马岗鹅RIG-Ⅰ基因扩增及序列分析

为研究马岗鹅维甲酸诱导基因Ⅰ(Retinoic acid inducible gene-Ⅰ,RIG-Ⅰ)的基因序列特征,试验扩增了马岗鹅RIG-Ⅰ基因,分析了马岗鹅RIG-Ⅰ基因序列并表达了其蛋白。结果显示:马岗鹅RIG-Ⅰ基因cDNA的开放阅读框全长为2 805 bp,编码934个氨基酸,蛋白分子量约为106.63 ku;马岗鹅RIG-Ⅰ蛋白具有2个串联的N端半胱天冬酶募集结构域、DExD/H-box RNA解旋酶结构域和C端结构域;马岗鹅RIG-Ⅰ与其它鸟类亲缘关系较近,与哺乳动物亲缘关系次之,与鱼类亲缘关系较远;马岗鹅RIG-Ⅰ蛋白结构以α-螺旋为主(占比50.21%),无规则卷曲次之(占比37.69%),延伸链较少(占比12.10%);马岗鹅RIG-Ⅰ真核表达质粒成功表达了约106 ku的蛋白。研究成功鉴定了马岗鹅RIG-Ⅰ基因并表达其蛋白,为进一步制备该蛋白的特异性抗体和研究鹅RIG-Ⅰ在抗病毒天然免疫中的功能奠定了基础。     

TLR-4介导的鹅β-防御素1抗肠炎沙门菌感染的信号传导机制初探

为研究鹅β-防御素1(AvBD1)的生物学特性以及初步尝试探寻其抗肠炎沙门菌的作用机理,利用RT-PCR方法从鹅骨髓组织中扩增到鹅AvBD1基因片段,并将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1的EcoRⅠ和SalⅠ双酶切位点上,构建重组表达质粒pGEX-goose AvBD1.将重组质粒转化大肠杆菌BL21,于37℃用IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳表明,重组鹅AvBD1蛋白在原核高效表达(相对分子质量约31 ku).该重组蛋白经纯化后测定其体外抗菌活性与理化特性.结果显示,鹅AvBD1基因cDNA片段大小为198 bp,编码65个氨基酸残基.经相似性分析发现鹅AvBD1氨基酸序列与鸵鸟AvBD1氨基酸序列相似性最高,为77.1％,而且重组鹅AvBD1蛋白具有广谱的抗菌活性,对12种细菌(包括革兰阳性菌和革兰阴性菌)均具有抑菌作用.高盐离子浓度显著降低重组鹅AvBD1蛋白的抗菌活性,且该重组蛋白的溶血活性极低.试验表明,肠炎沙门菌确实会诱导鹅AvBD1基因在鹅骨髓组织中的表达,说明鹅AvBD1起到了抗肠炎沙门菌感染的作用,而这种作用有可能与TLR4介导的信号转导有关.     

鹅Toll样受体7基因的克隆及其功能分析

为克隆鹅Toll样受体7(go TLR7)基因并初步研究其生物学功能,以鹅脾脏组织总RNA反转录的c DNA为模板,PCR扩增go TLR7基因的CDS区序列,成功克隆了go TLR7基因,其全长3 141 bp,编码1 046个氨基酸。通过RT-PCR分析鹅不同组织中TLR7基因的表达,结果显示不同组织中TLR7基因的表达存在差异。构建真核表达质粒pc DNA3.1(+)-go TLR7,并与荧光素酶报告载体p GL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro]共转染HEK293T细胞,检测其TLR7配体活性。结果显示,鹅TLR7可以对R848产生应答,能显著提高细胞NF-κB活性,并诱导IL-8的高水平分泌。     

