BmCPV多角体蛋白对异源蛋白的包埋

为了解家蚕质型多角体病毒(BmCPV)的多角体蛋白对异源蛋白的包埋作用,将BmCPV的多角体蛋白基因克隆至昆虫细胞表达载体pIZT/V5-His,转染家蚕卵巢培养细胞(BmN)后通过吉欧霉素(zeocin)筛选获得稳定表达多角体蛋白的细胞株。倒置荧光显微镜观察发现,转化BmN细胞有轻度的病理变化,细胞质中有呈绿色荧光的多角体蛋白结晶,但从转化BmN细胞中纯化的多角体无明显的绿色荧光。以修饰型线性化家蚕杆状病毒BmPAK6感染稳定转化BmN细胞,96 h后纯化多角体,回复感染显示多角体裂解液能感染家蚕BmN细胞,表明BmCPV多角体蛋白能包埋BmPAK6。纯化的多角体及多角体裂解液均能用X-gal显色,表明BmPAK6表达的β-半乳糖苷酶也能被BmCPV的多角体蛋白包埋。研究结果可为获得具有多角体的重组杆状病毒以及开发利用质型多角体蛋白包埋异源蛋白的功能提供新的技术途径。     

家蚕质型多角体病毒(苏州株)S10片段的cDNA克隆及序列分析

为了探讨质型多角体病毒基因的遗传与变异,通过RT-PCR从家蚕(Bombyx mori)质型多角体病毒(Cytoplasmic Polyhedrosis Virus,CPV)苏州株(BmCPV-suzhou)的dsRNA中成功克隆了S10片段。该片段cDNA含有一个744bp的完整开放阅读框(ORF),编码由248个氨基酸残基组成的多角体蛋白,其分子量为28.46kD,等电点为7.12。比较不同宿主来源的CPV多角体蛋白基因氨基酸序列发现,同型CPV多角体蛋白基因高度相似,而不同型的CPV多角体蛋白之间几乎没有同源性;基于质型多角体蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸序列的系统进化分析表明,BmCPV的不同株系与舞毒蛾(Lymantria dispar)CPV(LdCPV)和马尾松毛虫(Dendrolimus punctatus)CPV(DpCPV)聚为一类,表明三种CPV的亲缘关系较近。研究结果为深入探讨质型多角体病毒的变异与分子进化提供了新的参考。     

BmNPV多角体蛋白片段引导外源蛋白固定入多角体的研究

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)晚期产生大量多角体,其主要作用是包埋病毒粒子免受外部恶劣环境的影响,为次代感染提供保障。将BmNPV多角体基因分段克隆并与报告基因——增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合,利用BmNPVPolh+Bac-to-Bac表达系统构建重组病毒,使多角体蛋白与融合蛋白在BmN细胞内共表达。分析感染细胞和形成的多角体中融合蛋白的含量,研究不同的多角体蛋白片段引导EGFP固定入多角体的效果,结果表明构建的5种重组病毒都能大量表达融合蛋白,每种多角体蛋白片段都能引导EGFP固定入多角体内部,且外源融合蛋白在多角体总蛋白中占有较高的比例,其中,以多角体蛋白N末端100个氨基酸和完整多角体蛋白序列作为信号固定EGFP的效率最高。这一现象为解决活性蛋白长期保存提供了新思路,同时对于开发含有毒素蛋白的新型生物杀虫剂和新型疫苗的转运载体也具有较好的参考价值。     

家蚕核型多角体病毒四角形多角体的研究

BmNPVt是从BmNPVh中筛选出的一株四角形多角体病毒突变株。研究表明:BmNPVt的潜伏期、致病力、寄生部位、细胞病变同BmNPVh无甚差异;BmNPVt和BmNPVh之间存在干扰现象;Bm-NPVt的增殖类似于BmNPVh,但囊膜的形成方式两者之间不同。四角形多角体表面粗糙,具有小孔;它的外层电子密度较高,有一厚度为1500A的中间层。多角体蛋白晶格间距离为48A,分子量为29000dolt。同六角形多角体蛋白相比,四角形多角体蛋白的Glu含量较低,Tyr含量相对较高,胰酶酶切图谱两多角体蛋白存在差异。此外,多角体蛋白中Cu、Fe的含量和对酸碱溶解性,两多角体间也存在差异。BmNPVt为杆状,大小为330—340×85nm,纯病毒具有典型的杆状病毒紫外吸收特性,BmNPVt—DNA的变性温度为83℃,分子量为6.94×10~7dolt。镇江株、苏州株、日本株之间病毒DNA的EcoRI酶切图谱存在差异。     

