大麦黄矮病毒侵染小麦miRNA鉴定和特征分析

 大麦黄矮病毒(barley yellow dwarf viruses,BYDVs)引起的小麦黄矮病严重威胁我国麦类生产,造成严重经济损失。植物中的miRNA调控植物生长发育、信号转导及对外界压力的反应,通过调控植物抗性基因的表达影响植物与病原物的互作。本研究对感染BYDV-GAV 后3 d、7 d及健康对照的‘小偃6号'小麦样品进行miRNA测序,合并去冗余后分别得到99、96、95个已知的miRNA序列和806、809、1 024个新miRNA序列。对这些miRNA进行差异表达分析,BYDV-GAV侵染后3 d和7 d的小麦样品,与对照相比上调表达的miRNA数量分别为3个和7个,下调表达的为14个和12个。将差异表达的miRNA利用psRNATarget进行靶基因预测,共得到1 254个靶标基因。靶基因的KEGG和GO富集分析,进一步明确了其功能及作用通路。对14个病毒病症状相关的靶基因进行定量分析,结果表明随病毒侵染时间的延长,这些靶基因出现差异性表达,显示miRNA参与了寄主与病毒的互作。研究结果有助于揭示BYDV-GAV与寄主小麦的互作机理。     

大麦黄矮病毒侵染小麦miRNA鉴定和特征分析

 大麦黄矮病毒(barley yellow dwarf viruses,BYDVs)引起的小麦黄矮病严重威胁我国麦类生产,造成严重经济损失。植物中的miRNA调控植物生长发育、信号转导及对外界压力的反应,通过调控植物抗性基因的表达影响植物与病原物的互作。本研究对感染BYDV-GAV 后3 d、7 d及健康对照的‘小偃6号'小麦样品进行miRNA测序,合并去冗余后分别得到99、96、95个已知的miRNA序列和806、809、1 024个新miRNA序列。对这些miRNA进行差异表达分析,BYDV-GAV侵染后3 d和7 d的小麦样品,与对照相比上调表达的miRNA数量分别为3个和7个,下调表达的为14个和12个。将差异表达的miRNA利用psRNATarget进行靶基因预测,共得到1 254个靶标基因。靶基因的KEGG和GO富集分析,进一步明确了其功能及作用通路。对14个病毒病症状相关的靶基因进行定量分析,结果表明随病毒侵染时间的延长,这些靶基因出现差异性表达,显示miRNA参与了寄主与病毒的互作。研究结果有助于揭示BYDV-GAV与寄主小麦的互作机理。     

miRNA在植物病毒基因组中的靶基因预测及分析

microRNA(miRNA)是一类长约22nt的内源性的非编码小RNA,在植物的生长发育和胁迫响应中起重要调控作用。本文通过生物信息学的方法,在miRBase中下载了12种植物的miRNA序列;在DPVweb和VIDE病毒数据库中查找侵染这些植物的病毒,并在NCBI数据库中搜索其基因组序列,共获得173种病毒的基因组序列。用psRNATarget在线软件预测植物miRNA在植物病毒中的靶基因,发现植物miRNA可能参与调控包括聚合蛋白、衣壳蛋白、逆转录酶、复制相关基因、通读蛋白、依赖RNA的RNA聚合酶等多种植物病毒基因的表达。     

尤力克柠檬上一种新病害的生物学特性及RT-PCR检测

近年我国云南瑞丽市的一果园尤里克柠檬上出现一种引起叶片皱缩、反卷或呈船形,叶背水浸状、侧脉脉明、黄化的柑橘新病害。为明确该病害的病原及其生物学特性,通过田间观察、病样接种、电镜观察,并基于柑橘黄脉病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)外壳蛋白基因设计引物对病样进行RT-PCR检测。结果表明,该病是一种嫁接传染性病害,能侵染柠檬和酸橙品种且症状明显,并能摩擦接种到辣椒和豇豆等草本植物。该病发病最适温度为18~24℃。春梢嫩叶症状表现明显,夏梢和秋梢基本不表现症状,而晚秋梢也表现出较春梢稍弱的典型症状。引致该病的病毒为(13~15)nm×(400~1 000)nm大小的联合丝状病毒。RT-PCR扩增产物为614 bp,且其与CYVCV外壳蛋白序列相似性达97%以上,表明该病害是由CYVCV引起的柑橘黄脉病,并初步建立了该病的RT-PCR检测技术。     

