

本研究分析了五指山试验用小型猪TIMP-2基因的分子特性和可能的生物学功能.将人TIMP-2 mR-NA全长序列在猪ESTs数据库中检索获得同源性较高的ESTs,用电子克隆结合RT-PCR方法克隆获得包含完整CDS区的猪TIMP-2基因cDNA序列,应用生物信息学方法分析了其核苷酸序列及其编码蛋白质分子结构特性,应用RT-PCR研究该基因在猪不同组织和发育时期的特异表达情况.结果,猪TIMP-2 cDNA序列全长790 bp,包括663 bp的完整开放阅读框,编码221个氨基酸.多序列比对和系统进化分析表明,该基因编码蛋白质与人(97%)、大鼠(97%)、小鼠(97%)等物种TIMP-2蛋白质具有较高的同源性.蛋白质序列预测分析发现,猪TIMP-2氨基酸序列理论等电点(pI)为7.65,相对分子质量(MW)为24.5 ku,它包括27AA的前导序列和194AA的成熟肽段,其前导序列比其它物种多1个亮氨酸(Leu).结构功能预测发现其具有1个在种间高度保守的NTR_TIMP结构域和N端VIRAK保守序列,序列中存在的12个半胱氨酸(Cys)可以形成6对二硫键结构.表达谱分析表明TIMP-2基因在猪的多个组织和不同发育时期的表达量存在较大差异,在睾丸、垂体、胃、大肠、卵巢、子宫和90 d胚胎骨骼肌中高表达;而在心脏、小肠、脑、肝脏、成年猪骨骼肌中表达量极低;在肾脏、胸腺、脾、甲状腺、33 d胚胎中中度表达.结果表明该基因在发生组织发育和重构活动相对活跃的组织器官和时期表达水平较高,亦符合其固有生物学功能.     

家蚕cDNA文库构建及大规模EST测序

EST(expressedsequencetag,表达序列标签 )测序分析技术广泛应用于基因功能和表达模式的分析研究。以家蚕品种“大造”为材料 ,采用非均一化的Oligo dT引物定向克隆技术构建了 13个组织的cDNA文库 ,进行了cDNA克隆 5′端测序 ,共获得 84 791万条EST序列 ,初步拼接得到 2 76 93个非重复序列 ,其中包括 10 4 33个Contigs,172 6 0个Singletons。家蚕大规模EST测序将为家蚕功能基因组研究和全基因组测序计划的实施奠定基础     

家蚕丝腺Matchmaker cDNA文库的构建和3种蚕丝蛋白基因转录因子编码区的克隆

采用Clontech公司SMARTTM技术,分别构建了家蚕4龄眠蚕后部丝腺(PSG0)以及5龄第3天后部丝腺(PSG3)、中部丝腺(MSG3)和脂肪体(FAT3)的Matchmaker cDNA文库,用A3基因引物对几个文库的质量进行了检测;从cDNA文库和家蚕基因组中克隆了FMBP-1、POU-M1和BmFkh 3种在蚕丝蛋白基因表达调控中起重要作用的转录因子编码区,并对其序列进行了分析。结果表明,所建cDNA文库能够用于利用酵母的杂交系统开展蚕丝蛋白基因的表达调控研究。     

家蚕黄血近等基因系SSH文库的构建及部分EST的序列分析

以家蚕黄血品系KY和白血品系HB构建家蚕黄血近等基因系。用回交18代的家蚕黄血基因(Y)近等基因系群体中的黄血个体和白血个体中肠为材料,构建了家蚕黄血近等基因系抑制消减杂交(SSH)cDNA文库。从该抑制消减杂交cDNA文库随机挑选出46个阳性克隆进行测序,并用CAP3软件聚类拼接,得到4个假定基因(contig)和9个已知功能基因(unigenes)。通过BLAST比对和对所得表达序列标签(EST)的同源分析表明,这些基因主要涉及能量代谢因子、RNA分子水平相关调节因子、酶类、结构蛋白等,由此初步探明了参与黄血基因(Y)协同作用的相关基因表达蛋白的种类和数量,可为进一步研究蚕茧着色的分子机制及通过遗传选择培育天然有色茧品种提供基础信息。     

