梨小食心虫气味受体GmolOR10基因克隆及表达谱分析

为研究梨小食心虫Grapholita molesta Busck嗅觉通讯分子机制,本研究应用RT-PCR克隆获得了梨小食心虫气味受体基因GmolOR10的完整开放阅读框,并对其序列结构进行了相关生物信息学分析,最后采用实时荧光定量PCR对GmolOR10在梨小食心虫成虫不同组织(触角、头、胸、腹、足、翅)与不同发育阶段的表达模式进行了定量分析。结果表明,GmolOR10编码区长1 194 bp,编码397个氨基酸,等电点和相对分子量分别为8.57和46.14 kD,有7个跨膜结构域。多序列比对与系统发育树结果显示GmolOR10与卷蛾科苹果蠹蛾Cydia pomonella CpomOR18和山毛榉卷叶蛾Cydia fagiglandana CfagOR18的氨基酸序列一致性较高,分别为84.38%和83.38%。GmolOR10在雄成虫触角中表达量较高,极显著高于雌虫触角(P<0.01),在雌、雄成虫头部也有较高的表达量,在成虫其他组织表达量很低。不同发育阶段的表达谱显示,GmolOR10在梨小食心虫的不同发育阶段均有表达,在成虫期的表达量最高(在雌雄成虫中的表达量均呈现出随着...     

茄无网蚜Acyrthosiphon solani气味结合蛋白OBP7的序列特点及表达谱分析

茄无网蚜以刺吸的方式为害大豆,近年田间调查结果表明其抗药性逐年增强,危害呈上升趋势。为了解茄无网蚜气味结合蛋白的作用机制,寻找新的防治靶标,本研究利用荧光定量PCR和RACE技术克隆了茄无网蚜气味结合蛋白基因Asolobp7(以下均用Asolobp7表示茄无网蚜OBP7基因)(GenBank登录号为KF813022)。并通过荧光定量PCR方法分析茄无网蚜不同发育阶段1、2、3、4龄若虫、无翅成蚜、有翅成蚜和不同组织头部(不含触角)、胸部、腹部、触角、足中Asolobp7在mRNA水平上的相对表达量,同时用DPS进行单因素方差分析。结果表明,Asolobp7基因cDNA序列全长735 bp,编码155个aa,预测分子量为17.52 kD,等电点为8.78,N-末端疏水区包含由31个氨基酸组成的信号肽。荧光定量PCR结果表明,Asolobp7在茄无网蚜的不同组织中均有表达,其中触角组织表达量最高,极显著高于其它组织,头部(不含触角)、足、胸部、腹部、翅表达量相对偏低,其中头部(不含触角)、足差异不显著,胸部、腹部、翅差异不显著;Asolobp7在茄无网蚜的不同发育阶段也均有表达,1、2、3龄和有翅蚜时期表达量偏低且差异不显著,4龄时期有显著增高,无翅成蚜时表达量最高,与其它发育阶段差异极显著。以上结论说明Asolobp7主要表达于茄无网蚜的触角组织中,且在无翅成蚜时期最为活跃。说明Asolobp7与触角所承担的嗅觉行为有着密切联系且在无翅成蚜时期的嗅觉活动中发挥着重要的作用,为寻找新的防治策略奠定了基础。     

梨小食心虫谷胱甘肽S-转移酶基因序列分析及其与吡虫啉的相关性

为明确梨小食心虫Grapholita molesta谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase,GST）对吡虫啉的代谢作用,基于不同亚致死浓度吡虫啉处理的梨小食心虫转录组数据库进行筛选,并通过生物信息学分析、系统发育树构建、保守位点序列比对、分子对接和表达谱分析来确定梨小食心虫代谢吡虫啉过程中的关键GST。结果显示,共筛选到梨小食心虫的17个GST基因,其中GmGSTS1、GmGSTD2、GmGSTE5和GmGSTE4基因编码的蛋白与苹果蠹蛾Cydia pomonella的GST蛋白有较高的相似性,相似度达69.12%～89.66%。梨小食心虫GmGSTD2蛋白G位点和H位点的保守氨基酸与褐飞虱Nilaparvata lugens及烟粉虱Bemisia tabaci代谢吡虫啉相关GST氨基酸序列完全一致。吡虫啉与梨小食心虫GmGSTD2蛋白G位点的ARG-66和H位点的TYR-112可以形成稳定的氢键;与GmGSTE3蛋白G位点的LEU-45和H位点的LYS-123可以形成稳定的氢键。在吡虫啉处理后,梨小食心虫体内GmGSTD2和GmGSTE3基因的表达量显...     

