泰安市“香野”草莓采后主要病原菌的分离鉴定及精油抑菌效果评价

为明确山东省泰安市草莓采后主要致腐病原菌的种类及不同植物精油的抑菌效果,从腐败的"香野"草莓果实上分离、纯化优势菌株,进行形态学和分子生物学鉴定,并通过室内熏蒸毒力试验评价7种植物精油对上述病原菌的抑制效果。结果表明,泰安地区草莓分离得到3种病原菌,分别为灰葡萄孢菌Botrytis cinerea、链格孢菌Alternaria alternata和枝孢菌Cladosporium tenuissimum。7种植物精油对3种病原菌均表现出不同程度的抑制作用,百里香精油对灰葡萄菌和链格孢菌的室内毒力均最高,EC₅₀值分别为39.998和18.456 μL/L;柠檬草精油对枝孢菌的活性最高,EC₅₀值为30.523 μL/L。活体抑菌试验结果表明,百里香精油对草莓果实灰葡萄孢菌和链格孢菌的活体抑菌效果最高,防效分别为86.21%和89.29%;柠檬草精油对枝孢菌的防效最高,为75.86%。综合比较可以发现,百里香精油、玫瑰草精油、柠檬草精油及肉桂精油对草莓采后3种病原菌均具有较好的抑制效果。     

浙麦冬黑斑病病原菌的分离鉴定及淀粉酶产色链霉菌对其生物防治效果

黑斑病是浙江省慈溪市浙麦冬种植基地常发病害,传染速度快且严重影响麦冬的产量与品质。为了明确引起黑斑病的病原菌以便后续有效防治该病害,本文通过对染病组织培养、病原菌分离纯化和柯赫法则验证、形态学观察与基因序列分析比对（ITS、EF-1α、RPB2、Alt a 1、His 3、ATP）,最终鉴定出引起浙麦冬黑斑病的病原菌是链格孢菌Alternaria alternata。研究淀粉酶产色链霉菌Streptomycesdiastatochromogenes 1628代谢产物对黑斑病的防效结果表明,1628代谢产物对链格孢菌菌丝生长具有较强的抑制作用,其EC₅₀=0.764%（体积浓度）。田间防效结果表明7和14 d校正防效分别可达74.08%和65.28%,均高于阳性对照多菌灵。本研究明确了浙麦冬黑斑病病原菌的分类地位,并筛选到能有效抑制该病原菌的生防菌株淀粉酶产色链霉菌,为后续浙麦冬黑斑病的防治提供依据。     

拟康宁木霉Tk1的分离鉴定、拮抗作用及其生物学特性

为了分离利用高效植物病害生物防治菌株，从广东药用植物金丝皇菊根部分离获得一株木霉菌株Tk1。经过形态观察、rDNA-ITS和EF-1α序列分析明确其为拟康宁木霉Trichoderma koningiopsis。用平板对峙培养法测定，该菌株对金丝皇菊枯萎病菌（尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum）和柑橘炭疽病菌（胶胞炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides）的抑制率分别为68.5%和77.1%，且在后期能完全覆盖或部分覆盖病原真菌。其无菌发酵液对金丝皇菊枯萎病菌的抑制率为45.55%。该菌株营养生长和产孢的最适碳源分别为乳糖和葡萄糖，最适氮源是酵母膏；在pH 4~11的培养基上均可生长、产孢，最适pH为7；12 h交替光照条件下菌丝的生长速度最快，全光照条件下产孢数量最大；该菌株的致死温度为73℃处理10 min。     

灰葡萄孢菌nit突变体的诱导及其在营养体亲和性测定中的应用初探

 从山西运城、临汾、长治、晋中、大同等地保护地黄瓜灰霉病病株上采集、分离的分属于3个不同菌丝融合群的8个灰葡萄孢菌单孢菌株,经氯酸盐诱导处理,共获得了抗氯酸盐的硝酸盐利用缺陷突变体(nit突变体)59株,其中nit1型38株,nit3型10株,nitM型11株。所有nit突变株分别在PDA斜面转管培养3次(21 d)后,除6株恢复成野生菌株外,其余多数nit突变菌株表现稳定。来源于同一野生菌株的不同类型nit突变体间或同一菌丝融合群不同野生菌株的nit突变体间可产生互补反应而形成异核体,其中以nitM型突变株互补性最好,在利用nit突变体测定灰葡萄孢菌营养体亲和性时应作为标准菌株。来源于不同菌丝融合群的nit突变体间不能产生互补反应。     