柞蚕核型多角体病毒结构多肽的分析

本文应用电子显微镜、离心分离沉淀和不连续的垂直板 SDS-PAGE等生物化学的分析方法和技术,对柞蚕核型多角体病毒(Antheraea pemyi NuclearPolyhedrosis Virus 简称 APNPV)的多角体蛋白、病毒粒子的结构多肽进行了分析。结果表明,纯化的多角体形态完整,病毒粒子具有典型的昆虫杆状病毒紫外吸收特征;经 EDTA 和热处理的多角体蛋白仅有一条主带,其分子量为29,500±500d;多角体蛋白的氨基酸组成中富含 Asp 和 Glu,而 His 的含量较低(Cys 和 Met未精确测定);病毒粒子至少有23种结构多肽,其分子量范围在17,000～77,900d之间,其中有5条主要的结构多肽。     

利用BmNPV多角体包埋外源蛋白的观察

家蚕核型多角体病毒在感染晚期大量表达产生多角体蛋白,并形成结构致密的超大分子蛋白质晶体,以有效保护内部包埋的病毒粒子,保证子代病毒的传播。借鉴多角体包埋病毒粒子的原理,观察到多角体也能将外源蛋白质固定入多角体内部。利用能形成多角体的BmNPV Polh+Bac-to-Bac表达系统构建的含有绿色荧光蛋白(EGFP)的重组病毒能在表达、产生正常多角体的同时也表达EGFP蛋白。共聚焦分析表明,该重组病毒感染后形成的多角体能够发射绿色荧光。被包埋的EGFP蛋白放置1个月后仍能检测到绿色荧光,干燥处理30min后仍能检测到荧光。由此说明将多角体与外源基因同时表达,多角体中会包埋外源蛋白,且能较长时间保存外源蛋白的生物活性。这一现象为解决蛋白质长期保存提供了新思路,对于开发含有毒素蛋白的新型生物杀虫剂也有很好的参考意义。     

家蚕核型多角体病毒ODV囊膜蛋白基因的融合表达及引导外源蛋白进入多角体的研究

为了探索家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的包涵体衍生病毒(ODV)囊膜蛋白在病毒粒子包涵入多角体过程中的作用,选择2个ODV囊膜蛋白ODV-E25和ODV-E56作为研究对象,利用能够表达多角体蛋白的BmNPV Polh+Bac-to-Bac表达系统构建了融合表达E25-EGFP和E56-EGFP的重组病毒,在家蚕卵巢培养细胞系(BmN)中进行表达和定位分析。结果表明2种融合蛋白均在BmN细胞中成功表达,并于荧光显微镜下观察到绿色荧光主要分布在细胞核中。从感染的BmN细胞中收集纯化多角体,观察到多角体也能激发出绿色荧光,用Western blot方法进一步证实多角体中含有融合蛋白。这一现象表明当囊膜蛋白基因与外源基因融合表达时,外源融合蛋白能够进入多角体内部,推测这2种ODV囊膜蛋白不仅在病毒粒子包涵入多角体的过程中起信号引导作用,并能引导外源目的蛋白进入多角体。     

家蚕质型多角体病毒多角体形态变异的分析

利用扫描电子显微镜观察了在家蚕幼虫体内传代三次后的家蚕质型多角体病毒的多用体形态，发现有部分畸形多角体，这种畸形多角体主要出现在四角形系列中。畸形多角体有二种类型：嵌合式和缺陷型，前者数量多于后者。     

BmNPV多角体蛋白基因编码区结合蛋白的鉴定

家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)是一种具有较强传染性的病毒，在感染的极晚期超高水平表达一种约29 kD的碱溶性多角体蛋白。但该蛋白为病毒复制的非必需蛋白，因此，利用该基因可以被删除或被外源基因替换而不影响病毒的复制的原理构建重组病毒，可以实现外源基因的高水平表达。然而，目前虽已经有较多文献研究多角体蛋白高水平表达的分子机制，但迄今对于多角体蛋白基因编码区的结合蛋白尚不明确。本研究通过DNA pull-down联合质谱技术对结合在多角体蛋白编码区的蛋白质进行鉴定，共鉴定到78个宿主来源的蛋白和49个病毒自身编码的蛋白。对这些蛋白进行GO注释，结果表明这些蛋白除了具有共同的核酸结合功能外，还有其他不同的生物学功能，共同在多角体蛋白的超高水平表达过程中发挥作用。进一步从上述蛋白中筛选出了最值得深入研究的9个宿主蛋白和10个病毒蛋白。对这些蛋白进行深入研究，将为深入揭示多角体蛋白超高水平表达的分子机制提供新的线索。     

家蚕四角形质型多角体病毒的研究

运用生物实验、组织切片、电镜显微技术研究了家蚕六角形野生株(GCPVh)和四角形变异株(GCPVt)质型多角体病毒对家蚕的致病力、感染组织细胞病变、多角体超薄结构。初步表明:GCPVt比GCPVh对蚕致病力强、感染后的中肠细胞病变有差异,同时观察到多角体超微结构在病毒粒子的包埋状态、多角体蛋白的电子密度等方面也存在着一定的差异。     

