拮抗链霉菌R15β-葡萄糖苷酶的纯化及特性研究

 从山东泰安郊区大白菜植株根际土壤中分离筛选获得一株拮抗链霉菌(Streptomyces spp. )R₁₅菌株。采用固体发酵、粗酶液 (NH₄)₂SO₄分级沉淀、DEAE-52阴离子交换柱层析和Sephadex G75凝胶柱层析等步骤从链霉菌(Streptomyce spp.)R₁₅中分离纯化获得β-葡萄糖苷酶。结果表明, 纯化倍数16.28, 回收率为14.59％, SDS-PAGE电泳测得相对分子量为63.89 kDa。经TLC分析酶解产物, β-葡萄糖苷酶与水杨苷反应生成D-葡萄糖和水杨醇。以水杨苷为底物时, 该酶的Km值为10.644 mmol/L, Vmax为0.525 μmol·L^-1·min^-1。该酶的最适温度为65℃, 70℃以下相对稳定;最适pH为5, pH 3~7之间相对酶活在75％以上。Cu²⁺、Hg²⁺和Fe²⁺对酶有抑制作用, 其中Hg²⁺和Cu²⁺的抑制作用最强, 酶活力完全丧失;而Ca²⁺, Mn²⁺对酶均有激活作用, 相对酶活分别高达137.18%和119.52%。     

抗真菌物质HSAF发酵全合成培养基的筛选

热稳定抗真菌因子是产酶溶杆菌OH11产生的一种抗真菌活性物质,可开发成环境友好型生物杀菌剂。为了进一步提高HSAF发酵产量,本研究通过单因素试验筛选出最佳碳源、氮源、金属离子及磷酸缓冲盐并进行正交试验优化,确定了最适的合成培养基配方为葡萄糖8 g/L、（NH₄）₂SO₄ 1 g/L、FeCl₃ 8 mg/L、K₂HPO₄1 g/L、KH₂PO₄0.5 g/L。在此培养基下,HSAF产量达到（215.46±6.85）mg/L,比优化前提高了92.24%。该培养基优势在于成分已知、含量稳定,不仅能避免培养基中复杂成分造成发酵产量的波动,而且有利于对胞内代谢特征和HSAF合成关键因素进行深入研究,进而提高产量并降低生产成本。     

嘧霉胺对采后柑橘绿霉病的防治效果

在实验室和贮藏库条件下,对嘧霉胺单剂、嘧霉胺与抑霉唑或嘧霉胺和咪鲜胺混剂防治柑橘绿霉病的效果进行了评价。室内实验结果表明:采用500或1 000 mg/L嘧霉胺单剂、500 mg/L嘧霉胺+500 mg/L抑霉唑或500 mg/L嘧霉胺+500 mg/L咪鲜胺混剂在接种后12~18 h进行浸果处理,对由抑霉唑抗性或敏感菌株引起的绿霉病均有显著的防治效果,防效超过94%;500或1 000 mg/L 的抑霉唑对敏感菌株的防效在93%以上,但对抗性菌株的防效低于70%。贮藏库防效试验结果表明:在具抑霉唑抗性菌系的贮藏库中,上述质量浓度的嘧霉胺单剂、嘧霉胺与抑霉唑、或嘧霉胺与咪鲜胺混剂对绿霉病的防治效果明显优于抑霉唑单剂;而在不具抗抑霉唑菌系贮藏库中的防效则与抑霉唑相当。由此认为:嘧霉胺可作为抑霉唑的替代药剂应用于柑橘的采后处理,其推荐使用质量浓度为500~1 000 mg/L,可单独使用,也可与抑霉唑或咪鲜胺混合使用。     

腐霉利的光解及水解特性研究

为研究腐霉利的消解特性,采用乙腈提取,弗罗里硅土柱净化,建立了油菜叶片中腐霉利残留的气相色谱-电子捕获检测器 (GC-ECD) 分析方法;并在室内模拟条件下,研究了腐霉利在油菜叶片表面的光解行为,以及不同初始浓度、不同pH值缓冲液、不同浓度Fe2+、Fe3+ 和NO₃–、NO₂– 对水溶液中腐霉利光解的影响;通过气相色谱-电子轰击电离源质谱仪 (GC-EIMS) 鉴定了其在甲醇、丙酮和乙腈溶液中的光解产物;同时研究了不同pH值缓冲液和阴、阳离子表面活性剂对腐霉利水解特性的影响。结果表明:腐霉利添加水平为0.05、0.2、2及12 mg/kg时,其在油菜叶片中的平均回收率为80%~100%,相对标准偏差为2.3%~7.8%。腐霉利在油菜叶片表面的消解动态符合一级动力学方程,紫外灯下的消解半衰期为1.03 h。腐霉利在水溶液中的光解速率随其初始浓度的升高而减慢;其在酸性条件下稳定,碱性条件下易光解;NO₃–、NO₂–、Fe2+ 及Fe3+均可抑制腐霉利在水溶液中的光解,因此可用作为其光猝灭剂。共鉴定出两种腐霉利在甲醇、丙酮和乙腈溶液中的光解产物,分别为其单脱氯化产物C₁₃H₁₂ClNO₂和其脱甲基化产物C₁₂H₉Cl₂NO₂。腐霉利在碱性条件下易水解,酸性条件下水解较慢;阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠 (SDS) 对其水解无影响,而阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 则可促进其水解。研究结果可为腐霉利的合理使用及其环境安全性评价提供参考。     