花椒窄吉丁气味结合蛋白AzanOBP5的克隆与表达

为进一步明确花椒窄吉丁Agrilus zanthoxylumi气味结合蛋白AzanOBP5在昆虫嗅觉识别过程中的功能,基于花椒窄吉丁转录组数据(SUB6796283)利用cDNA末端快速扩增技术对花椒窄吉丁气味结合蛋白基因AzanOBP5进行全长克隆并进行生物信息学分析;通过实时荧光定量检测技术测定基因AzanOBP5在成虫不同组织中的表达情况。结果显示,克隆获得基因AzanOBP5全长740bp(GenBank登录号为MT318834),5''端非编码区为172bp,3''端非编码区114bp,开放阅读框453bp,编码150个氨基酸。序列分析表明,AzanOBP5氨基酸序列与苹果小吉丁Agrilus mali AmalOBP5的氨基酸序列一致性最高。成功构建pET-21a-AzanOBP5重组质粒并在大肠杆菌Escherichia coli中表达,经过诱导和纯化条件的优化及Western blot鉴定,得到的融合蛋白His-AzanOBP5大小符合预期。基因AzanOBP5在雌雄成虫的不同组织中均有表达,其中在成虫腹部的表达量最高。表明花椒窄吉丁气味结合蛋白基因AzanOBP5除参与嗅觉识别过程外,还可能具有其他生理功能。     

小地老虎化学感受蛋白AipsCSP2配体结合特性分析

为了明确小地老虎化学感受蛋白基因AipsCSP2在雌、雄成虫各组织中的表达情况,解析AipsCSP2蛋白的配体结合特性并探讨其功能。本文基于小地老虎性腺转录组数据,利用PCR技术克隆AipsCSP2基因,并进行生物信息学和系统进化分析;采用qPCR技术测定该基因在小地老虎雌、雄成虫不同组织中的表达水平; 利用原核表达技术体外表达并纯化AipsCSP2蛋白;最后采用荧光竞争性结合试验测定该蛋白与小地老虎和其他鳞翅目昆虫性信息素组分以及主要寄主植物挥发物的结合能力。结果显示AipsCSP2基因开放阅读框（open reading frame,ORF）长度为360 bp,编码119个氨基酸,氨基酸序列中具有4个保守半胱氨酸位点,是典型的化学感受蛋白;组织表达谱结果显示AipsCSP2基因在雌成虫性腺和雄成虫附腺中特异高表达,在其他组织中表达量较低;荧光竞争性结合试验结果表明,AipsCSP2蛋白和小地老虎性信息素组分顺-11-十六碳乙酸酯的合成前体顺-11-十六碳醛有着极其强的结合能力,Ki值为1.48 μmol/L,此外AipsCSP2蛋白和其他鳞翅目昆虫的醇类和醛类性信息素如十四烷醇、顺-9-十六碳醛、顺-7-十六碳醛也有着极其强的结合能力,Ki值分别为1.10 μmol/L、0.63 μmol/L和1.51 μmol/L,和小地老虎性信息素组分顺-7-十二碳乙酸酯、顺-8-十二碳乙酸酯的结合能力为中等,与小地老虎主要寄主植物挥发物结合能力较弱或不结合。推测AipsCSP2蛋白可能主要参与了小地老虎性信息素的合成与识别过程,并在生殖活动中起着重要的作用。     

