乙烯信号传导途径因子OsEIL 6调控水稻抗稻瘟病反应

稻瘟病(rice blast)是水稻生产上最严重的病害之一。抗病相关基因的挖掘对稻瘟病的防治具有重要意义。研究表明植物EIN3/EIL家族基因在抗病过程中发挥着重要作用。本研究采用RNAi技术探究OsEIL6参与的水稻抗稻瘟病反应。稻瘟菌侵染时基因表达谱检测结果表明,OsEIL6在水稻和稻瘟菌非亲和组合中受到诱导表达。稻瘟菌接种结果显示,水稻OsEIL6沉默株系和野生型植株‘TG394’相比抗性下降;实时荧光定量RT-PCR结果分析表明,OsEIL6的表达量下降导致乙烯合成途径中OsACO1和乙烯信号传导途径的OsERF063和OsERF073的转录水平下降。亚细胞定位研究发现该基因定位于水稻细胞质。OsEIL6沉默株系中ROS合成途径标记基因OsrbohA和OsrbohB的表达量均明显下调,表明该基因可能通过影响ROS的合成调控水稻抗稻瘟病反应。本研究结果将有助于进一步揭示OsEIL6参与的乙烯信号传导途径介导的水稻抗稻瘟病反应机制。     

水稻抗白叶枯病基因Xa47(t) a的敲除及抗性鉴定

为鉴定水稻Xa47(t)a基因对白叶枯病的抗性,以水稻种质L214为材料,通过构建针对Xa47(t)a基因的Xa47(t)a-Cas9敲除载体来获得敲除突变体,利用生物信息学技术对突变的Xa47(t)a基因进行突变类型分析,同时采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)技术分析突变体中Xa47(t)a及病程相关基因的表达情况,并于水稻孕穗期对突变体及其野生型植株接种11株白叶枯病菌Xanthomonas oryzae pv. oryzae菌株进行抗性鉴定。结果表明,在Xa47(t)a基因的第2外显子区域进行基因编辑后成功获得25株T₀代突变体株系;测序分析发现T₀代突变体株系中有13种不同的突变体类型,其中纯合突变体有3种类型,且突变位点均在靶标位点的11位碱基处缺失1～4个A碱基;氨基酸序列分析发现大部分突变体中Xa47a编码的蛋白翻译会提前终止,由原来的803个氨基酸变为144～166个氨基酸;qPCR分析结果表明突变体中Xa47(t)a及大部分病程相关基因的表达水平显著低于野生型株系;抗性鉴...     

转苏云金杆菌毒蛋白基因水稻抗螟性的离体叶片测定法

提出了转苏云金杆菌ｃｒｙｌＡｂ基因水稻抗螟性的快速离体叶片测定法,并用该方法评价了转ｃｒｙ１／Ａｂ基因水稻对二化螟、三化螟和大螟的抗性程度。结果表明,３种螟虫蚁螟取食纯合株系ＰＲ１６及分离株系ＰＲ１８、ＰＲ５７或ＰＲ５８中抗性植株中片后,食叶量与对照和分离株系中的非抗性植株相比极显著下降,接虫后第４ｄ的幼虫死亡率高达１００％。该方法评价转ｃｒｙ１／Ａｂ基因水稻对３种螟虫的抗性结果与活化成株测定法评     

转基因水稻对病原菌侵染的反应和防卫基因的表达分析

 为了阐明OsBTF3基因在水稻对白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)和细菌性条斑病菌(X. oryzae pv. oryzicola, Xoc)侵染抗/感反应中的功能,本研究以OsBTF3过量表达和RNAi转基因株系为材料,比较分析了T1代株系对病菌侵染的抗感病反应,定量测定了防卫基因的表达动态。结果表明,与野生型对照株相比,无论过量表达株系,还是RNAi株系对Xoo和Xoc侵染均表现为更加感病的反应; 经Xoo接种后,过量表达和RNAi株系OE37和RNAi株系RI30防卫基因的表达发生了不同程度的变化。因此,OsBTF3增量/减量表达对水稻抗/感病性具有重要的调控作用,这种作用可能并不依赖于水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)介导的信号途径。     

水稻中MPK5稳态失衡抑制拟禾本科根结线虫与水稻的亲和互作

 拟禾本科根结线虫(Meloidogyne graminicola)为水稻的重要土传病原,可严重为害水稻。本研究旨在探究水稻中丝裂原活化蛋白激酶5(MPK5)稳态失衡对拟禾本科根结线虫与水稻亲和互作的影响,并初步探讨其机制。首先,通过线虫侵染试验发现,在水稻中超表达和沉默MPK5 引发的MPK5 稳态失衡均可抑制拟禾本科根结线虫与水稻的亲和互作。qRT-PCR 分析结果显示,与水稻野生型不同,在MPK5 超表达和沉默水稻株系中MPK5 均受拟禾本科根结线虫诱导表达。同时,拟禾本科根结线虫可抑制MPK5 超表达株系中几丁质酶的表达,但诱导MPK5 沉默株系中病程相关基因PR5 与PR10 的表达。上述试验结果表明,MPK5 稳态失衡可导致MPK5 响应拟禾本科根结线虫的侵染,且在MPK5 超表达和沉默水稻株系中MPK5 介导水稻产生拟禾本科根结线虫抗性的机制不同。     

