橡胶树白粉菌侵染过程转录组学分析

为明确橡胶树白粉菌Erysiphe quercicola参与致病过程相关基因的表达情况，基于RNA-Seq测序技术对橡胶树白粉菌侵染过程进行转录调控研究，通过对病原菌孢子（0 h）及3个侵染时期（接种1、3和30 d）的转录组进行比较，筛选差异表达基因并对其进行功能注释分析，同时对不同侵染阶段的基因表达趋势进行聚类分析。结果表明，相比于病原菌孢子，3个侵染时期（接种后1、3和30 d）分别有198、458和27个差异表达基因。基因功能富集分析发现氧化还原酶相关基因在侵染1 d阶段显著富集，可能参与病原菌侵染前期对活性氧的防御。基因表达趋势聚类分析显示不同侵染阶段的基因共分为51种表达类型，其中编码候选效应蛋白基因集中分布在侵染1 d后上调表达的6个类型当中。表明橡胶树白粉菌侵染过程相关基因具有明显的功能倾向性和表达趋势特征。     

小麦种质 Edinburgh-b 白粉菌侵染下的基因表达谱分析

 Edinburgh-b是从英国爱丁堡引进的小麦抗白粉病新种质,为了深入了解该种质的抗白粉病分子机制,本研究采用Agilent公司的4 SymboltB@ 44 k小麦表达谱芯片,以Edinburgh-b接种白粉菌0 h为对照,分析其在白粉菌胁迫下的基因表达谱。结果表明,在43 603个探针中筛选出差异表达探针5 835个,其中上调表达2 801个,下调表达3 034个。差异表达基因主要包括与代谢相关的酶类、转录因子、病程相关蛋白、防卫反应基因和信号传导因子等。Pathway分析显示苯丙烷类生物合成、水杨酸信号通路、茉莉酸生物合成、活性氧代谢等被激活,乙烯生物合成和生长素信号通路被抑制,推测水杨酸和茉莉酸信号通路共同参与了Edinburgh-b对白粉菌的防御反应。选取上调和下调表达共17个基因进行实时定量RT-PCR验证,表明基因芯片数据具有良好的重复性。     

小麦蔗糖非发酵相关蛋白激酶SnRK3基因的克隆与分析

为明确小麦蔗糖非发酵-1相关蛋白激酶（sucrose non-ferment-1-related protein kinase,SnRK）在协调植物体内多种信号通路之间的作用,通过普通PCR方法从扬麦20中克隆SnRK基因,利用生物信息学方法对其进行分析,使用实时荧光定量PCR技术分析其在激素、干旱、盐和病菌胁迫下的表达模式,并测定瞬时过表达该基因对烟草叶片抗致病疫霉Phytophthora infestans侵染能力的影响。结果显示,从扬麦20中克隆获得SnRK3基因,命名为TaSnRK3.16-D;该基因编码蛋白可能通过与多种蛋白互作参与多种形式的调控;过表达TaSnRK3.16-D增强了小麦对脱落酸、NaCl、PEG、白粉病菌Blumeria graminis f. sp. tritici和赤霉病菌Fusarium graminearum胁迫的抗性,经亚细胞定位和根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens瞬时表达试验验证表明TaSnRK3.16-D定位于细胞膜上,且其在烟草叶片上过表达部位的致病疫霉侵染病斑颜色较对照病斑颜色浅,一定程度上抑制了致病疫霉的侵染。表...     

一个编码富含丝氨酸蛋白的基因影响大丽轮枝菌的微菌核形成、产孢及致病力

 大丽轮枝菌是一种可在广泛的寄主范围内引发黄萎病的土传植物病原真菌,主要以微菌核的形式在土壤中存活多年,因此鉴定与微菌核形成及致病力相关的基因对防治该病害至关重要。本课题组从前期构建的棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库中筛选到一个微菌核明显减少的突变体,致病力测定结果表明,该突变体致病力明显下降。以棉花黄萎病菌野生型菌株V592的基因组DNA为模板,从棉花黄萎病菌中克隆到被T-DNA插入突变的基因(VdSRP1)编码区全长为415 bp,包含一个外显子,编码一个富含丝氨酸蛋白,与任何已知的注释基因没有显著的序列相似性。为了明确VdSRP1基因在大丽轮枝菌中的功能,利用同源重组的原理及农杆菌介导的遗传转化方法获得了VdSRP1基因的2个敲除体菌株,与棉花黄萎病菌野生型菌株V592相比,VdSRP1基因敲除突变体的微菌核形成明显减少,产孢量及孢子萌发率下降,对棉花的毒力也显著下降。对野生型菌株V592及VdSRP1敲除突变体的转录分析表明,VdSRP1调控一系列与微菌核形成、孢子形成及致病力相关基因的表达。这些结果表明,VdSRP1基因影响大丽轮枝菌的致病力、微菌核形成、产孢及孢子萌发。     