猪TLR4基因在F18大肠杆菌抗性型和敏感型资源群体间的差异表达分析

本研究旨在检测TLR4基因mRNA在猪各个组织的分布以及在F18大肠杆菌抗性型和敏感型群体间差异表达水平,为探讨该基因在免疫识别和F18大肠杆菌抗性中发挥的作用提供理论依据。本试验运用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术进行定量测定。首先,各取8头35日龄F18大肠杆菌抗性型和敏感型苏太仔猪组织样,包括心脏、肝脏、脾脏等11个组织,提取总RNA,以GAPDH基因为内参基因,进行实时荧光定量PCR。对TLR4基因mR-NA进行均一化处理,利用荧光阈值(Ct值)计算TLR4基因mRNA在各个组织以及F18大肠杆菌抗性型和敏感型群体间表达量。结果显示,TLR4 mRNA在猪各种组织中广泛表达,在肺、淋巴结、肾脏和脾脏等免疫器官中表达量较高,F18大肠杆菌敏感型的TLR4基因表达量普遍高于抗性型个体的表达量,在各个组织中(除胃外)TLR4表达量差异倍数从1.083到2.980不等;在肺、淋巴结、肾脏和胸腺组织中,F18大肠杆菌敏感型的TLR4基因表达量显著高于抗性型个体的表达量(P<0.05)。本研究结果表明,TLR4基因通过天然免疫识别机制对猪F18大肠杆菌病等革兰氏阴性疾病有一定的影响,TLR4基因表达量...     

山羊先天免疫TLR4基因克隆、组织表达分析及其凋亡功能初探

为了解山羊TLR4的分子结构、表达特性和免疫调节功能,试验以NCBI中山羊TLR4基因预测序列为模板,采用RACE扩增技术获得初生羔羊TLR4基因c DNA序列,并进行生物信息学分析,利用qRT-PCR技术检测羔羊各组织TLR4基因表达量,构建p EGFP-N1-TRL4重组质粒检测在真核细胞中的凋亡功能。结果表明:克隆得到TLR4基因c DNA序列长2 728 bp,CDS全长2 526 bp,编码841个氨基酸。山羊TLR4蛋白是1个跨膜蛋白,胞外包含2个LRRs-RI、1个LRRs_8及1个TPKR-C2,胞内含有TIL受体结构域、77个潜在磷酸化位点、9个糖基化位点,且与绵羊TLR4氨基酸序列同源性最高。TLR4基因在脾脏中的表达量较高(P0.05),肝脏、胸腺和肾脏依次减少,颌下腺、肺脏及血液较脾脏显著降低(P0.05)。说明试验成功构建具有TLR4基因完整CDS序列的p EGFPN1-TLR4重组载体,且能够在HEK293T细胞中正常表达,具有加快细胞凋亡的作用。山羊TLR4基因编码蛋白具有免疫学结构和功能特征,在免疫器官中可能参与细胞凋亡过程。     

三黄鸡TLR4基因的克隆及序列分析

为了解三黄鸡天然免疫受体TLR4基因的特点,本试验根据GenBank上已公布的其它品种鸡的TLR4基因序列设计引物,利用三黄鸡肝脏提取总RNA为模板,获得三黄鸡TLR4基因的cDNA全序列。基因序列分析表明,三黄鸡TLR4基因编码区全长2532 bp,编码843个氨基酸,N端含有30个氨基酸组成的信号肽,分子质量为95.68407 ku,理论等电点为6.83。通过克隆三黄鸡TLR4基因并对其进行相似性分析。结果发现,三黄鸡与日本鹌鹑、珍珠鸡、家鹅、绿头鸭的相似度在86%以上;与芦花鸡、贵妃鸡、北京油鸡、莱芜黑鸡的相似度在99%左右,并且遗传进化分析结果显示所有禽类处于同一分支,这证明TLR4在禽类中具有很高的保守性。这些试验结果为TLR4的深入研究提供了理论基础,同时为三黄鸡的抗病育种提供新思路。     