桃蚜组织蛋白酶基因CTSB-16D和CTSB-348的克隆、表达谱及对不同环境胁迫的响应

为了探索组织蛋白酶基因CTSB-16D和CTSB-348在桃蚜Myzus persicae(Sulzer)响应高低温和UV-B胁迫中的作用, 通过RT-PCR技术克隆了桃蚜CTSB-16D和CTSB-348基因, 利用生物信息学方法分析了它们的序列特征;采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, RT-qPCR)技术检测了2个基因在桃蚜不同发育阶段的相对表达量及经高温、低温和UV-B胁迫不同时长的无翅成虫中的相对表达量。克隆获得了桃蚜CTSB-16D(GenBank登录号:MZ962352)和CTSB-348(GenBank登录号:MZ962353)基因, 序列长度分别为1 096 bp和1 101 bp, 开放阅读框(ORF)分别为1 017 bp和1 023 bp, 分别编码338个和340个氨基酸, 蛋白相对分子量为38.14 kD和37.52 kD, 等电点(pI)为5.46和5.99。系统发育分析表明, 桃蚜CTSB-16D和CTSB-348均与豌豆蚜Acyrthosiphon pisum (XP_003246386.1、NP_001119608.1) CTSB亲缘关系最近。RT-qPCR分析表明, CTSB-16D和CTSB-348在桃蚜不同发育阶段均有表达, 分别在1龄若虫和无翅成虫中的表达量最高。高、低温和UV-B胁迫对CTSB-16D和CTSB-348基因的表达具有明显的诱导作用, 且表达量均随时间的延长呈先上升后下降的趋势;4℃胁迫下, CTSB-16D和CTSB-348表达量均在90 min时达到峰值;36℃胁迫下, CTSB-16D和CTSB-348表达量均在30 min时达到峰值;UV-B胁迫下, CTSB-16D和CTSB-348表达量分别在60 min和120 min时达峰值。桃蚜CTSB-16D和CTSB-348基因在不同发育阶段差异表达, 且响应温度和UV-B的胁迫, 推测两个基因参与桃蚜的生长发育并在桃蚜响应环境胁迫中发挥了重要作用。     

棉铃虫小分子热激蛋白sHSP22.0基因的克隆及表达谱分析

棉铃虫Helicoverpa armigera是一种重要的农业害虫,本文旨在研究小分子热激蛋白在其生长发育过程、抵御高温及Cry1Ac杀虫蛋白中的功能。利用PCR结合RACE技术克隆了棉铃虫sHSP22.0(small heat shock protein 22.0)基因,通过生物信息学软件分析了棉铃虫sHSP22.0基因序列,利用实时荧光定量qRT-PCR分析了该基因在棉铃虫不同生长发育阶段和组织中的表达模式;并分析了该基因受高温及Cry1Ac全长蛋白的诱导效应。获得了棉铃虫sHSP22.0(GenBank登录号: XP_021196802.1) 761 bp cDNA片段,其开放阅读框576 bp,编码191个氨基酸,具有小分子热激蛋白典型的α-晶体结构域(α-crystallin domain,ACD)。sHSP22.0在棉铃虫4龄和5龄期特异性表达,尤其在5龄幼虫的表皮、中肠和后肠内特异性表达。该小分子热激蛋白受温度和Cry1Ac全长蛋白的诱导后显著高表达。sHSP22.0不仅在暴食期及肠道内特异性表达,而且响应Cry1Ac全长蛋白的诱导,表明它在棉铃虫消化吸收及抵御外源物的活动中可能起到重要的作用。     