一个编码富含丝氨酸蛋白的基因影响大丽轮枝菌的微菌核形成、产孢及致病力

 大丽轮枝菌是一种可在广泛的寄主范围内引发黄萎病的土传植物病原真菌,主要以微菌核的形式在土壤中存活多年,因此鉴定与微菌核形成及致病力相关的基因对防治该病害至关重要。本课题组从前期构建的棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库中筛选到一个微菌核明显减少的突变体,致病力测定结果表明,该突变体致病力明显下降。以棉花黄萎病菌野生型菌株V592的基因组DNA为模板,从棉花黄萎病菌中克隆到被T-DNA插入突变的基因(VdSRP1)编码区全长为415 bp,包含一个外显子,编码一个富含丝氨酸蛋白,与任何已知的注释基因没有显著的序列相似性。为了明确VdSRP1基因在大丽轮枝菌中的功能,利用同源重组的原理及农杆菌介导的遗传转化方法获得了VdSRP1基因的2个敲除体菌株,与棉花黄萎病菌野生型菌株V592相比,VdSRP1基因敲除突变体的微菌核形成明显减少,产孢量及孢子萌发率下降,对棉花的毒力也显著下降。对野生型菌株V592及VdSRP1敲除突变体的转录分析表明,VdSRP1调控一系列与微菌核形成、孢子形成及致病力相关基因的表达。这些结果表明,VdSRP1基因影响大丽轮枝菌的致病力、微菌核形成、产孢及孢子萌发。     

2013年我国部分麦区小麦白粉菌群体对温度敏感性及其与毒性的关系

 研究小麦白粉病菌群体对温度的敏感性及其与毒性的关系,可为气候变化背景下小麦白粉病的长期发生趋势预测和防治提供依据。本研究对2013年采自云南、四川、河南、北京和陕西五省（市）的小麦白粉菌标样进行分离纯化,获得90个单孢子堆分离物,采用小麦离体叶段法进行温度敏感性测定,并利用32个已知抗病基因品种（系）进行毒性测定,且对两者之间的相关性进行分析。结果表明,供试菌株ET50分布于19.78℃~25.15℃,平均ET50为23.22℃,其中73.34%的供试菌株ET50值介于22℃到24℃之间,小于22℃的菌株占10%,大于24℃的菌株占16.67%。利用Popgen1.32软件对5个省（市）小麦白粉病菌群体的毒性进行多样性分析,结果表明五省市小麦白粉菌群体毒性水平上的多样性指数 H 值为0.237 0,其中四川群体毒性多样性水平最高,Nei’s基因多样性指数 H 值为0.221 2,河南群体最低, H 值为0.197 5。小麦白粉菌群体对温度敏感性与毒性多样性相关性分析结果表明,ET50与毒性多样性（ H 和 I 值）间存在显著的负相关。     

小麦赤霉病菌α-微管蛋白原核表达及纯化研究

 为了制备小麦赤霉病菌的α-微管蛋白,以小麦赤霉病菌cDNA为模板,PCR扩增出α₁-、α₂-微管蛋白基因,将其克隆到pET30a⁺表达载体上,转化到表达宿主菌Rossatta（DE3）pLysS,筛选阳性克隆,进行蛋白诱导表达。SDS PAGE及Wes-tern-b1ot结果表明：融合蛋白主要以包涵体形式存在;融合蛋白分子量约为52.1和55.9 kD;融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应。通过对包涵体洗涤及透析复性后采用HisTrap^TM  HP Columns对融合蛋白进行纯化,可以得到纯度较高的融合蛋白。该研究为体外筛选以微管蛋白为靶标的杀菌剂提供了物质基础。     

白粉菌侵染后的拟南芥酵母双杂交cDNA文库构建及其利用

 拟南芥广谱抗病基因RPW8对拟南芥白粉病菌、霜霉病菌和烟草花叶病毒等均具有抗性。为了深入研究其广谱抗病机制,筛选鉴定与RPW8具有直接相互作用的蛋白,我们以含有RPW8的拟南芥纯合转基因系S5为材料,接种拟南芥白粉菌系UCSC1,36 h后取样,构建了白粉菌侵染初期的拟南芥cDNA文库。为了提高文库对长片段基因5′端的覆盖率,分别使用含有oligo(dT)和oligo(dN)的接头引物反转录cDNA第一链,PCR扩增双链cDNA。将纯化后的双链cDNA与线性化载体pGADT7-Rec混合,利用同源重组技术在酵母菌株Y187中构建cDNA文库。经检测,文库转化效率为5.0×10⁶/3 μg pGADT7-Rec,滴度为2.5×10⁸ CFU·mL^-1,插入片段长度在350～2 000 bp之间,平均插入片段大小为750 bp。用RPW8.1和RPW8.2构建诱饵载体,分别获得11和12个候选互作蛋白。结果表明此cDNA文库质量较好,适用于互作蛋白的筛选。     