鹅GnRH基因CDS区克隆、序列分析及原核表达

本研究旨在了解鹅GnRH基因的CDS区序列及其蛋白表达情况,研究鹅GnRH蛋白的生理功能,为进一步阐明GnRH蛋白影响鹅繁殖性能的调控机制提供理论基础。采用RT-PCR方法从溆浦鹅下丘脑扩增获得GnRH基因的CDS区序列,将测序正确的DNA序列定向克隆到pET28a(+),构建表达载体pET28a-GnRH,并转化至BL21(DE3)大肠杆菌表达目的蛋白,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE检测和Western blot分析。结果显示:获得的溆浦鹅GnRH基因CDS区部分序列,含有270个核苷酸,编码前体蛋白中的90个氨基酸;溆浦鹅GnRH基因CDS区在大肠杆菌中得到高效表达,GnRH基因CDS区的目的蛋白为9 900,最终测得菌体湿重为0.6g/L,纯化后得到的蛋白为20~30mg/L;清晰检测到GnRH基因表达的蛋白特异带,试验获得的抗体对原核表达的GnRH蛋白具有特异性反应;鹅GnRH基因在动物进化中高度保守,研究得到的鹅GnRH前体蛋白可为进一步研究GnRH基因的生物功能以及其对鹅就巢、产蛋等繁殖性状的影响奠定基础。     

水貂部分Toll样受体(TLRs)基因的分子克隆、序列分析及组织表达分析

试验旨在研究Toll 样受体(Toll-like receptors,TLRs)在水貂抗病毒免疫中的作用机制,并为抗病育种积累可供选择的基因素材。本试验以雪貂TLRs基因为参考序列设计4对引物对水貂TLR4、TLR6、TLR7及TLR8进行分子克隆,并对所得序列进行生物信息学分析,进一步利用半定量RT-PCR技术分析TLR4和TLR7基因mRNA在不同年龄水貂各组织中的表达情况。结果表明,水貂TLRs与食肉目动物(雪貂、北极熊、大熊猫、海象、海豹、犬、老虎和猫)具有较高的同源性,在系统发育树中距离最近;组织表达分析表明TLR4和TLR7在检测的组织中广泛表达且表达量存在差异,相比成年水貂,仔貂各组织中TLR4或TLR7基因表达量更高。     

TLRs基因家族在鸭法氏囊中的表达模式及分子进化分析

旨在探究TLRs基因家族(toll-like receptors,TLRs)在鸭法氏囊中的表达情况和功能差异。本研究利用qRT-PCR检测鸭法氏囊胚后发育中TLRs基因家族的表达情况,对表达模式进行聚类分析,并分别构建了TLRs启动子区和编码区的系统进化树。结果显示,TLR2a在鸭法氏囊2周龄(W2)和6周龄(W6)时期的表达水平显著高于4周龄(W4)时期(P0.05),其余TLRs各成员在鸭法氏囊胚后发育各阶段的表达差异不显著(P0.05);TLR1a、TLR2a、TLR2b以及TLR3、TLR5、TLR15具有相似的表达模式;在编码区进化树上TLR1a、TLR1b、TLR2a、TLR2b聚为一支,与TLR15距离较近,TLR3和TLR5在同一分支上,TLR4和TLR21为单独两个分支,TLR21与其他TLRs成员距离最远;而TLRs基因家族启动子区进化树没有明显规律。结果提示,TLRs家族成员可能不参与鸭法氏囊胚后发育调控过程;TLR2a和TLR2b,以及TLR3、TLR5和TLR15可能具有相似功能,TLR1a和TLR1b虽然具有较高的序列相似性,但可能在进化中出现了功能分化。TLRs表达模式与启动子区序列进化无明显联系。     

牦牛Toll样受体8和9基因克隆及组织表达分析

为了解牦牛Toll样受体8(TLR8)和9(TLR9)蛋白的结构特征及其基因的组织表达规律,丰富牦牛TLRs基因研究的理论数据,应用RT-PCR方法克隆牦牛TLR8、TLR9基因,并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR技术构建组织表达谱。结果显示,两个基因cDNA全长分别为3 102bp和3 090bp。牦牛TLR8和TLR9基因与野牦牛、黄牛和绵羊之间的同源性都很高,均在95%以上。牦牛TLR8和TLR9蛋白都具有胞外LRRs功能域、胞内区TIR结构域、低复杂度区;另外,TLR8还具有1个C端富集亮氨酸重复序列(LRRCT)和跨膜结构域。两个基因在10个组织中均有不同程度的表达,在肾脏中表达量最高,而在大肠中表达量最低。本研究成功克隆了牦牛TLR8和TLR9基因的完整编码区,并揭示了它们在各组织器官的表达规律,为进一步研究TLRs在牦牛体内的免疫机制奠定了基础。     