黄瓜中与黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染相关的miRNA表达特征分析

MicroRNA作为一种内源小分子非编码RNA,在植物生长发育、信号转导、转录调控、新陈代谢及各种胁迫条件下发挥重要作用。本研究通过生物信息学技术对黄瓜miR159和miR858的靶基因进行预测和功能分析,结果显示miR159和miR858的靶基因主要为MYB类转录因子家族成员,参与植物生长发育和抗病过程。实时荧光定量PCR分析黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)不同侵染时期在黄瓜不同组织中目的miRNA的表达特征,结果表明黄瓜miR159和miR858的表达具有时空特异性和组织特异性,二者均可对CGMMV侵染做出响应并存在显著差异表达。     

二化螟响应Bt杀虫蛋白Cry1Ca的小RNA转录组分析

为有效防控二化螟Chilo suppressalis,采用Illumina Solexa二代测序技术对Bt杀虫蛋白Cry1Ca处理后二化螟中肠内的小RNA序列进行测序,并对其差异表达谱进行注释与分析,并用实时荧光定量PCR技术对测序结果进行验证。结果显示,Cry1Ca对二化螟的亚致死量LC₃₀为0.061 μg/g。Cry1Ca处理和对照处理后转录组中小RNA分布峰值均为22 nt,被注释的已知小RNA比例很低,分别为7.2%和7.9%。Cry1Ca处理后,二化螟中肠内miRNA、snoRNA、snRNA、rRNA、piRNA数量均少于对照。与对照相比,Cry1Ca处理后二化螟中肠内共有358个小RNA表达上调,747个小RNA表达下调,其中有25个已知miRNA的表达量较高,其中3个已知miRNA表达量显著上调,22个已知miRNA表达量显著下调;在新预测的novel miRNA中,有23个上调表达,43个下调表达。KEGG分析结果显示,Cry1Ca诱导的miRNA影响了丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）通路,这个通路包含17个靶基因,其中11个靶基因可被多个miRNA调控,每个靶基因可被59~665个miRNA靶向调控,参与靶向调控miRNA的相对表达量变化倍数介于0.01倍~23 289倍之间,表明miRNA在调控二化螟防御Bt杀虫蛋白Cry1Ca方面发挥着重要作用。实时荧光定量PCR的结果与测序结果一致,表明测序结果正确。     

柑橘黄化脉明病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及应用

为探索柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)引起的柑橘新病害—柑橘黄脉病的早期快速检测技术,针对CYVCV核酸结合蛋白基因的保守序列设计2对特异性引物,通过优化退火温度,建立了CYVCV巢式RT-PCR检测方法,并对采自不同柑橘品种的54个CYVCV疑似样品进行了检测。结果表明,CYVCV巢式RT-PCR检测中,以55℃和60℃分别作为第1轮和第2轮扩增的退火温度时检测效果最佳;该方法检测样品中病毒总核酸的最低浓度为2.40μg/L,灵敏度较RT-PCR提高100倍。在CYVCV疑似样品检测中,巢式RT-PCR和RT-PCR的阳性检出率分别为59.26%和57.41%,前者更适用于检测不同来源的CYVCV。当尤力克柠檬、锦橙北碚-447、天草和台湾椪柑嫁接接种CYVCV后,巢式RT-PCR比RT-PCR提前10~30 d检测出病毒。表明所建立的CYVCV巢式RT-PCR检测方法适用于田间病树的早期诊断。     

广西柑橘衰退病和黄脉病调查及其病原病毒的遗传多样性分析

为明确柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus, CTV)和柑橘黄脉病毒(citrus yellow vein clearing virus, CYVCV)在广西柑橘上的发生?分布及其遗传变异情况, 于2020年至2021年对百色?北海?崇左?贵港?桂林?河池?贺州?来宾?柳州?南宁?梧州和玉林等12个柑橘产区进行了病毒病调查?采用RT-PCR对采集样品进行了病毒检测, 并基于病毒分离物外壳蛋白(coat protein, CP)基因的核苷酸序列进行比对分析, 构建系统发育树?结果表明:采集的737份柑橘样品中, CTV的检出率为20.62%, CYVCV检出率为18.32%, CTV的检出率略高于CYVCV?病毒复合侵染的现象在采集的柑橘样品中普遍存在, CTV和CYVCV复合侵染率高达34.50%?对RT-PCR产物测序共获得12个CTV分离物和6个CYVCV分离物的CP基因序列?遗传多样性分析发现, CTV和CYVCV的CP基因序列都较保守, CTV分离物的遗传进化与地理来源?寄主来源均没有明显相关性, 但CYVCV分离物的遗传进化与地理位置具有相关性, 而与寄主来源无明显相关性?上述研究结果可为深入了解CTV和CYVCV在广西的流行情况以及柑橘病毒病的检疫和防控提供参考?     