掘氏疫霉卵孢子萌发研究

 掘氏疫霉(Phytophthora drechsleri)种内菌株直接交配产生的卵孢子分别用0.1% KMnO₄处理20分钟和0.3% H₂O₂处理2分钟在S+L培养基上(26℃)培养7天萌发率>70%。H₂O₂是本研究首次报道的一种刺激掘氏疫霉卵孢子萌发的处理剂,其效果略优于KMnO₄。用KMnO₄和H₂O₂处理均可有效地抑制卵孢子悬浮液中菌丝片段及菌丝膨大体的萌发生长。在一定时期内卵孢子萌发率随卵孢子保存时间的增加而增加,保存30天和45天的卵孢子分别用KMnO₄和H₂O₂处理萌发率最高。卵孢子保存期间有无光照对萌发率无显著影响,但卵孢子荫发时给予光照对萌发有明显的促进作用,保存30天的卵孢子在光照下萌发率为60-70%,在黑暗中仅0-16%。卵孢子萌发过程中的光照条件以黑光灯8小时,日光灯16小时交替连续照射7天效果最好,其次为黑光灯单独连续光照,以日光灯单独照射效果较差。所测定的6种培养基中以S+L培养基对卵孢子萌发的效果最好,其次为V₈+L和WA+L。蜗牛酶、纤维素酶、土壤浸出液和黄瓜果提取液对掘氏疫霉卵孢子萌发无明显刺激作用。     

重寄生真菌盾壳霉胞外蛋白酶产生条件及酶活影响因子

重寄生真菌盾壳霉Coniothyrium minitans是核盘菌Sclerotinia sclerotiorum的重要生防菌。为了探讨盾壳霉胞外蛋白酶在寄生核盘菌过程中的作用,采用明胶平板法对盾壳霉寄生核盘菌菌核产生的蛋白酶活性进行了检测,并进一步采用福林酚法定量测定蛋白酶活性,研究盾壳霉产生胞外蛋白酶的培养条件及影响蛋白酶活性的因子。试验结果表明,在被盾壳霉寄生的核盘菌菌核中检测到蛋白酶活性,表明蛋白酶可能参与盾壳霉重寄生作用。发现核盘菌菌核浸出液培养基适合盾壳霉产生胞外蛋白酶,摇培(20℃、200r/min)5d时蛋白酶活性最高,达到0.22U/mL。盾壳霉胞外蛋白酶酶促反应的最适温度为60℃,最适pH7.0。当温度不高于40℃时,蛋白酶酶活较稳定。5mmol/L的金属离子Mg²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Li⁺和K⁺等对蛋白酶酶活没有显著影响(P>0.05),而Fe²⁺(5mmol/L)显著(P<0.05)提高了蛋白酶活性。盾壳霉蛋白酶对苯甲基磺酰氟(PMSF)敏感,说明盾壳霉产生的胞外蛋白酶可能主要是丝氨酸蛋白酶。这些结果为盾壳霉胞外蛋白酶的分离纯化和功能研究奠定了基础。     

气相色谱-三重四极杆串联质谱法测定4种果品中99种农药残留

建立了红枣 (干)、杏、葡萄和香梨4种果品中99种农药残留量的气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)分析方法。样品用乙腈提取，氯化钠盐析并离心，上清液经分散固相萃取净化，丙酮溶解定容后，GC-MS/MS测定。对比了Carb/NH₂固相萃取柱和NH₂ + C₁₈ + GCB、N-丙基乙二胺 (PSA) + C₁₈ + GCB 3种净化方法的净化效果。结果表明:应用优化的前处理方法，采用基质匹配校准曲线，在0.005~0.5 mg/L范围内，4种基质线性关系良好 (R2 ≥ 0.9915)，定量限(LOQ)范围为0.01~0.025 mg/kg；在0.01、0.025、0.05和0.1 mg/kg 4个添加水平下，95种农药 (占总数96%)的平均回收率在70%~120% 之间，相对标准偏差在0.3%~20% 之间。该方法简便快捷，灵敏度、正确度、精密度均满足日常检测需求，可用于上述4种果品中农药多残留的快速测定。     