不同月龄红河黄牛抗病基因组织mRNA表达量分析

为了解天然抗性相关巨噬细胞蛋白1基因(SLC11A1)、Toll样受体2(TLR2)、Toll样受体4(TLR4)、γ-干扰素基因(BoIFN-γ)、α-干扰素基因(BoIFN-α)和主要组织相容性复合物Ⅱ类基因DRB3(BoLA-DRB3)6种抗病相关基因,在红河黄牛不同组织的表达分布情况,根据GenBank收录的基因序列设计特异性引物,以β-actin基因为内部参照基因,应用RT-qPCR技术测定12、36、60月龄公牛不同组织的mRNA表达量。结果表明,SLC11A1、TLR2、TLR4、BoIFN-γ、BoIFN-α和BoLA-DRB3基因在心、肝、脾、肺、肾、淋巴结和背最长肌组织中表达量存在月龄组间差异(P0.05),TLR2基因在肾组织表达量为36月龄最高,但在其他各组织表达量均为60月龄最高;TLR4基因在各组织中表达量均为36月龄最高;SLC11A1基因在36月龄黄牛心、肝、脾和淋巴结表达量最高,在肺、肾和背最长肌组织表达量60月龄最高;BoLA-DRB3基因在淋巴结组织表达量36月龄和60月龄均较高;BoIFN-α基因的组织表达模式类似SLC11A1;BoIFN-γ基因在肾和淋巴结表达量36月龄和60月龄最高。由此可见,6种基因在不同组织最高表达量出现于36～60月龄。     

中国南方灰鹅季节性繁殖活动的调控模式

中国地缘辽阔,南北地方鹅的繁殖活动特点存在很多差异,南方以广东省的灰鹅为代表。广东省的灰鹅种类主要包括狮头鹅、马岗鹅、乌鬃鹅、阳江鹅等,其中以马岗鹅饲养最为普遍和最具代表性。马岗鹅原产广东省开平市,具有体型大小适中、屠     

过表达TLR4基因绵羊瘤胃与肠道宏基因组分析

胃肠道微生物生态系统参与机体物质代谢、生物屏障、免疫调控等生理过程,对维持宿主健康具有重要作用。Toll样受体4(Toll-like Receptor 4,TLR4)除在机体天然免疫过程中扮演关键角色之外,胃肠道中TLR4基因的表达可能参与微生物区系结构的塑造。本研究利用前期获得的过表达TLR4基因绵羊,基于宏基因组测序技术探讨TLR4基因高水平表达对绵羊胃肠道微生物群体多样性、丰度及生物学功能的影响。结果表明：TLR4基因过表达后对绵羊瘤胃(P=0.35)和肠道(P=0.56)中微生物Alpha多样性无显著影响;胃肠道中微生物优势菌群(相对丰度>1%)在门、属、种不同分类水平上的区系结构无显著变化。进一步分析TLR4基因过表达对胃肠道中革兰氏阴性菌群(相对丰度<1%)组成的影响,在瘤胃和肠道中分别鉴定出8个和13个差异菌属(P<0.05),33个和32个差异菌种(P<0.05);其中,Helicobactersp.MIT05-5293(P=0.03)和Yersinia pseudotuberculosis(P=0.048)在瘤胃中存在显著差异,Campylob...     

奶牛TLR4基因编码区生物信息学分析

TLR4基因在哺乳动物细胞表面有较高的表达量,在抗击感染性免疫中发挥重要的作用。本研究对奶牛TLR4基因编码蛋白质的结构和功能进行分析表明,奶牛TLR4基因编码区长度为3738bp,共1246个氨基酸残基,编码20种不同的氨基酸,α-螺旋(Hh)为329bp,延伸链(Ee)为30bp,自由卷曲(Cc)为378bp;编码蛋白原子数为13521个,其中H原子较多,分数正残数为0.09,等电点为6.74;分子体积为115841.00V/M,脂肪族指数105.75,其疏水性残基只有0.02。     