亚洲柑橘木虱中柑橘黄脉病毒的鉴定

<正>柑橘黄脉病毒(citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)为正单链RNA病毒，属于α线性病毒科Alphaflexiviridae印度柑橘病毒属Mandarivirus成员，病毒粒子为弯曲线状，基因组大小约为7 529 nt^[1]。CYVCV可侵染大部分柑橘品种，对柠檬和酸橙危害尤为严重。CYVCV 2009年在我国首次发现，现已在我国柑橘主产区均有发生，已知的传媒昆虫为柑橘粉虱(Dialeurodes citri)和棉蚜(Aphis gossypii)^[2-4]。     

利用小RNA深度测序技术鉴定上海地区‘红美人’柑橘病毒种类

为明确上海地区‘红美人’柑橘的病毒种类, 2020年4月在崇明、金山、奉贤、嘉定、闵行和浦东采集疑似病毒感染的叶片样品11份, 采用小RNA深度测序技术结合RT-PCR对不同来源的混合样品进行病毒种类鉴定。结果表明, 样品中含有柑橘衰退病毒Citrus tristeza virus (CTV)、柑橘黄化脉明病毒Citrus yellow vein clearing virus(CYVCV)、柑橘树皮裂纹类病毒Citrus bark cracking viroid(CBCVd)和柑橘类病毒Ⅴ Citrus viroid V(CVd-Ⅴ)。同时发现, 上海地区‘红美人’柑橘病毒复合侵染现象普遍。基于CTV和CYVCV的CP全长基因及CBCVd和CVd-Ⅴ全基因组序列系统进化分析结果表明:除了CYVCV的分离物与地理来源具有明显的相关性外, 其余病毒及类病毒均没有严格的地域相关性。研究结果为开展‘红美人’柑橘种苗病毒检测及病毒病的防治奠定基础。     

Effects of resistance of Eremocitrus glauca and Microcitrus australis to viroid infection: replication,accumulation and long‐distance movement of six citrus viroids

In studies to identify genotypes resistant to infection with citrus viroids, Eremocitrus glauca and Microcitrus australis were selected because their evolution in their habitat in Australia and New Guinea may have led to the selection of unusual traits. The movement and accumulation of Citrus exocortis viroid (CEVd), Hop stunt viroid, Citrus bent leaf viroid, Citrus dwarfing viroid, Citrus bark cracking viroid and Citrus viroid V (CVd‐V) in self‐rooted as well as in graft‐ propagated E. glauca and M. australis plants was assessed by northern hybridization, RT‐PCR and by topworking to the sensitive selection 861‐S1 of Etrog citron. In both plant species the inoculated viroids were undetectable unless these plants were grafted to a susceptible Citrus partner, the rough lemon rootstock and/or the topworked Etrog citron, which acted as viroid sources. The results obtained indicate that M. australis and in particular E. glauca are poor viroid hosts in which viroid replication/accumulation does not occur or is extremely inefficient. However, viroid downward and upward movement to grafted Citrus partners in which viroid replication and accumulation occurs efficiently was not impaired. Eremocitrus glauca and M. australis showed differences regarding their properties as viroid hosts, but for both species CEVd seemed to have the lowest affinity among the viroid species tested and CVd‐V the highest. Even though E. glauca and M. australis do not appear to be truly resistant to viroid infection, they are interesting genotypes for further characterization of the mechanisms involved in viroid infection.     

Effect of temperature on RNA silencing of a negative‐stranded RNA plant virus: Citrus psorosis virus

Citrus psorosis virus (CPsV), genus Ophiovirus, causes a bark scaling disease of citrus. CPsV virions are kinked filaments with three negative‐stranded RNA molecules (vRNA) and a 48 kDa coat protein. The effect of temperature on symptom expression, virus accumulation and RNA silencing was examined in sweet orange seedlings (Citrus sinensis) graft‐inoculated with three different CPsV isolates and grown in a glasshouse at 26/18°C or 32/26°C (day/night). Most plants kept in the cooler glasshouse showed a shock reaction in the first flush with shoot necrosis, and then moderate to intense chlorotic flecking and spotting in young leaves, whereas plants incubated at 32/26°C did not exhibit shoot necrosis, and young leaf symptoms were milder. Virus titre estimated by ELISA and by northern and dot blot hybridization paralleled symptom intensity, with significantly higher virus accumulation in plants incubated at 26/18°C. The amount of CPsV‐derived small RNAs (CPsV‐sRNAs) slightly increased at 32/26°C, with the ratio of CPsV‐sRNA/vRNA being higher at 32/26°C than at 26/18°C. These results suggest that (i) CPsV infection induces RNA silencing in citrus plants, (ii) symptom intensity is associated with virus accumulation, and (iii) temperature increase enhances the RNA silencing response of citrus plants and decreases virus accumulation.     