挥发性化合物2-甲基苯并噻唑对核盘菌和灰葡萄孢的抑制效应

为明确挥发性化合物2-甲基苯并噻唑（2-methylbenzothiazole,2-MBTH）对向日葵菌核病病原菌核盘菌Sclerotinia sclerotiorum和番茄灰霉病病原菌灰葡萄孢Botrytis cinerea的防治潜力,采用密封盘菌丝生长速率法测定其对2种病原菌的抑制作用,利用离体叶片接种试验分析其对2种病原菌致病力的影响。结果显示,2-MBTH对核盘菌和灰葡萄孢具有明显的抑制作用,2-MBTH对核盘菌菌丝的EC₅₀为0.87 μL/L,对灰葡萄孢菌丝的EC₅₀为4.49 μL/L。2-MBTH能够显著降低灰葡萄孢的致病力,受抑制程度与2-MBTH浓度呈正相关;扫描电镜观察发现,2-MBTH能够使灰葡萄孢菌丝形态异常,菌丝干瘪,分枝增多,表面塌陷;使核盘菌菌丝破损,表面塌陷。另外,随着2-MBTH熏蒸浓度的增大,核盘菌的菌核数量和质量都有所减少,且健康菌核在2-MBTH的熏蒸作用下失去了萌发能力。表明2-MBTH对核盘菌和灰葡萄孢均有较高的抑制作用,表现为菌丝生长、菌核萌发受到抑制,利用其熏蒸作用可以为向日葵菌核病和番茄灰霉病的有效防控提供新思路。     

淡紫紫孢菌防治采后番茄果实灰霉病

本文通过孢子萌发检测、平板生长抑制法和果实病害防治试验,测定了淡紫紫孢菌Purpureocillium lilacinus PL36-1防治储藏期番茄果实灰霉病的效果。结果表明,菌株PL36-1发酵滤液不仅能够抑制灰葡萄孢分生孢子萌发和芽管伸长,而且可以抑制灰葡萄孢菌丝生长。对峙培养的菌株PL36-1显著抑制灰葡萄孢的菌丝生长,菌丝生长抑制率可达到74.45%,菌株PL36-1产生的挥发性物质也对灰葡萄孢菌丝生长有一定的抑制作用。菌株PL36-1发酵液处理樱桃番茄果实后,能有效控制番茄果实灰霉病的发生,含有2×10~8孢子/m L的发酵液10 d的防治效果达70.64%。     

枯草芽胞杆菌NCD-2菌株抑菌蛋白的分离及鉴定

枯草芽胞杆菌NCD-2菌株对灰葡萄孢菌具有较强的抑菌活性,抑菌蛋白是其产生的抑菌物质之一。本研究为明确NCD-2菌株所产抑菌蛋白的作用方式和特性,采用牛津杯法测定抑菌蛋白的抑菌活性及其对病原菌菌丝生长的影响,采用混合培养法测定其对病原菌分生孢子萌发的影响,同时采用阴离子交换层析和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对其进行分离纯化,并利用MALDI-TOF-MS进行鉴定。结果表明,NCD-2菌株产生的粗蛋白能够显著抑制灰葡萄孢菌分生孢子的萌发和菌丝生长,并导致病原菌菌丝分枝增多、局部膨大肿胀。通过分离纯化获得具抑菌活性的蛋白组分D1-3,经鉴定该蛋白的肽指纹图谱与leucyl aminopeptidase[Bacillus subtilis](WP_041057629.1)的氨基酸序列匹配率最高,达到65%,相对分子质量为53.936 k Da,功能分析表明组分D1-3可能是一种新的抑菌蛋白。     