西花蓟马FoccOBP3的分子克隆、序列分析及表达特征

鉴定昆虫嗅觉相关蛋白基因并对其序列和时空表达进行研究,可为阐明昆虫与寄主间的化学通讯机制提供依据。本文新克隆并鉴定获得一个西花蓟马OBP基因FoccOBP3（GenBank登录号：MT682352）,cDNA序列全长1226 bp,读码框全长432 bp,编码143个氨基酸残基。氨基酸序列中六个保守的半胱氨酸位点排列方式为C₁—X₂₆—C₂—X₃—C₃—X₃₇—C₄—X₁₀—C₅—X₈—C₆,完全符合典型气味结合蛋白所具有的六个保守的半胱氨酸位点结构模型。氨基酸序列中有5个亲脂性区域,其中第62～75位的氨基酸残基形成明显的亲脂性口袋。预测该蛋白分子量为15.50 kD,等电点为5.24,N—末端包含21个氨基酸组成的信号肽序列。FoccOBP3与横缝茧蜂Diachasma alloeum的DallGOBP（GenBank登录号为XP_015125081.1）、赤拟谷盗Tribolium castaneum 的TcasPBP（GenBank登录号为XP_015835846.1）和TcasOBP07（GenBank登录号为EFA04593.1）的氨基酸序列一致性较高。FoccOBP3与埋葬甲虫Nicrophorus vespilloides的NvesGOBP（GenBank登录号为XP_017781594.1）聚在最小的一个分支,表明与该基因亲缘关系最近。FoccOBP3蛋白含有组成α—螺旋的氨基酸残基127个,形成β—折叠的氨基酸残基58个,形成β—转角的氨基酸残基15个。FoccOBP3蛋白骨架是由 6 个α—螺旋和连接这些螺旋的回折构成,其中5个α—螺旋形成一个结合口袋。FoccOBP3在西花蓟马1龄若虫中高表达,其次是羽化5 d的雌虫,其余发育阶段的表达量均较低;且在雌、雄性成虫中的表达量亦有差异,除了羽化10 d的,羽化1、5、15 d雌虫的表达量均比同发育阶段雄虫的高。该基因在西花蓟马成虫触角中高表达,其次是头部,在腹、足中的表达较低,在胸部微表达。本研究克隆获得西花蓟马气味结合蛋白基因FoccOBP3,明确了其核苷酸、氨基酸序列特征,预测了该蛋白的二级、三维结构,测定了FoccOBP3在西花蓟马中的时空表达,推测该基因可能在西花蓟马气味识别、寄主定位等方面发挥重要作用。     

泡桐丛枝植原体Sec分泌蛋白转运系统3个亚基基因的克隆及蛋白特性分析

采用PCR方法扩增Sec分泌蛋白转运系统3个亚基基因,并进行了生物信息学分析。通过SWISS MODEL同源建模与3D PSSM折叠子识别法构建蛋白质的三维结构,并通过PROCHECK程序验证构建的三维结构的可靠性。首次从泡桐丛枝(PaWB)植原体基因组中分离出Sec分泌蛋白转运系统3个亚基基因,各基因全长依次为2 508、1 242 bp和411 bp,分别编码835、204个及136个氨基酸的蛋白。SecA、SecY和SecE均为脂溶性稳定蛋白,SecA无明显跨膜区,SecY和SecE分别含有10个和3个明显的疏水跨膜区。二级结构主要为螺旋,其次为折叠和无规则卷曲,没有转角。构建的三维结构符合立体化学原则。泡桐丛枝(PaWB)植原体中存在的Sec分泌蛋白转运系统作为最主要的运输途径,可能直接转运菌体蛋白如毒素等直接到寄主细胞质中或介体昆虫细胞中,引起寄主病症。研究植原体的Sec蛋白转运系统对于了解植原体的致病机理及预防这类病害的发生提供了理论依据。     

甜菜夜蛾三个60S核糖体蛋白基因的获得与序列分析

核糖体是生物细胞内的蛋白质合成场所,核糖体蛋白除了参与组装核糖体的大小亚基之外,在生物体内还行使其它功能。本研究以甜菜夜蛾Spodoptera exigua幼虫整体的cDNA为模板,扩增得到了甜菜夜蛾60S核糖体蛋白L6、L7和L10的cDNA序列SeRPL6、SeRPL7和SeRPL10。SeRPL6、SeRPL7和SeRPL10的开放读码框分别为819bp、807bp和660bp,分别编码272、268和219个氨基酸。其中SeRPL7中包含一段由27个氨基酸构成的信号肽序列,SeRPL10中有一个预测的抗生素结合位点。通过NJ进化树构建及与其它昆虫相应的核糖体蛋白比较,发现这三个基因都具有高度的保守性,SeRPL7和SeRPL10氨基酸序列与许多昆虫相应蛋白的同源性都超过了70%。     