芽胞杆菌工程菌株B9BD产表面活性素发酵培养基优化

生物农药“纹曲宁”的主要活性成分—枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis Bs916可产生多种脂肽类抗生素。前期研究发现,degU和bmyA基因的突变株B9∆degU∆bmyA（B9BD）可以高效合成表面活性素（Surfactin）。本研究通过对培养基主要成分的单因素筛选并利用Design expert软件优化了工程菌株B9BD高效发酵产生Surfactin的培养基组分。通过Plackett-Burman试验、中心组合试验（CCD）和响应曲面法（RSM）优化了发酵Surfactin的最优培养基配方：葡萄糖24.27 g/L,黄豆粉29.05 g/L,牛肉浸膏3 g/L,NH₄NO₃ 4 g/L,L-亮氨酸2.36 g/L,KH₂PO₄3 g/L,NaCl 3 g/L,FeSO₄0.02 g/L。在优化培养基中,B9BD产生Surfactin的量高达到（934.25±32.67）mg/L,是其在LB培养基产量的5.6倍。以上研究结果将为Surfactin的高效发酵和应用提供理论基础和技术支撑。     

KMnO4和H2O2刺激掘氏疫霉卵孢子萌发对单卵孢株生物学性状的影响

 本文对经KMnO₄、H₂O₂刺激掘氏疫霉(Phytophthora drechsleri)卵孢子萌发建立的单卵孢株群体应用于掘氏疫霉遗传研究的可行性做了研究。2个掘氏疫霉菌株(A₁、A₂交配型各1株)经聚碳膜间隔配对产生的卵孢子用KMnO₄、H₂O₂以及不用上述氧化剂处理分别建立K、H、C 3个单卵孢株群体(卵孢子萌发率8-16%)。在群体水平上对来自同一亲本的上述3个群体生物学性状比较结果表明,H₂O₂处理刺激卵孢子萌发不影响生长速度、菌落形态、耐35℃高温生长、致病力及交配型的遗传稳定性,所建立的单卵孢株群体可用于上述性状的遗传研究;KMnO₄处理导致掘氏疫霉A₁和A₂交配型在自交后代各自分离为A₁、A₂、A₁A₂和A₂、A₁A₂,但不影响其他生物学性状的遗传稳定性,所建立的单卵孢株群体可用于除交配型性状以外的其他生物学性状的遗传研究,不宜用于交配型正常遗传规律的研究。用KMnO₄处理掘氏疫霉A₁或A₂交配型菌株单株自交产生的卵孢子,从A₁菌株自交后代获得A₂和A₁A₂以及从A₂菌株自交后代获得A₁A₂交配型单卵孢株的结果说明,掘氏疫霉异宗配合菌株体内可能同时包含控制A₁和A₂交配型的遗传因子,在正常条件下有1种交配型遗传因子不表达。KMnO₄处理可望作为揭示交配型遗传本质的有用试验手段。     

荧光猝灭法测定梨小食心虫性诱剂含量以及田间应用

β-环糊精（β-CD）与中性红（NR）在碱性缓冲溶液中形成包合物（β-CD-NR）,使中性红的荧光强度F增大,而加入梨小食心虫性诱剂主要成分顺-8-十二碳烯醇乙酸酯（Z8-12：Ac）后,β-CD-NR的荧光发生猝灭,以此建立了测定Z8-12：Ac含量的新方法：在含有1.0 mL 1.0×10^-3 mol/L中性红、5.0 mL 1.0×10^-2 mol/L的β-CD、7.0 mL 0.2 mol/L的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲溶液（pH 7.4）的荧光体系中,加入Z8-12：Ac,以双蒸水定容至25.0 mL,超声反应20 min后,将其放置在4℃的环境下冷却,得待测液。在激发波长为460 nm、发射波长为580 nm的条件下测定待测液的荧光强度F和β-CD-NR体系的荧光强度F₀,计算荧光猝灭值ΔF（ΔF＝F₀—F）。比较分析不同浓度的Z8-12：Ac标准溶液与相应的荧光猝灭值ΔF的关系,结果表明：在Z8-12：Ac浓度为1.0×10^-4～4.0×10^-4 mol/L范围内,荧光猝灭值ΔF与Z8-12：Ac的浓度c呈现良好的线性关系,线性方程为：ΔF＝28.3 c—16.8,R²＝0.9978。对2.0×10^-4 mol/L的Z8-12：Ac溶液进行11次平行测定,得出方法检出限为1.25×10^-5 mol/L（S/N＝3）,RSD为±1.5%,方法灵敏度和精密度良好。加标回收率在98.0%～103.0%,说明方法准确度良好。利用新方法测定了田间梨小诱芯中Z8-12：Ac随时间的残留量,统计了不同残留量对应的诱虫量。结果表明,本方法可以成功测定不同天数下诱芯中Z8-12：Ac的残留量,掌握了诱芯中Z8-12：Ac的衰减趋势,而且与实际诱虫量变化趋势基本吻合。本方法可为确保田间虫情监测预报的精确性以及保持性诱芯的诱杀效果提供技术支撑。     