灰葡萄孢BcPDR1基因与PKA编码基因的关系研究

 为明确灰葡萄孢BcPDR1基因与病菌cAMP信号途径中PKA编码基因BcPKA1、BcPKA2、BcPKAR之间的关系,利用Real-time PCR技术分析了BcPDR1基因突变对PKA编码基因BcPKA1、BcPKA2、BcPKAR表达的影响,以及PKA编码基因突变对BcPDR1基因表达的影响。结果发现,BcPDR1基因突变体中BcPKA1、BcPKA2、BcPKAR的表达水平均显著高于野生型和回复菌株,BcPKA1、BcPKA2、BcPKAR基因的RNAi突变体中BcPDR1基因表达水平显著低于野生型。我们分别构建了PKA编码基因BcPKA1、BcPKA2、BcPKAR在敲除突变体ΔBcpdr1中过表达的菌株ΔBcpdr1/BcPKA1-OE、ΔBcpdr1/BcPKA2-OE、ΔBcpdr1/BcPKAR-OE;对过表达菌株的表型和致病力进行分析发现,过表达菌株的菌落形态、菌核形成、菌丝形态、生长速率、产孢量和致病力均与突变体ΔBcpdr1表现显著的差异,而更接近野生型BC22的表型和致病力。结果表明,灰葡萄孢BcPDR1基因与PKA亚基基因BcPKA1、BcPKA2和BcPKAR的表达水平密切相关,BcPDR1基因负调控这3个基因的表达,而这3个基因对BcPDR1基因表达有正调控作用。本研究为进一步阐明灰葡萄孢BcPDR1基因调控病菌生长发育和致病力的分子机制奠定了基础。     

产香真菌GS-1菌株鉴定及其挥发性物质对番茄灰霉病的生防效果

为鉴定产香真菌GS-1菌株物种分类和评价其挥发性物质对番茄灰霉病的生防效果,通过形态学和ITS(internal transcribed spacer)序列分析对菌株GS-1进行物种鉴定,以对扣法测定其挥发物对番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、水稻胡麻斑病菌Bipolaris oryzae、小麦赤霉病菌Fusarium graminearum、白菜黑斑病菌Alternaria brassicae和莴苣菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum共5种植物病原真菌的熏蒸抑制活性,以果实针刺法测定挥发物对番茄灰霉病的抑制作用,并观察对其菌丝生长的影响。结果显示,菌株GS-1为普通瘤座孢Tubercularia vulgaris;其挥发物对5种植物病原真菌均有明显的熏蒸抑制作用,72 h的抑制率为58.05%~75.81%;其挥发物可造成番茄灰霉病菌菌丝畸形、分枝增多、原生质外渗等,对番茄果实灰霉病的防效72 h后达53.62%。表明产香真菌普通瘤座孢GS-1菌株挥发物对番茄灰霉病有良好的生防效果。     

拟康宁木霉T-51菌株生物学特性及其生物防治潜力

为进一步扩宽拟康宁木霉Trichoderma koningiopsis T-51菌株的生防应用范围,该研究测定T-51菌株菌丝生长、产孢和分生孢子萌发的最适温度、光照和碳氮源条件及其对灰葡萄孢Botrytis cinerea菌核的重寄生能力和对12种植物病原真菌的生防潜力。结果表明,拟康宁木霉T-51菌株在26℃下菌丝生长最快,生长速度达到2.5 cm/d,在20℃光照条件下产孢量最大,达到1.64×109个/皿,26～28℃光照条件下适宜T-51菌株分生孢子萌发;供试氮源中硫酸铵和硝酸铵适宜T-51菌株菌丝生长、产孢和分生孢子萌发,供试碳源中葡萄糖和可溶性淀粉适宜T-51菌株菌丝生长和分生孢子萌发,果糖和乳糖适宜T-51菌株产孢;T-51菌株能够重寄生灰葡萄孢菌核,当分生孢子悬浮液浓度为1×108个/mL时,重寄生效果最好;T-51菌株对核盘菌属Sclerotinia和丝核菌属Rhizoctonia植物病原真菌重寄生能力较强,对镰刀菌Fusarium spp.、暹罗刺盘孢菌Colletotrichum siamense、桃褐腐病菌Monilinia fructicola和稻瘟菌Mag...     