家蚕第2白卵近等基因系差异表达基因的筛选

为了解与家蚕第2白卵(w-2)性状形成相关的差异表达基因信息,以家蚕正常型黑卵及其第2白卵近等基因系的转色期蚕卵为材料,构建抑制消减杂交(SSH)文库,筛选差异表达基因。对SSH文库中部分克隆的测序分析表明,该文库对差异表达基因的富集性较好。随机挑选SSH文库中的300个克隆制作家蚕cDNA芯片,对家蚕正常型黑卵及第2白卵近等基因系转色期蚕卵进行检测,获得11个差异表达基因。对这11个差异表达基因进行实时荧光定量RT-PCR验证分析,其结果与芯片数据分析结果趋势一致,在正常型黑卵与第2白卵近等基因系之间,这些基因的表达差异为0.1倍至数千倍。     

家蚕亲环蛋白A基因(BmCyPA)的克隆与表达分析

亲环蛋白(CyP)能与免疫抑制剂环孢霉素A(CsA)结合而作为CsA的胞内受体。在已构建的家蚕蛹cDNA文库中获得了家蚕亲环蛋白A(BmCyPA)基因的cDNA序列。利用生物信息学方法对此序列的开放阅读框(ORF)和序列同源性等进行分析,并以家蚕蛹总RNA反转录的cDNA为材料克隆了BmCyPA,通过原核表达目的蛋白后,将纯化的BmCyPA融合蛋白免疫新西兰兔得到抗血清,Western blotting检测目的蛋白在蚕体中得到表达。利用荧光定量PCR方法检测家蚕5龄幼虫各组织中BmCyPA mRNA的转录水平,由高到低依次为脂肪体、丝腺、中肠、马氏管、表皮、头部、气门、卵巢;Western blotting检测BmCyPA在5龄幼虫各组织中的表达水平,由高到低依次为脂肪体、气门、表皮、马氏管、中肠、丝腺、头部和卵巢。亚细胞定位显示Bm-CyPA在细胞质与细胞核中均有分布。推测BmCyPA与家蚕的生长发育以及促进蛋白质折叠和介导免疫应答等有密切联系。     

家蚕耐氟近等基因系SSH文库的构建及部分差异表达基因的分析

为了获取与家蚕耐氟性状相关的基因信息,利用家蚕耐氟品种T6和氟化物敏感品种733新建立耐氟近等基因系,以回交11代的家蚕耐氟近等基因系群体中的耐氟个体和敏感个体的中肠为材料,构建家蚕耐氟近等基因系抑制消减杂交(SSH)cDNA文库。通过对抑制消减杂交cDNA文库中随机挑选的153个阳性克隆测序和聚类拼接,得到19个重叠群(con-tig)、47个已知功能基因(un igene)和28个未知功能基因。获得的表达序列标签(EST)经BLASTx比对和同源性分析,初步发现这些基因参与家蚕体内物质转运、能量代谢、基因转录、蛋白质合成与降解、蛋白质加工、信号转导、机体免疫防御、细胞结构形成等诸多生物学过程。采用实时定量RT-PCR方法,对部分基因在家蚕耐氟近等基因系群体中的耐氟个体和敏感个体的不同组织的表达进行定量分析,发现磷酸根离子转运蛋白基因、三磷酸腺苷(ATP)合成酶基因、液胞型H+-ATP酶基因、脂肪酶基因以及主要过敏原蛋白基因在耐氟个体的中肠、马氏管、脂肪体组织中的表达量有较明显上调。     