葡萄糖对水稻白叶枯病细菌(Xanthomonas oryzae)生长的抑制作用

 分离水稻白叶枯病細菌(Xanthomonas oryzae(Ishiyama and Uyeda) Dowson)比分离同屬的其他細菌較为困难。即使从新鮮的病叶进行分离,也并不是每次都能成功。从病株殘余和土壤分离,困难更多。白叶枯病細菌的生理和同厲的其他細菌有显著的差别,分离失败原因之一,可能是由于未能掌握适当的培养条件。     

Atmospheric deposition of inorganic nitrogen in a semi-arid grassland of Inner Mongolia,China

Due to increasing global demand for crop production and energy use, more and more reactive nitrogen(Nr) has been generated and emitted to the environment. As a result, global atmospheric nitrogen(N) deposition has tripled since the industrial revolution and the ecological environment and human health have been harmed. In this study, we measured dry and wet/bulk N deposition from July 2013 to December 2015 in a semi-arid grassland of Duolun County, Inner Mongolia, China. The samples of dry and wet/bulk N deposition were collected monthly with a DELTA(DEnuder for Long Term Atmospheric sampling) system and with Gradko passive samplers and a precipitation gauge. The measured results show that the annual mean concentrations of NH_3, NO_2, HNO_3, particulate NH_4~+(pNH_4~+) and particulate NO_3~-(pNO_3~-) in atmosphere were 2.33, 1.90, 0.18, 1.42 and 0.42 μg N/m3, respectively, and that the annual mean volume-weighted concentrations of NH_4~+-N and NO_3~--N in precipitation were 2.71 and 1.99 mg N/L, respectively. The concentrations of Nr components(including NH_3, NO_2, HNO_3, p NH_4~+, pNO_3~-, NH_4~+-N and NO_3~--N) exhibited different seasonal variations. Specifically, NO_2 and HNO_3 exhibited higher concentrations in autumn than in summer, while the other Nr components(NH_3, pNH_4~+, pNO_3~-, NH_4~+-N and NO_3~--N) showed the highest values in summer. Based on measured concentrations of Nr components and their deposition velocities estimated using the GEOS-Chem global atmospheric chemical transport model, the calculated annual mean dry deposition fluxes were 3.17, 1.13, 0.63, 0.91 and 0.36 kg N/(hm~2·a) for NH_3, NO_2, HNO_3, p NH_4~+ and pNO_3~-, respectively, and the calculated annual mean wet/bulk deposition fluxes were 5.37 and 3.15 kg N/(hm~2·a) for NH_4~+-N and NO_3~--N, respectively. The estimated annual N deposition(including dry N deposition and wet/bulk N deposition) reached 14.7 kg N/(hm~2·a) in grassland of Duolun County, approaching to the upper limit of the N critical load(10–15 kg N/(hm~2·a)). Dry and wet/bulk deposition fluxes of all Nr components(with an exception of HNO_3) showed similar seasonal variations with the maximum deposition flux in summer and the minimum in winter. Reduced Nr components(e.g., gaseous NH_3 and p NH_4~+ in atmosphere and NH_4~+-N in precipitation) dominated the total N deposition at the sampling site(accounted for 64% of the total N deposition), suggesting that the deposited atmospheric Nr mainly originated from agricultural activities. Considering the projected future increases in crop and livestock production in Inner Mongolia, the ecological and human risks to the negative effects of increased N deposition could be increased if no mitigation measures are taken.     