解淀粉芽胞杆菌XJ5挥发性物质抑菌活性及对苹果褐腐病防效测定

解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens XJ5挥发性物质对苹果褐腐病菌Monilinia fructigena等多种病原真菌具有良好的拮抗活性。通过固相微萃取-气相色谱质谱联用仪（Solid-phase microextraction-Gas chromatography mass spectrometry，SPME-GC-MS）对菌株XJ5产生的挥发性物质进行检测，利用平板对扣法测定挥发性化合物的抑菌活性，并离体接种评价菌株XJ5挥发性物质对苹果褐腐病的防效。结果表明，XJ5菌株挥发性物质对9种植物病原真菌的抑菌率在47.9%~84.8%，其中对苹果褐腐病菌的抑菌率最高为84.8%。SPME-GC-MS检测及抑菌活性测定表明，菌株XJ5分泌的主要挥发性物质为十二醛（Dodecanal），具有抑菌活性的挥发性物质主要为2-壬醇（2-Nonanol）、2-乙基己醇（2-Ethyl-1-hexanol）和2-十一醇（2-Undecanol）。其中2-壬醇抑制苹果褐腐病菌的EC₅₀为3.43 μg/mL，且XJ5菌液离体熏蒸与2-壬醇离体熏蒸均可有效抑制苹果褐腐病菌丝生长及病斑扩展，其对苹果褐腐病的离体防效分别在14.4%~71.2%和66.4%~97.6%，与对照差异显著。     

甲基营养型芽胞杆菌G-1抗菌肽的分离及抑菌作用研究

为探索甲基营养型芽胞杆菌Bacillus methylotrophicus G-1抑制番茄灰霉病菌的作用机制，采用HPLC、LC-MS等对其分泌的抗菌肽进行分离鉴定，通过扫描电镜观测抗菌肽对番茄灰霉病菌菌丝形态影响，借助RNA-seq研究抗菌肽处理番茄灰霉病菌3、5 d后的差异表达基因。研究结果表明：甲基营养型芽胞杆菌G-1产生的抗菌肽主要为伊枯草菌素A。经菌株G-1抗菌肽处理后，番茄灰霉病菌菌丝生长异常，菌体畸形肿胀，内溶物外渗。基因差异表达分析表明，有40个基因在2个时期均差异表达。GO、KEGG富集分析发现，与萜烯合酶、氨基酸跨膜转运相关的15个基因在各时期均上调表达，与细胞表面受体信号通路、氧化还原酶、果胶裂解酶、单加氧酶等有关的25个基因在各时期均下调表达，其中编码琥珀脱氢酶（SDH）的Bcin02g06840基因及编码3-羟基-3-甲基戊二酸辅酶A还原酶（HMGR）的Bcin04g04450基因表达量显著下调。经qRT-PCR验证，8个差异表达基因的表达模式变化与转录组测序分析结果一致。研究表明菌株G-1抗菌肽可能通过抑制番茄灰霉病菌细胞膜组分中SDH、HMGR的合成抑制菌丝及孢子的生长。     

水稻稻瘟病拮抗稀有放线菌的筛选及防治效果

为获得对水稻稻瘟病菌具有良好抑菌效果的稀有放线菌，从红豆杉根际土壤样品中分离获得11株放线菌，筛选出对水稻稻瘟病菌抑菌效果最好的菌株ST7—2，抑菌率为79.88%，经形态特征、生理生化特征观察和16S rRNA、recA、gyrB、rpoB序列分析，确定菌株ST7—2为杀结节链霉菌Streptomyces tubercidicus。菌株ST7—2对水稻稻瘟病菌Magnaporthe oryzae、大豆炭疽病菌Colletotrichum truncatum、芦笋茎枯病菌Phomopsis asparagi、水稻稻曲病菌Ustilaginoidea virens、蘑菇褐腐病菌Mycogone perniciosa共5种病原真菌具有较好的抑菌效果。室内盆栽试验结果表明，菌株ST7—2发酵液对水稻苗瘟防效为82.76%，与75%三环唑可湿性粉剂1700倍无显著性差异；田间小区试验结果显示，发酵液对水稻穗颈瘟防效为73.57%，比75%三环唑WP 1700倍的防效略低。因此，杀结节链霉菌ST7—2是防治水稻稻瘟病的潜在生防菌株，生防应用前景广阔。     

枯草芽胞杆菌HMB19198菌株抑菌物质的鉴定及其对番茄灰霉病的防治

 设施番茄灰霉病发生频繁,易产生抗药性,利用微生物杀菌剂防治番茄灰霉病是切实可行且对环境友好的措施之一。本研究通过抑菌活性测定和田间棚室试验,获得一株有效防治番茄灰霉病的生防细菌HMB19198,通过16S rDNA联合gyrA、gyrB、rpoB和rpoC等看家基因序列比对将菌株HMB19198鉴定为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。对峙培养结果表明,菌株HMB19198的脂肽提取物对灰霉菌表现较强的抑菌活性,通过色谱分离技术结合质谱分析,证明菌株HMB19198主要产生脂肽类抗生素丰原素(fengycin)和表面活性素surfactin,其中fengycin包含fengycin A(C15-C18)和fengycin C(C19-C20)两种同系物。抑菌活性测定表明,fengycin对灰霉菌表现较强的抑菌活性,显微观察发现,fengycin处理后造成灰霉菌菌丝畸形。通过对菌株HMB19198全基因组序列进行分析,获得fengycin合成酶基因簇,从基因水平证明菌株HMB19198可以产生fengycin。     