家蚕单性生殖早期胚胎SSH文库的构建及其序列分析

为了探讨家蚕早期胚胎性别决定的分子机制,以非减数分裂孤雌生殖(AMP)和双精雄核发育(BSA)技术获得的家蚕单一性别早期(2~24 h)发育蚕卵为材料,利用抑制消减杂交(SSH)技术构建了正向和反向抑制消减杂交cDNA文库。在正向与反向抑制消减杂交文库中分别随机选择62个和46个克隆测序,分别获得43种和29种cDNA序列,其中25个为新的cDNA序列。生物信息学分析显示,抑制消减杂交文库中与单性生殖有关的高温、低温、辐射等诱导表达基因出现的频次较高。对部分文库序列进行半定量RT-PCR分析表明,这些基因在两种单性生殖早期发育胚胎中存在差异表达。     

家蚕黄茧近等基因系SSH文库的构建及部分EST序列分析

以家蚕黄茧品系KY(YYCC)和白茧品系C108(+Y+Y+C+C)组配黄茧(C)近等基因系。挑取回交11代的黄茧(C)近等基因系群体中的黄血个体的黄色和浅黄色中部丝腺作为实验材料,构建家蚕黄茧近等基因系抑制消减杂交(SSH)cDNA文库。通过对SSHcDNA文库中随机挑选的104个阳性克隆测序和聚类拼接,得到15个假定基因(contig)、25个已知功能基因(unigenes)和5个未知功能基因(unknown)。获得的表达序列标签(EST)经Blast比对和同源性分析,初步发现这些基因参与家蚕体内能量代谢、基因转录、信号传导、物质转运、细胞生长分裂、细胞结构形成、蛋白质合成与降解、核酸及蛋白质加工、机体防御等诸多生物学过程。分析结果可作为深入研究家蚕茧着色分子机制的基础信息。     

家蚕BmAWD基因的表达和蛋白纯化

家蚕BmAWD与家蚕翅膀发育密切相关,控制其翅膀发育的完整性及可用性。在对本实验室构建的家蚕蛹期cDNA文库测序中,我们筛选到-条编码AWD蛋白的cDNA序列,将其命名为BmAWD基因。通过生物信息学分析,发现该基因序列全长为689bp,ORF框为465bD,编码154个氨基酸残基,含有-个NDPK保守结构域。通过PCR扩增获得该基因ORF框并克隆到表达载体pGEX-5X-1上,得到重组表达质粒pGEX-5X-1-AWD,将该重组子转化大肠杆菌BL21,经PCR、酶切鉴定证明重组正确,在37℃下以IPTG诱导表达后收集菌体并裂解,SDS-PAGE分析发现在43kD左右处有一特异性蛋白条带,与预期值相符,但目的蛋白主要以沉淀即包涵体形式存在,25℃下诱导表达,SDS—PAGE分析表明目的蛋白主要存在于上清中。采用亲和层析法纯化融合蛋白GST-AWD,目的蛋白通过与层析柱上的GST磁珠结合而被纯化分离。     

利用酵母双杂交系统筛选BmNPV PE38的互作蛋白

利用酵母双杂交技术,以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的PE38蛋白为诱饵,从感染BmNPV的家蚕中肠组织cDNA文库中筛选与之相互作用的宿主蛋白编码基因,为探讨BmNPV PE38在侵染家蚕过程中的作用提供线索。将成功构建的酵母诱饵表达载体pGBKT7-Pe38转化到酵母菌Y2HGold中,并将含有感染BmNPV的家蚕中肠组织cDNA文库的Y187酵母细胞与含有pGBKT7-Pe38的酵母细胞共同培养,初筛出8个有匹配结果的候选蛋白基因,经功能搜索后筛选到2个与病毒复制有关的蛋白基因,通过测序和生物信息学分析,这2个基因编码的蛋白质可能是与BmNPV的PE38蛋白有相互作用的候选蛋白,分别为家蚕丝氨酸蛋白酶和过氧化氢酶。