人工感染禽腺病毒血清4型病毒对鹅组织中免疫相关因子基因表达的影响

以鹅为研究对象,人工感染禽腺病毒(fowl adenovirus,FAdV),分别在攻毒后36,72 h和3,7 d,采集脾脏、哈德氏腺、骨髓、法氏囊和盲肠扁桃体,运用实时荧光定量PCR,检测鹅感染FAdV-4后,免疫器官中FAdV-4载量及免疫相关因子基因表达差异,初探FAdV-4对鹅致病性以及鹅对该病毒的天然免疫反应机制。结果表明,与对照组相比,在法氏囊、盲肠扁桃体和哈德氏腺中检测到FAdV-4,感染初期TLR2和TLR3显著上调,感染后期TLR5和TLR15显著下调;AvBD1、AvBD9、AvBD10和AvBD16在部分组织中表达量显著升高,且大部分细胞因子表达受到抑制。研究表明,感染FAdV-4后,会激活宿主先天免疫反应,为研究FAdV-4与宿主先天免疫的相互作用提供新的思路。     

牦牛Toll样受体10基因的克隆与分析

旨在获得牦牛TLR10基因序列并进行生物信息学分析,同时分析其组织表达谱,为进一步研究牦牛TLR10基因的功能提供资料。以GenBank中牛TLR10基因序列设计引物,在牦牛脾组织中克隆出牦牛TLR10基因,应用半定量RT-PCR技术检测该基因组织表达情况。生物信息学分析表明,牦牛TLR10基因编码区全长2 328bp,编码氨基酸776个,分子质量196.3ku,理论等电点为4.94;TLR10编码的蛋白整体带负电荷,并表现为亲水性;进化树与同源性分析表明,牦牛与黄牛的同源性最高,达到99.4%,与水牛、绵羊、梅花鹿等哺乳动物遗传距离很近。组织表达谱显示牦牛TLR10基因在12个组织中均有表达。结果显示,牦牛TLR10基因高度保守,具有稳定的抗原特征。     

伊犁鹅产蛋前后各期卵巢转录谱的构建及卵泡发育相关基因的分析

【目的】构建产蛋前后各期伊犁鹅卵巢转录组文库,结合生物信息学分析揭示不同产蛋期伊犁鹅卵巢组织差异表达基因,并鉴定出影响鹅卵巢发育的关键基因,为伊犁鹅的繁殖调控提供理论参考。【方法】选择处于开产期（KL组）、产蛋期（CL组）及休产期（XL组）的伊犁鹅各4只,屠宰后取其卵巢组织,用于构建卵巢转录组文库。通过新基因挖掘、基因差异表达、基因注释以及蛋白互作网络分析筛选出与鹅卵泡发育相关的候选基因;随机挑选8个差异表达基因,应用实时荧光定量PCR验证其表达情况。【结果】伊犁鹅卵巢组织学结果表明,在开产期时,伊犁鹅卵巢表面有大量初级卵泡,而产蛋期卵巢则显示出卵泡的层级性,在休产期卵巢中可观察到卵泡出现向内凹陷、闭锁的现象。通过转录组测序（RNA-Seq）,从构建的12个伊犁鹅卵巢cDNA文库中获得有效读数57 811 186~85 328 377条,Q30值均>93.38%,每个样品所产的测序读数于鹅参考基因组上的比对率在82.79%~89.24%。在卵巢中注释的新基因共有1 112个,单核苷酸多态性（SNP）位点总数为1 642 273~2 425 069个;SNP和插入缺失（InDel）均主要注释于内含子区域;各时期的可变剪切类型主要集中为最后1个外显子可变剪切（TSS）及第1个外显子可变剪切（TTS）。在KL vs CL、XL vs CL及XL vs KL组中分别有337、1 136和525个差异表达基因,共有差异表达基因为α2A肾上腺素能受体（ADRA2A）、表皮蛋白（CP）、非转移性黑色素瘤糖蛋白B （GPNMB）及α-1-抗胰蛋白酶样（LOC106033756）。GO功能富集分析发现,差异表达基因主要富集在肽基酪氨酸磷酸化的正调控、细胞黏附及质膜外侧等过程。KEGG通路富集分析发现,差异表达基因主要显著富集于神经活性配体-受体相互作用、ECM-受体相互作用及类固醇生物合成等。结合蛋白互作网络分析,筛选到与鹅卵巢发育相关的潜在调控因子Bruton’s酪氨酸激酶（BTK）、血小板源性生长因子受体α（PDGFRA）、整合素β3（ITGB3）等。实时荧光定量PCR结果显示,RNA-Seq结果准确可靠。【结论】本研究揭示了产蛋前后各期伊犁鹅卵巢组织中的基因表达差异,筛选到影响伊犁鹅卵巢发育的神经活性配体-受体相互作用、ECM-受体相互作用、类固醇生物合成等重要通路与BTK、PDGFRA和ITGB3等关键候选基因,为了解鹅卵巢组织调控产蛋性能的分子机制提供了理论支撑。     