拮抗内生芽孢杆菌BEB17分离鉴定及其挥发性物质抑菌活性分析

 项目组从健康香蕉植株根部中分离得到一株对多种植物病原真菌具有抑菌活性的内生细菌。结合形态特征观察、生理生化分析及分子鉴定,鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),命名为BEB17。双皿对峙实验结果表明,该菌株产生的挥发性有机物(Volatile organic compounds, VOCs)可抑制多种病原真菌生长,其中对香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4,Foc4)抑制效果最强,抑制率达66.86%±0.90%,并能抑制其孢子萌发。用BEB17产生的挥发性物质做熏蒸处理后,Foc4菌丝发生缢缩膨大,细胞膜被破坏。采用顶空法固相微萃取结合气质联用(HS-SPME-GC-MS)对BEB17产生的挥发性有机物(VOCs)进行收集鉴定,得到10类33种单体有机物组分。     

链霉菌3-10发酵液及提取物的稳定性研究

为合理利用链霉菌3-10的代谢产物,本研究采用不同极性的有机溶剂提取链霉菌3-10发酵液中的抗真菌物质并得到发酵液的提取物.在此基础上测定了温度、紫外线辐射、酸碱度和贮存条件对3-10抗真菌物质稳定性的影响.结果表明,乙酸乙酯为最佳提取溶剂,链霉菌3-10发酵液的乙酸乙酯提取物对灰霉病菌菌丝生长的抑制作用最强,提取后余...     

我国葡萄灰霉病菌对四霉素和啶酰菌胺的敏感性测定

灰霉病是葡萄生产上的重要病害之一,严重影响葡萄果实的品质和产量。为明确葡萄灰霉病菌对四霉素和啶酰菌胺的敏感性,本研究分别采用菌丝生长速率法和孢子萌发法测定了四霉素和啶酰菌胺对采自云南省宾川县、湖北省武汉市和辽宁省北镇市60株葡萄灰霉病菌的有效抑制中浓度EC₅₀,建立了敏感性基线,并分析了二者之间的交互抗性。结果显示,葡萄灰霉病菌对四霉素和啶酰菌胺的敏感基线分别为0.245和1.115 μg/mL;上述葡萄灰霉病菌均对四霉素敏感,而11.7%的菌株表现为啶酰菌胺抗性。并且四霉素与啶酰菌胺之间不存在交互抗性(r=-0.040,P>0.05)。因此,四霉素可作为防治葡萄灰霉病的候选药剂,研究结果对两种杀菌剂的科学使用以及葡萄灰霉病的可持续防控具有重要的理论和实践意义。     

竹醋液对几种植物病原真菌的抑制活性

 新制竹醋液抑制6种作物8种病原真菌菌丝生长的活性大小序为:苹果霉心病菌 > 小麦赤霉病菌 > 黄瓜炭疽病菌 > 番茄灰霉病菌 > 葡萄炭疽病菌 > 番茄早疫病菌 > 草莓灰霉病菌 > 苹果腐烂病菌 > 苹果轮纹病菌 > 黄瓜灰霉病菌,有效抑制中浓度(EC₅₀)介于0.1185%-0.8035%(g/mL,干重/体积)之间。室温下保存1年的竹醋液抑制7种作物8种病菌菌丝生长的EC₅₀在0.0832%-0.3334%之间,对苹果霉心病菌的抑制活性下降,对6种作物的6种病菌的抑制活性均高于新制竹醋液。在2%水琼脂培养基上测定发现竹醋液明显抑制草莓灰霉菌分生孢子萌发,对该菌7个菌株的EC₅₀在0.0365%-0.1311%之间,平均为0.0673±0.0332%。叶盘漂浮法测定发现0.0125%、0.025%和0.05%的竹醋液对葡萄霜霉病的防效分别为23.5%、38.8%和78.4%,对葡萄霜霉病菌5个菌株EC₅₀在0.0191%-0.0464%之间,平均为0.0317 ±0.0109%。