云南芝麻丛枝和花变叶植原体16S rRNA和rp基因序列分析

 本研究通过对表现出丛枝和花变叶症状的芝麻感病植株总DNA进行植原体16S rRNA和rp基因的PCR扩增、克隆、测序及序列分析,明确了两种病株的病原均为植原体,并将其命名为云南元谋芝麻丛枝植原体(SEWB-YNym)和云南元谋芝麻花变叶植原体(SEP-YNym)。两个株系的16S rRNA基因片段长度均为1 248 bp,并且碱基序列完全一致。通过与其他地区报道的芝麻植原体株系16S rRNA基因序列比对后发现这两个株系与来自缅甸的株系不存在位点差异,而与泰国、中国台湾、印度的株系分别存在3~6个位点差异。同时,还从两个株系中获得了长度均为1 171 bp并且碱基序列也完全一致的SEWB-YNym和SEP-YNym的rp基因序列。此rp基因序列包括全部rpl22基因(nt90-476)和部分rps3基因(nt550-1170),分别编码128和206个氨基酸。通过对16S rRNA和rp基因的序列进行同源性比对、构建系统进化树等分析,表明两个株系与候选种‘Candidatus Phytoplasma aurantifolia'相关,为16SrII-A亚组成员,并归属于植原体rp-iii亚进化支。     

灭字脊虎天牛CSP基因的鉴定、表达谱及XquaCSP7基因的功能研究

基于已发表的灭字脊虎天牛Xylotrechus quadripes的触角转录组数据,采用BLAST同源搜索的方法从转录组中一共鉴定到14个CSP基因,所有CSP均具有全长序列、信号肽序列和4个保守的半胱氨酸。序列比对结果表明,灭字脊虎天牛CSP间氨基酸一致性差异较大(12%~73%),平均值为34%;具有C1-X6-C2-X18-C3-X2-C4的半胱氨酸保守模式。进化分析表明,除XquaCSP8和XquaCSP12外,其余XquaCSPs聚类到不同分支。表达谱分析表明,XquaCSP7基因在触角特异表达;XquaCSP4、CSP5、CSP12和CSP14基因在触角高表达;XquaCSP13基因在足特异表达;其余XquaCSPs基因在多个组织中有表达。结合测定结果发现,XquaCSP7与测试的21种寄主气味结合能力均较弱,荧光取代率在4.5%~13.5%之间,其中与苯乙酮的结合能力最强,荧光取代率为13.5%。研究结果可为后续灭字脊虎天牛CSP基因的功能研究奠定基础。     

甘蔗花叶病毒福建分离物外壳蛋白基因的克隆及序列分析

 A fujian isolate of Sugarcane mosaic virus named SCMV-FJ was isolated from infected sugarcane. Cloning and sequence analysis of the coat protein gene of this isolate was carried out. A pair of primers was designed and synthesized based on the nucleotide sequences of coat protein genes of sugarcane mosaic viruses reported. The coat protein gene of SCMV-FJ was amplified from the extracted total RNA of the infected sugarcane by using RT-PCR, and cloned into the pMD18-T vector. The sequencing result indicated that the cloned segment included a 1137 bp open reading frame(ORF) and a 228 bp 3' untranslated region, in which the ORF comprised the whole coat protein and part of the nuclear inclusion b. The nucleotide and the deduced amino acid sequences of the coat protein gene were compared with those of the other isolates or strains of SCMV subgroup reported in GenBank. The result showed that it shares 56.8%-97.1% and 55.3%-99.4% homology in nucleotide and the putative amino acid sequences, respectively, with the highest amino acid homology of 99.4% with SCMV-D. Thus it was identified as a SCMV-D. This experiment provided a rapid, sensitive and relatively inexpensive method for RT-PCR detection of SCMV. At the same time, the cloning of SCMV-FJ coat protein gene provided the foundation for plant gene engineering against SCMV.     