不同海拔对天水市小麦条锈菌夏孢子萌发的影响

为明确不同海拔对天水市小麦条锈菌Puccinia striiformis f. sp. tritici夏孢子萌发的影响,于显微镜下观察天水市低、中、高海拔地区小麦条锈菌夏孢子在不同温度下的萌发及融合情况,并对与夏孢子萌发相关的温敏基因的表达水平进行测定。结果显示,低海拔和中海拔地区的小麦条锈菌夏孢子的最适萌发温度为9℃,萌发率分别为64.72%和54.21%,高海拔地区的小麦条锈菌夏孢子的适宜萌发温度在12～16℃之间,平均萌发率为59.09%;高海拔和低海拔地区小麦条锈菌夏孢子都存在芽管融合和孢子融合现象,其中高海拔地区小麦条锈菌夏孢子的异核率为6.13%,超过了其无性阶段变异的阈值1%。与夏孢子萌发相关的10个温敏基因在不同海拔地区小麦条锈菌夏孢子中的表达趋势不同,其中,与能量代谢相关的葡萄糖转运蛋白基因和低亲和力磷酸转运蛋白基因在高海拔地区小麦条锈菌夏孢子中的表达量高于低海拔地区小麦条锈菌夏孢子,与毒性变异相关的易化因子超家族（major facilitator superfamily,MFS）转运蛋白基因在高海拔和低海拔地区小麦条锈菌夏孢子中的表达模式均呈上升趋势。表明由于海拔...     

稻纹枯病菌菌株与水稻品种的致病互作分析

 用离体叶接种方法进行稻纹枯病菌群体致病力和水稻抗病力测定,将结果进行统计学分析及图解分析发现,病菌群体的致病力呈现连续变异的数量性状特征,服从正态分布;菌株与品种的致病互作中,菌株间的差异、品种间的差异、以及菌株-品种互作间的差异均达到极显著水平,但互作效应对致病反应的变异所起的作用很小,致病反应的变异主要由菌株效应的差异或者品种效应的差异造成;大多数菌株在品种“中浙优1号”上的致病力排序与在“特优524”上的排序趋势是一致的;大多数品种对菌株2008-126-2的抗病力排序与对菌株2008-88-1的排序趋势是一致的。依结果认为寄主水稻的抗病力也服从正态分布。基于这些分布特征和致病互作特征,可以认为,一般要体现病害差异的试验,水稻寄主应选用中等抗病力的品种,病菌应选用中等致病力的菌株。抗病育种实践中,进行品种资源抗病性评价时,可采用二步行策略,第一步先用一个中等致病力菌株对所有品种先行鉴定,第二步用一个强致病力（或弱致病力）菌株对高抗病力（或低抗病力）的品种再行鉴定。同理,病菌材料的致病性评价也可采用二步行策略,第一步先用一个中等抗病力品种对所有菌株先行鉴定,第二步用一个高抗病力（或低抗病力）品种对强致病力（或弱致病力）的菌株再行鉴定。品种抗病性（或菌株的致病性）的鉴定结果可以采用正态分布函数计算法进行分组归类。     

禾谷镰刀菌缺氧诱导脱氢酶参与发育和致病性

 缺氧诱导脱氢酶(hypoxia-induced dehydrogenase, HorA)参与辅酶Q(coenzyme Q, CoQ)的生物合成。在禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)基因组中确定了一个缺氧诱导脱氢酶基因,命名为FgHorA。通过同源重组的方法获得FgHorA敲除突变体。研究发现,FgHorA敲除突变体出现生长和产孢的缺陷,并且延迟了分生孢子萌发,FgHorA突变体不能产生子囊壳。FgHorA突变体在小麦胚芽鞘上的致病力和产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)毒素含量明显下降。FgHorA突变体表现出对盐胁迫的抗性提高,而对氧胁迫抗性降低。此外,FgHorA突变体产生的内源性活性氧明显减少。研究结果表明,禾谷镰刀菌FgHorA参与菌丝生长、无性和有性生殖、胁迫反应和致病性。     