OsDCL1基因沉默突变体诱导稻瘟病抗性的转录组分析

稻瘟病是严重危害水稻生长的真菌病害,每年给水稻生产带来重大经济损失。与野生型日本晴NPB相比,OsDCL1基因沉默突变体增强了水稻对稻瘟菌的广谱抗病性。为了解水稻OsDCL1-RNAi突变体的抗病机制,我们分析和比较了它和野生型日本晴NPB在稻瘟菌侵染前后转录组水平的变化。响应稻瘟菌侵染的7 129个差异表达基因(DEGs)中,NPB和OsDCL1-RNAi突变体分别有5 382和5 180个基因表达发生了变化,参与生物胁迫反应、信号通路、蛋白代谢和RNA调控4个通路的基因明显被富集。以野生型未受稻瘟菌侵染的基因表达为对照,在OsDCL1-RNAi突变体中共发现1 318个DEGs,且超过70%是上调的,其中很多基因参与了生物胁迫反应(26.9%)和信号通路(11%),上调表达基因中与生物胁迫反应相关的主要为PR基因和细胞壁相关基因。另外,还发现10个茉莉酸相关基因和11个水杨酸相关基因分别在OsDCL1-RNAi突变体中显著下调和上调表达。在OsDCL1-RNAi突变体中还发现WRKY和MYB等一些转录因子家族以及部分受体类激酶被诱导表达。用qRT-PCR方法验证部分差异表达的基因,其结果与DEGs基本一致。OsDCL1-RNAi突变体中转录组变化的分析,为深入了解该突变体抗瘟性增强的机制奠定了基础。     

水稻抗稻瘟菌HIGS表达载体的构建及遗传转化

水稻是我国主要粮食作物之一,而稻瘟病是影响水稻安全生产的最主要病害之一。为克服抗病基因的抗病性很快消失的弊端,本研究尝试了宿主诱导的基因沉默(HIGS)技术在创制抗稻瘟病水稻新材料上的可行性。HIGS是新发展起来的以RNAi为基础的抗病技术,即在寄主植物中表达可沉默病原物特定基因的HIGS载体,达到控制病原菌扩展的目的。本研究选取了两个稻瘟菌致病关键基因Nox1和NAC为研究靶标,分别克隆其UTR区和CDS区中的特异区段,利用Gateway技术构建这4个片段HIGS表达载体,再利用农杆菌介导法将各载体分别转化水稻,通过鉴定得到转基因阳性植株,为后续开展该技术在水稻抗稻瘟病方面的深入研究奠定了基础。     

基因间插入对水稻农艺性状及刺吸式口器害虫取食选择性与种群密度的影响

本文评价了T-DNA插入对水稻农艺性状与抗虫性、褐飞虱Nilaparvata lugens St?l取食选择性及3种刺吸式口器害虫种群密度的影响,以分析转基因操作及外源基因插入可能引起的非预期效应。结果表明,供试ZD1640-3、ZD1640-19、ZD1640-23和ZD1640-24共4个突变体株系T-DNA插入位点附近基因的表达均不受影响;除个别株系的株高、每穗粒数或结实率有降低外,主要农艺性状参数与受体亲本无显著差异。除ZD1640-24外,突变体各株系上褐飞虱、白背飞虱Sogatella furcifera(Horváth)和黑尾叶蝉Nephotettix bipunctatus(Fabricius)平均种群密度与受体亲本无显著差异;且4个突变体株系上3种害虫种群密度在大多数情况下与受体亲本也无显著差异。与受体亲本相比,突变体株系ZD1640-24对褐飞虱的抗性及取食选择性无显著影响。综合分析认为,T-DNA基因间插入并没有引起水稻发生显著的非预期变化,个别突变体某些考查指标的变化主要来自于个体差异。     