柑橘黄龙病侵染相关抗病基因同源序列的克隆鉴定与表达分析

[目的]从黄龙病耐病寄主植物cDNA中筛选抗病基因相关序列并对其进行表达分析研究。[方法]根据已克隆的植物抗性基因表达产物NBS-LRR保守区域设计简并引物,以耐HLB的柑橘属柚cDNA为模板扩增RGAs,并进行实时荧光定量PCR。[结果]通过RFLP分析及克隆测序共得到5个NBS类抗病基因相似序列(RGAs)片段,在GenBank上登录号为HM777043～HM777047。通过Clustalx、DNAMAN等软件分析5个RGAs及其推导的氨基酸的相似性,结果显示它们均含有典型NBS-LRR类抗性基因所具有的保守区域:P-loop、Kinase-2a、GL-PLAL,其与已克隆的烟草N、亚麻L6、拟南芥RPS2、RPS5、RPP8、RPM1等抗病基因在保守区域氨基酸水平上的相似性为19.71%～42.86%。根据得到的序列设计特异性引物,对5个RGAs在HLB侵染过程中的表达进行定量PCR,结果显示嫁接病芽接穗后的8次连续采样中5个RGA的表达受到不同程度的调控。[结论]表明5个RGAs可能与黄龙病的侵染有关。     

感染大麦黄矮病毒的小麦中vsiRNA特征分析

 RNA沉默是植物中一种保守的抗病毒机制,其以大量病毒来源的小干扰RNA(virus-derived small interfering RNAs,vsiRNAs)的产生为标志,病毒在侵染寄主过程中可通过vsiRNAs靶向寄主转录本以对抗这种防御机制。BYDV-GAV引起的小麦黄矮病导致小麦黄化和矮化症状,对小麦生产构成严重威胁。通过深度测序技术,分析了感染BYDV-GAV的感病小麦品种‘小偃6号’中vsiRNAs的特征,共得到11 384个vsiRNAs,并预测到37 784个寄主靶基因。发现来源于BYDV-GAV基因组的正义和反义链的vsiRNAs的数量分布大致相等,在5’末端具有A和C偏好性,长度主要在21nt~22nt。靶基因的功能分析表明这些靶基因参与了广泛的生物学功能,尤其是在寄主-病原物互作中占的比重最大。选取25个参与寄主-病原互作的抗性相关基因进行定量验证,发现接种BYDV-GAV后有15个明显下调,6个上调,4个微弱下调,表明测序结果和靶基因预测可靠。推测BYDV-GAV可以通过vsiRNAs干扰寄主抗性基因表达和信号转导,从而实现对感病寄主的侵染。研究结果对揭示BYDV-GAV与小麦互作的分子机制具有重要意义。     

感染大麦黄矮病毒的小麦中vsiRNA特征分析

 RNA沉默是植物中一种保守的抗病毒机制,其以大量病毒来源的小干扰RNA(virus-derived small interfering RNAs,vsiRNAs)的产生为标志,病毒在侵染寄主过程中可通过vsiRNAs靶向寄主转录本以对抗这种防御机制。BYDV-GAV引起的小麦黄矮病导致小麦黄化和矮化症状,对小麦生产构成严重威胁。通过深度测序技术,分析了感染BYDV-GAV的感病小麦品种‘小偃6号’中vsiRNAs的特征,共得到11 384个vsiRNAs,并预测到37 784个寄主靶基因。发现来源于BYDV-GAV基因组的正义和反义链的vsiRNAs的数量分布大致相等,在5’末端具有A和C偏好性,长度主要在21nt~22nt。靶基因的功能分析表明这些靶基因参与了广泛的生物学功能,尤其是在寄主-病原物互作中占的比重最大。选取25个参与寄主-病原互作的抗性相关基因进行定量验证,发现接种BYDV-GAV后有15个明显下调,6个上调,4个微弱下调,表明测序结果和靶基因预测可靠。推测BYDV-GAV可以通过vsiRNAs干扰寄主抗性基因表达和信号转导,从而实现对感病寄主的侵染。研究结果对揭示BYDV-GAV与小麦互作的分子机制具有重要意义。     

Citrus as a molecular contact point for co-evolution of Alternaria pathogens

Alternaria black rot, Alternaria leaf spot of rough lemon, and Alternaria brown spot of tangerines are three major citrus Alternaria pathogens. Citrus could be considered as a molecular contact point for host-selective toxin (HST)-mediated co-evolution of these Alternaria pathogens and susceptibility in the field. ACR-toxin is an HST produced by the rough lemon pathotype, and the target site of the toxin was identified as rough lemon mitochondria. The biosynthetic gene cluster for ACR-toxin production is on the 1.5 Mb-chromosome of the rough lemon pathotype. Another gene cluster for ACT-toxin production is located on the 1.9 Mb-chromosome of the tangerine pathotype. These TOX genes shown to have a role in ACR- or ACT-toxin biosynthesis by using gene disruption and silencing.