香蕉枯萎病菌myosin-1基因的功能分析及外施dsRNA介导的抗性评估

 香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense,Foc)引起的香蕉毁灭性土传病害,其中 4号生理小种(Foc4)能感染几乎所有的香蕉品系,危害最严重。SMART在线软件分析myosin-1基因具有肌球蛋白马达蛋白(myosin motor domain, MMD),肌动蛋白尾结构TH1(myosin tail)和 Src家族同源结构域SH3(src homology domain 3),与禾谷镰刀菌中氰烯菌酯靶标基因myosin-5具高度的蛋白同源性,相似性高达83%。利用Split-marker基因重组技术获得Foc4的myosin-1基因敲除突变体,Δmyosin-1突变株丧失了对氰烯菌酯的敏感性,菌丝生长缓慢,产孢量减少且孢子畸形,对香蕉致病力严重下降,证实myosin-1是氰烯菌酯在Foc4中的作用靶标基因。外施靶向myosin-1体外转录的dsRNA,能抑制菌丝的生长,降低菌丝活性;菌丝膨胀扭曲分枝增多,出现典型的球状结构,与氰烯菌酯处理后的表型一致。在盆栽活体人工接种实验中,体外施用dsRNA可以明显抑制枯萎病外部症状的发展,推迟发病时间,赋予寄主抗性,结果说明体外施用dsRNA可以作为新型杀菌剂防治香蕉枯萎病。综上,myosin-1基因作为氰烯菌酯在Foc4中的靶标基因具有高度的序列保守,在调控菌丝生长发育,产孢以及致病力等方面发挥重要作用,而外施dsRNA具有防治香蕉枯萎菌的巨大潜力。     

苹果树腐烂病菌染色质重塑因子Vmles4的功能研究

染色质重塑因子INO80是一类由多亚基构成的遗传学调控因子，调控多种DNA代谢，在基因的表达中发挥着重要的调控功能。但其在苹果树腐烂病菌（Valsa mali）中是否存在及其生物学功能并不清楚，为此，本研究从病菌基因组中分析鉴定到INO80的一个亚基基因Vmles4，利用qRT-PCR技术分析了Vmles4在病菌侵染过程中的表达模式，利用Double-joint PCR技术和PEG介导的原生质体转化方法进行了基因敲除，然后对3个突变体的营养生长及致病力进行测定和分析，并对病菌的非核糖体肽合成酶基因VmNRPS12及VmNRPS14在突变体中的表达进行定量分析。结果表明：Vmles4在侵染初期的表达显著上调，接种后6 h上调表达6.2倍。敲除突变体的生长速率平均降低28%且菌丝生长稀疏，在富士苹果品种（Malus domestic cv. Fuji）叶片和枝条上的致病力分别降低到22.5%和27.5%，VmNRPS12及VmNRPS14基因在Vmles4突变体侵染苹果枝条24 h后的表达量分别下调86.5%和50%；综上所述，Vmles4正调控腐烂病菌的营养生长、致病力以及次级代谢合成酶基因VmNRPS12和VmNRPS14的表达。     

尖孢镰刀菌番茄专化型中SNARE蛋白FolSso1的功能分析

 SNARE(Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)蛋白保守存在于丝状真菌中,在膜泡转运的过程中起着关键的作用。番茄枯萎病是由尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,Fol)引起的,严重威胁着番茄的生产。我们使用反向遗传学的方法来研究番茄枯萎病菌中SNARE蛋白FolSso1的功能,实验结果发现FolSSO1的基因缺失突变体菌丝生长速率降低,且产孢数量减少。另外,FolSSO1基因的缺失导致突变体相较于野生型菌株对细胞壁压力与细胞膜压力更加敏感。然后,在番茄果实和番茄植株的致病性实验中,我们发现FolSSO1的缺失并没有引起Fol致病性显著的变化。综上所述,本研究发现FolSSO1可以调控Fol营养生长,繁殖和对环境压力的响应过程,然而对Fol的致病过程并没有显著的调控作用。     

尖孢镰刀菌番茄专化型中SNARE蛋白FolSso1的功能分析

 SNARE(Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)蛋白保守存在于丝状真菌中,在膜泡转运的过程中起着关键的作用。番茄枯萎病是由尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,Fol)引起的,严重威胁着番茄的生产。我们使用反向遗传学的方法来研究番茄枯萎病菌中SNARE蛋白FolSso1的功能,实验结果发现FolSSO1的基因缺失突变体菌丝生长速率降低,且产孢数量减少。另外,FolSSO1基因的缺失导致突变体相较于野生型菌株对细胞壁压力与细胞膜压力更加敏感。然后,在番茄果实和番茄植株的致病性实验中,我们发现FolSSO1的缺失并没有引起Fol致病性显著的变化。综上所述,本研究发现FolSSO1可以调控Fol营养生长,繁殖和对环境压力的响应过程,然而对Fol的致病过程并没有显著的调控作用。     