靶向水稻脂氧合酶OsRCI-1的活性小分子化合物筛选体系的建立

为明确虫害诱导水稻脂氧合酶OsRCI-1的生化特性,通过构建水稻脂氧合酶OsRCI-1重组蛋白原核表达体系,对重组蛋白催化条件进行优化,并研究小分子化合物对OsRCI-1活性的影响。结果表明,缓冲液pH和反应温度都能影响水稻OsRCI-1蛋白的催化活性,当缓冲液pH为7.0时催化活性最佳,为169.9 mol·mg~(-1)·min~(-1);在检测的20~50℃反应温度范围内,在25℃和45℃时出现2个催化活性高峰,分别为68.2 mol·mg~(-1)·min~(-1)和70.4 mol·mg~(-1)·min~(-1)。利用建立的OsRCI-1活性检测体系筛选出4种小分子化合物,即水杨苷异羟肟酸、水杨酸、叔丁基对二苯酚和茉莉酸,均对水稻OsRCI-1活性具有调控作用,抑制中浓度依次为0.12、418.67、232.84、2 747.19μmol/L。表明本试验所建立的靶向水稻脂氧合酶活性化合物鉴定体系可用于活性小分子化合物的快速、高通量筛选。     

棉花GhRAR1基因调控棉花抗黄萎病机理的研究

棉花黄萎病是一种严重影响棉株生长的土传维管束真菌病害。挖掘抗性基因,解析抗病机制,对创制棉花抗病种质防御棉花黄萎病具有重要意义。本研究从抗病棉花品种‘中植棉2号’中获得GhRAR1基因,采用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术、基因过表达及qRT-PCR技术探究GhRAR1介导的棉花抗黄萎病机制。结果表明,GhRAR1的表达受棉花黄萎病菌诱导。GhRAR1沉默棉株对黄萎病菌敏感性增强,表现为植株病情指数升高、叶片萎蔫、茎部维管束组织褐变加重。GhRAR1沉默棉株中活性氧(ROS)生成基因GhRbohD表达量低,H₂O₂积累量少。过表达GhRAR1基因的拟南芥植株对棉花黄萎病抗性增强,AtRbohD表达量高,H₂O₂积累量多,发生过敏反应(HR),菌丝扩散被抑制。推测GhRAR1可能调控ROS积累和HR,从而介导棉花对黄萎病菌的抗性。     

Bt蛋白在水稻不同遗传背景下的含量及对抗虫性的影响

为明确Bt基因在水稻杂交转育过程中抗虫作用的稳定性,以分别转入cry1C和cry2A基因的抗虫水稻品系T1C-19和T2A-1为供体亲本,与10个恢复系杂交并回交,筛选BC1F3代转基因纯合株系,用ELISA法测定水稻叶片和茎秆中Bt蛋白含量。结果表明,4个转cry1C株系和5个转cry2A株系叶片和茎秆的蛋白含量显著低于亲本,且降低了16.62%~62.03%;相同遗传背景下,叶片和茎秆中的Bt蛋白含量之间呈显著正相关;在室内转cry1C株系和转cry2A株系上二化螟幼虫的校正死亡率分别为62.50%~95.83%和37.50%~83.33%,其中在cry2A株系上的校正死亡率与茎秆中的Cry2A蛋白含量呈极显著正相关;在田间自然发虫条件下,纯合株系的单株卷叶数和枯心率最高仅为3.97和9.37%,受害程度与相应组织中Bt蛋白含量之间存在相关性。表明Bt蛋白含量会受到水稻遗传背景的影响,但杂交后代株系在田间仍能表现出很好的抗性。     

沉默转录因子OsERF7提高水稻对褐飞虱和白背飞虱的抗性

为了解植物中特有的转录因子乙烯响应因子(ethylene responsive factor,ERF)在植物诱导抗虫反应中的作用,通过克隆1个水稻ERF转录因子基因OsERF7,并结合分子生物学、反向遗传学及生物测定,探究其在水稻防御褐飞虱Nilaparvata lugens和白背飞虱Sogatella furcifera为害过程中的作用。结果显示,机械损伤处理与褐飞虱产卵雌成虫为害均能在中后期诱导OsERF7的表达。沉默OsERF7能显著降低水稻上褐飞虱及白背飞虱卵的孵化率,并延长褐飞虱卵的发育历期;与野生型水稻相比,褐飞虱和白背飞虱在沉默突变体品系R1和R30上的卵孵化率分别只有野生型水稻上的62.5%～68.3%和68.0%～76.0%,褐飞虱卵的发育历期则延长0.37～0.45 d。沉默OsERF7不影响褐飞虱产卵雌成虫为害诱导的水稻防御相关信号分子—茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)、乙烯(ET)和过氧化氢(H_2O_2)的含量。表明转录因子OsERF7作用于防御相关信号途径的下游,并且负调控水稻对褐飞虱和白背飞虱的抗性。     