乌苏里貉TLR8基因的分子克隆、序列分析及组织表达分析

为了解乌苏里貉TLR8基因特点及其在不同组织中的表达水平,本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆其c DNA全长序列,应用生物学软件分析该基因及预测其编码蛋白的特征,并对该基因在乌苏里貉不同组织中的表达水平进行检测。结果显示该基因全长3 191 bp,ORF全长3 117 bp,编码1 038 aa,含有Toll-like受体家族典型的结构域特征。同源性分析显示乌苏里貉TLR8基因核苷酸序列与犬同源性最高,达99.3%,与其他食肉目哺乳动物也具有较高的同源性,在89.2%~92.9%。组织表达分析显示TLR8基因在乌苏里貉各组织中广泛表达但表达量存在差异。本研究结果为进一步研究乌苏里貉抗病毒免疫及育种相关研究奠定了基础。     

马岗鹅TLR3基因选择性剪切体的克隆及生物信息学分析

为了研究鹅Toll样受体3(gTLR3)基因选择性剪切体在抗感染免疫中的作用,根据鸡、人和小鼠TLR3基因序列设计引物,利用RT-PCR和SMART RACE技术,首次克隆了鹅TLR3基因的选择性剪切体。所得基因序列提交GeneBank,登录号:KC292271。结果表明:核酸序列分析表明,鹅TLR3基因选择性剪切体开放阅读框长2283 bp,编码761个氨基酸,该蛋白等电点7.56,分子量为86.29 kD;与鹅、鸡、小鼠、猪、鱼、牛、羊和人的同源性分别为84.71%、74.40%、48.63%、50.38%、40.09%、50.16%、50.71%和50.98%。推导的氨基酸序列分析显示,在其胞外具有LRRs结构域,跨膜区和不完整的TIR结构域,N末端存在信号肽,且可能在26～27位氨基酸处存在裂解位点。胞外区有14个明显的LRR和15个N连接的糖基化位点。文章首次证实鹅TLR3选择性剪切体的存在,为进一步研究该基因的功能和蛋白质的特性奠定了基础。     

新城疫病毒人工感染鹅脾脏差异表达蛋白质组初步分析

脾脏是新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)感染的重要靶器官,本试验旨在从分子水平上分析NDV与宿主之间的相互作用,探寻早期基因Ⅳ型强毒Herts/33和晚期基因Ⅶ型强毒JS5/05造成鹅脾脏病变差异的相关蛋白。30日龄非免疫鹅分别人工感染NDV强毒株Herts/33和JS5/05,并于感染后36、72、108h采集2个感染组和对照组的鹅脾脏,提取脾脏蛋白,以17cm、pH5～8的IPG胶条进行二维电泳,运用PDQuest 8.0.1软件对凝胶图谱进行差异蛋白分析。结果显示:与对照组相比,Herts/33感染组和JS5/05感染组脾脏组织分别有154个和148个蛋白出现了显著的差异表达,其中有86个蛋白点是不同感染组共有的差异点,包括52个感染后上调表达蛋白点,34个下调表达蛋白点;另外,有130个差异蛋白点为NDV感染鹅后不同毒株之间产生的差异表达,包括71个感染后上调表达蛋白点,59个下调表达蛋白点。基因Ⅳ型NDV强毒和基因Ⅶd亚型NDV强毒分别感染鹅后,能引起宿主脾脏组织蛋白表达谱发生不同的改变,这为进一步研究Ⅶd亚型NDV对水禽致病性增强的机制提供了重要线索。