Type-II secretion pathway structural gene xpsE, xylanase- and cellulase secretion and virulence in Xanthomonas oryzae pv. oryzae

Rice bacterial blight caused by Xanthomonas oryzae pv. oryzae is one of the most important diseases in rice-growing areas worldwide. Four virulence-deficient mutants were identified from a transposon mutagenesis library of X. oryzae pv. oryzae . Sequence-analysis revealed that the transposon of the four mutants inserted at different sites in the same ORF, which is homologous to the xpsE gene encoding a component of the type-II secretion system in many bacterial pathogens. Extracellular enzymes, such as xylanase and cellulase, were not secreted to the extracellular space in the mutants. Analysis of the protein profile of the extracellular, periplasmic and intracellular fractions indicated that at least two secreted proteins accumulated in the periplasmic space in the mutants. After genetic complementation of these mutants with a functional xpsE gene, the xpsE gene could express normally and the pathogenicity of the mutants and their secretion of extracellular enzymes were restored. Western blot analysis with an anticellulase antiserum also showed that cellulase was secreted normally in the complemented strains. The results show that the type-II secretion pathway structural gene xpsE is required for xylanase and cellulase secretion and full virulence in X. oryzae pv. oryzae .     

胶孢炭疽菌CgSho1基因的克隆与功能分析

HOG-MAPK(high osmolarity glycerol mitogen-activated protein kinase)信号途径是真菌MAPK途径中参与渗透压响应的一条重要通路,在植物病原菌生长发育及致病过程中发挥着重要的作用。Sho1(synthetic high osmolarity-sensitive protein1)是HOG-M APK信号途径上游的一个重要感受器,在不同真菌中常具有不同的功能。本研究从胶孢炭疽菌中克隆了Sho1的同源基因,命名为Cg Sho1,该基因编码一个291个氨基酸的蛋白,含有4个跨膜结构域和一个SH3功能域。利用同源重组的方法获得了该基因的敲除突变体,与野生型相比,敲除突变体表现为营养生长缓慢,菌丝稀疏且疏水性增强,产孢量下降,对氧化压力和渗透压更加敏感,致病力明显减弱。上述结果表明,Cg Sho1参与调控胶胞炭疽菌的营养生长、分生孢子产量、氧化应激反应、渗透压响应及致病性。     

抗苯醚菌酯(ZJ0712)小麦白粉病菌突变体的诱导及其生物学特性

经过药剂驯化10代后,从对苯醚菌酯(ZJ0712)敏感的小麦白粉病菌Blumeria graminis f.sp.tritici 3个菌株中获得3个抗药突变体,突变体的抗性指数均大于80,且其抗性能够通过无性繁殖稳定遗传。室内接种试验发现,突变体的致病力与亲本菌株无明显差异。细胞色素b (cyt b)基因片段序列分析发现,突变体cyt b基因的第143位密码子均由敏感菌株的GGT(丙氨酸)突变成了GCT(甘氨酸)。研究结果表明,小麦白粉病菌对苯醚菌酯存在较高的抗性风险,该药剂在使用过程中需注意采取相应的抗性治理措施,以延缓抗性发生。     

小麦白粉病菌对喹氧灵和苯菌酮的敏感基线及药剂的生物活性

采用离体叶段法,分别测定了从河北、河南、湖北、陕西和四川5省分离的53个小麦白粉病菌单孢菌株对苯菌酮和喹氧灵的敏感性,并分析了白粉病菌对三唑酮和苯菌酮以及喹氧灵之间的 交互抗性。结果表明:小麦白粉病菌群体对苯菌酮和喹氧灵的平均EC50值分别为(0.001 9±0.000 6) 和(0.013 1±0.002 0) mg/L,苯菌酮比喹氧灵具有更高的抑菌活性;小麦白粉病菌对三唑酮和苯菌酮与喹氧灵之间均不存在交互抗性(R2值分别为0.102 6和0.491 9);室内盆栽试验结果显示:接种前1 d和接种后1d施药,苯菌酮和喹氧灵对小麦白粉病的保护与治疗作用防效分别为92.21%、84.25%和82.43%、70.25%,表明这2种药剂不仅具有优异的保护作用,同时还具有较好的治疗作用。