家蚕Polh+ Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的构建

为利用杆状病毒的强启动子——多角体启动子而构建的重组杆状病毒一般是多角体缺失型(polh-)病毒。为了解决家蚕生物反应器规模化生产中病毒必需经皮接种而效率低下的问题,在建立家蚕Bac-to-Bac快速表达系统的基础上,构建了能形成多角体的家蚕Polh+ Bac-to-Bac表达系统。通过该系统能够产生表达外源目的基因的重组病毒,获得的该重组病毒能在培养细胞内表达,也能通过经口添食感染表达。利用EGFP报告基因分析了该系统的表达效果,构建的重组病毒不仅有效表达了EGFP蛋白,还在细胞核中形成了大量多角体。该系统较好解决了重组病毒必需经皮接种感染的缺陷,提高了生产效率,拓宽了杆状病毒在生物杀虫剂、基因治疗等领域的应用前景。     

家蚕质型多角体病毒苏州核包涵体小种的纯化

从BmCPV_t内发现和分离出一株新的核包涵体小种,初步命名为家蚕质型多角体病毒—苏州核包涵体小种(Cytoplasmic Polyhedrosis Virus——Suzhou nuclear polyhedra forming strain,简称CPV——Suzhou N strain),家蚕感梁CPV——Suzhou N Strain引起的多角体病,与国内外已知的CPV各变异株不同。本病蚕的多角体只在中肠组织圆筒形细胞核内检出,多角体内有许多病毒粒子,病毒粒子球状,具有核蛋白紫外吸收特征性光谱和较强的感染活性,病毒核酸初步鉴定为dsRNA。     

诱导表达极早期基因ie-1反义序列抑制杆状病毒复制的试验

在昆虫杆状病毒的级联复制中,极早期基因ie-1所编码的IE-1蛋白具有重要功能,其中极晚期多角体蛋白基因启动子polh受其调控激活。通过建立具有启动子polh及ie-1长194 bp的反义序列(ie-1-r)的转录载体,使杆状病毒在宿主细胞进行自身复制时受到抑制。试验结果表明,当转入重组转录载体polh/ie-1-r的宿主细胞受携带荧光素酶(luciferase)基因的杆状病毒感染时,能够被诱导激活细胞内多角体蛋白基因启动子转录其携带的ie-1的反义序列RNA,从而部分抑制病毒本身的复制,宿主细胞在病毒感染第4～5天,其荧光素含量与对照RLU(relative light unit)相比下降约1×108个单位,抑制病毒的效果在时间上呈现一定的滞后性。试验结果提示:构建类似的病毒诱导表达系统,通过早期基因激活晚期基因,晚期基因转录抑制早期基因表达的策略,可以对病毒复制进行抑制。     

Neutralizing antibodies against feline parvoviruses in nondomestic felids inoculated with commercial inactivated polyvalent vaccines

The virus neutralization (VN) antibody titers of serum samples from 18 individuals representing 8 carnivore species vaccinated with commercial polyvalent vaccines optimized for domestic cats containing inactivated feline panleukopenia virus (FPLV) were evaluated against canine parvovirus type 2 (CPV2). In addition, the titers among 5 individuals from 4 carnivore were evaluated against antigenic variants of feline parvoviruses; FPLV, CPV2, CPV2a, CPV2b, CPV2c, mink enteritis virus type 1 (MEV1) and MEV2. The polyvalent vaccines induced cross-reactive VN titers against antigenic variants of feline parvoviruses in nondomestic felids. However, we observed very low cross-reactive VN antibody in lions and Siberian tigers, therefore we should pay attention to CPV infections in these animals even if they were vaccinated with inactivated FPLV vaccines.     

Host range relationships and the evolution of canine parvovirus.

Canine parvovirus (CPV) is an example of an unusual class of emerging virus-those that gain an altered host range through genetic variation and subsequently become widespread pathogens of their new and previously resistant host species. CPV was first detected in 1978 as the cause of new diseases in dogs throughout the world, when it rapidly spread throughout domestic populations, as well as becoming widespread in wild dogs. CPV was soon shown to be a variant of the long recognized feline panleukopenia virus (FPV), from which it differed in less than 1% at the nucleotide sequence level. Genetic analysis showed that virtually all of the biological differences between CPV and FPV, including the canine host range, were determined by three or four sequence differences in the viral capsid protein gene. Analysis of the atomic structures of the CPV and FPV capsids showed that the differences controlling host range were located within two different structural regions and were exposed on the capsid surface. The CPV which first emerged in 1978 appeared to be derived from a single ancestral sequence, which has allowed the ready analysis of the subsequent evolution of the virus in nature. Sequence analysis has also revealed that CPV strains have undergone a series of evolutionary selections in nature which have resulted in the global distribution of new virus variants. This was first seen in the global replacement between 1979 and 1981 of the original (1978) strain of the virus by a genetically and antigenically variant strain, and the subsequent widespread selection of other variants which have also become globally distributed. The genetic and antigenic variation in the virus strains was also correlated with changes in the host range of the virus, in particular in the ability to replicate in cats, and in canine host range differences seen in tissue culture cells.