淀粉利用能力作为疫霉种的鉴别性状

 在适宜的合成培养液中,所试验的各个疫霉种对于淀粉作为碳源的利用能力有极显著的差异。在分类工作中可以根据这一性状来鉴别疑难的种,特别是Phytophthora parasitica和P.palmivora。     

解淀粉芽胞杆菌ZF57微粉剂的研制及对黄瓜棒孢叶斑病的防治效果

 采用单因素试验和响应面分析等方法优化解淀粉芽胞杆菌ZF57的发酵工艺。得到解淀粉芽胞杆菌ZF57发酵的最优条件为山梨醇10 g·L^-1、棉籽饼粉17 g·L^-1、NaH₂PO₄ 0.5 g·L^-1、Na₂HPO₄ 0.4 g·L^-1,初始pH 7.0、装液量80 mL/250mL三角瓶、接种量2.1%、培养温度30℃、转速180 r·min^-1、发酵时间32 h,此时含菌量达到3.8×10⁸ CFU·mL^-1,较优化前提高了80%。明确了解淀粉芽胞杆菌微粉剂的最佳配方为解淀粉芽胞杆菌母粉50%,白炭黑10%,分散剂木质素磺酸钠1%,表面活性剂十二烷基硫酸钠4%,保护剂羧甲基纤维素钠1%,硅藻土补足至100%。该制剂含菌量为3.26×10⁹ CFU·mL^-1,平均粒径8.31 μm,分散指数98.16%,浮游性指数85.37,含水率1.42%,坡度角68°,各项检测结果均符合标准。解淀粉芽胞杆菌ZF57微粉剂对黄瓜棒孢叶斑病的田间防治效果高达97.12%。     

流动相添加剂法与手性固定相法对己唑醇光学异构体的拆分

分别采用β-环糊精作为手性流动相添加剂的反相高效液相色谱法和涂敷型纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)正相高效液相色谱手性固定相法拆分了农药己唑醇。结果表明,己唑醇对映异构体在以上两种方法下都完全达到基线分离。考察了影响容量因子、选择性系数和分离度的各种因素。     

乙基伊维菌素高产菌株选育及其发酵工艺优化

基因工程菌Streptomyces avermitilis AVE-H39产生的甲基和乙基伊维菌素 (methyl and ethyl ivermectins),为新型高效低毒的阿维菌素 (avermectin) 衍生物,具有很好的开发应用前景。活性测试结果显示,乙基伊维菌素对朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus和松材线虫Bursaphelenchus xylophilus等农林作物害虫的活性优于甲基伊维菌素。鉴于菌株S. avermitilis AVE-H39的乙基伊维菌素产量低,制约了产业化开发,本研究经过多轮诱变选育,筛选获得了一株乙基伊维菌素发酵单位高的突变菌株,并通过Plackett-Burman 试验设计及Box-Behnken 设计-响应面法 (response surface methodology, RSM)对该突变菌株的发酵培养基进行改良。经优化后的发酵条件为:玉米淀粉149.8 g/L,黄豆粉38.1 g/L,(NH₄)₂SO₄ 3.04 g/L,甘露醇30.0 g/L,酵母抽提物20.0 g/L,CaCO₃ 3.0 g/L,CoCl₂ 0.01 mg/L,FeSO₄ 0.002 mg/L,转速220 r/min,pH 7.2,装液量30 mL/250 mL,接种量5%,发酵温度28 ℃。在此条件下,乙基伊维菌素的发酵效价达到最大值,为4 965 mg/L。研究结果将为开发以乙基伊维菌素为主成分的新型十六元大环内酯农药奠定基础。     

2-(溴代吡咯腈-1-基)乙酸衍生物的设计、合成及生物活性

为了发现具有生物活性的新化合物,以溴代吡咯腈为先导化合物,通过亲核取代等反应合成了一系列新型2-(溴代吡咯腈-1-基)乙酸衍生物(5a～5m, 6a～6o),其结构均经核磁共振氢谱(¹H NMR)、碳谱(¹³C NMR)和高分辨质谱(HRMS)确证。杀菌活性测定结果显示：化合物2、3和5m对水稻稻瘟病菌Magnaporthe oryzae均表现出良好的杀菌活性,其EC₅₀值分别为0.0532、0.0470和0.0174 mmol/L,优于对照药剂咯菌腈(0.0914 mmol/L),但不及对照药剂嘧菌酯(0.0001 mmol/L);化合物5m表现出一定的杀菌广谱性,其对水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani和小麦根腐病菌Bipolaris sorokiniana的EC₅₀值分别为0.0218和0.0420 mmol/L,但均不及对照药剂咯菌腈(EC₅₀值分别为0.0002和0.0010 mmol/L)。杀虫、杀螨活性测定结果显示,在0.2 mmol/L浓度下,目标化...