玉米弯孢叶斑病菌全基因组分泌蛋白的预测与分析

为深入了解玉米弯孢叶斑病菌致病的分子机制,采用信号肽分析软件Signal P 4.1与PSORTb 3.0.2、跨膜螺旋结构分析软件TMHMM 2.0与THUMBUP、GPI锚定位点分析软件big-PI Predictor和亚细胞器蛋白定位分析软件Target P 1.1这6款软件综合预测该菌全基因组中10 372条蛋白序列,并对筛选出的分泌蛋白信号肽基本特征进行分析。结果表明,在玉米弯孢叶斑病菌全基因组编码蛋白中共发现804个具有典型信号肽的分泌蛋白,占全基因组蛋白总数的7.8%;编码这些蛋白的开放阅读框最小为219 bp,最大为7 113 bp,平均为1 252 bp;引导它们的信号肽长度分布在13~37 aa之间,平均为19 aa。信号肽中出现频率最高的氨基酸依次为丙氨酸、亮氨酸和丝氨酸。信号肽切割位点与根癌土壤杆菌、粗糙脉孢霉和马铃薯晚疫病菌一样,同属于A-X-A型。70个具有功能描述的分泌蛋白主要是和细胞代谢与转运、信号转导有关的酶类;还有一些降解细胞壁组分及与致病相关的酶类,可能与玉米弯孢叶斑病菌的毒性有关。     

太子参蚕豆萎蔫病毒2号CP基因的遗传多样性及分子进化分析

为了解太子参蚕豆萎蔫病毒2(Broad bean wilt virus 2,BBWV2)的遗传多样性及分子进化关系,本研究对5个不同地理来源的6份太子参病叶样品进行了BBWV2外壳蛋白(coat protein,CP)基因的RT-PCR扩增和克隆。序列分析结果表明,所得13条太子参BBWV2 CP基因序列均为1 345 bp,其核苷酸序列同一性在81.0%~99.0%之间,氨基酸序列同一性在93.5%~99.3%之间;核苷酸多样性为0.084 00;存在280个核苷酸多态性位点,其中232个为地域特异性位点;总变异数为278个,其中同义突变29个,异义突变249个。不同地理来源的太子参BBWV2分离物之间遗传分化程度较高,基因交流不频繁,遗传漂变可能导致分离物间明显的遗传分化。在系统进化树中,太子参分离物的聚类呈现出明显的地域特异性,江苏、贵州、湖南、福建分离物均聚类在I-a亚组,而山东分离物聚类在II-c亚组,遗传距离较远。研究表明,太子参BBW V2存在很高的遗传变异,基因突变是其产生遗传多样性的主要驱动力,而地理因素与其具有较高的核苷酸多样性密切相关。     

柑橘溃疡病菌抗铜相关基因copA和 copB的克隆及原核表达

 以柑橘溃疡病菌DNA为模板,对抗铜相关基因copA和copB进行了PCR扩增和克隆,获得了大小分别为1 782 bp 和1 095 bp的目标片段。构建了这2个基因的原核表达载体 (pET-copA和pET-copB),并在大肠杆菌 [Escherichia coli BL21(DE3)] 中成功诱导表达。利用原核表达的融合蛋白免疫大耳白兔,制备了抗copA和copB原核表达蛋白的多克隆抗体。用间接ELISA法测定了所制备的多克隆抗体的效价均为1∶6 400。用所制备的抗体分别对copA和copB的原核表达产物进行Western blot分析的结果显示,在相应位置产生了较强的免疫反应条带,表明所制备抗体能特异性地与相应的抗原发生免疫反应。     

九香虫i型溶菌酶基因的克隆与细菌诱导表达分析

溶菌酶是一组进化上保守的酶,在昆虫中主要分为c型和i型两类.为明确i型溶菌酶在九香虫Coridius chinensis体内的表达模式与功能,我们对九香虫的两个i型溶菌酶基因CcL ys-i1和CcLys-i2进行了克隆,这两个基因的编码区分别为504 bp和432 bp,分别编码167和143个氨基酸.序列分析显示,...