二化螟对双酰胺类杀虫剂抗性的分子机制研究进展

新型双酰胺类杀虫剂已广泛用于保障水稻生产,而二化螟作为危害水稻生产的钻蛀性害虫,已经对该类杀虫剂产生了抗性,明确该类杀虫剂抗性分子机制,可为二化螟抗性快速检测和绿色防控提供技术支撑。本文在总结二化螟对双酰胺类杀虫剂抗性现状的基础上,重点综述了近年来有关其抗性分子机制研究的进展,主要包括解毒酶和转运蛋白基因过表达介导的代谢抗性,以及鱼尼丁受体基因突变介导的靶标抗性;指出了该研究领域在抗性分子检测、抗性新基因鉴定、抗性基因调控网络和多重抗性机制等方面存在的问题,并展望了其发展方向,认为：利用高通量测序技术检测害虫种群抗药性;利用多组学技术鉴定新抗性基因及调控网络,以探明多重抗性机制;将反向遗传学工具放射性配基结合及电生理技术深入验证抗性基因功能;需开发靶向抗性基因的dsRNA转基因作物、纳米农药及选择性新型化学杀虫剂,以达到杀虫剂减施增效的目的。     

水稻磷酸核酮糖激酶基因OsPRK克隆、亚细胞定位与诱导表达分析

为探究水稻磷酸核酮糖激酶基因OsPRK在水稻诱导抗虫反应中的功能,以水稻秀水110为材料克隆OsPRK基因的全长,通过生物信息学软件分析其序列特征,并应用实时荧光定量PCR技术分析OsPRK基因在水稻不同组织中的分布情况以及在虫害诱导、激素和机械损伤处理水稻中的表达特征。结果显示,水稻OsPRK基因序列全长为1 212 bp,编码403个氨基酸,分子量为44.86 kD,具有1个磷酸核酮糖激酶保守结构域。OsPRK蛋白亚细胞定位结果显示其定位于叶绿体。OsPRK基因在水稻中的表达具有组织特异性,其在内叶、外叶、内叶鞘、外叶鞘和根系这5个组织中相对于内参基因ACTIN的表达量分别为35.83、20.53、6.25、3.21和0.03。与对照相比,二化螟Chilo suppressalis为害能够强烈抑制水稻茎秆中OsPRK基因的表达;褐飞虱Nilaparvata lugens怀卵雌成虫为害1.5、24 h、白背飞虱Sogatella furcifera怀卵雌成虫为害1、8、24 h以及机械损伤处理3、6、24 h均能显著诱导水稻茎秆中OsPRK基因的表达;而OsPRK基因的表达量在茉莉酸处理6、12 h时以及水杨酸处理0.5、1.5 h时被显著抑制,在茉莉酸处理48 h和水杨酸处理24 h时被显著诱导。表明OsPRK基因可能参与了水稻对害虫的诱导防御反应。     

棉铃虫幼虫取食转HaHR3基因烟草后中肠组织的病理变化

<正>通过植物介导的RNAi能够沉默棉铃虫蜕皮调节转录因子Ha HR3基因。棉铃虫取食含有dsRNAs的转基因烟草后,其Ha HR3基因的转录水平及蛋白表达水平均被有效抑制,导致棉铃虫幼虫生长发育畸形或死亡(尹富仕等,2010;Xiong et al.,2013)。本研究利用透射电镜观察棉铃虫取食转Ha HR3基     

Harpin xoo在水稻中表达提高对白叶枯病不同小种抗性

用剪叶接种法测定10个转hrf1基因水稻株系对15个水稻白叶枯病菌小种的抗性.所有的转基因系对JxOV和PXO79小种的抗性与受体对照相比显著提高,RT-PCR结果显示,在转化hrf1基因的抗病水稻中,信号传导基因npr1表达明显增强,表明转hrf1基因水稻可能通过激发水稻中信号传导基因的表达,提高对白叶枯病菌不同小种的抗性.     

菊花‘C029’转录因子基因CmWRKY15-1的抗病功能分析

 菊花白色锈病(chrysanthemum white rust,CWR)是影响菊花生产效益的重要病害,明确菊花高抗品种‘C029’的抗病基因CmWRKY15-1响应菊花白色锈病的分子机制,对于培育菊花抗病新品种具有重要的理论和现实意义。本研究以菊花高抗品种‘C029’为试验材料,构建沉默载体pTRV2-CmWRKY15-1与过表达载体pBI121-CmWRKY15-1,利用农杆菌介导法转化菊花‘C029’,分别获得8株沉默株系,表达效率约为正常水平的30%～60%,和3株过表达株系,其中一株的表达水平为野生型(WT)的3.4倍,命名为OE-1。在病原菌侵染条件下,qRT-PCR测定WT与转基因株系中病程相关基因的表达量,探究CmWRKY15-1在菊花抵抗白色锈病过程中的功能。病原菌侵染后,在WT与OE-1中,NPR1和PR5的表达水平呈先上升后下降趋势,其表达量在OE-1中早于WT(分别在24和38 h)达到最高峰,PR1的表达量在OE-1于38 h达到峰值。在沉默株系中,NPR1和PR5的表达则受到抑制,且一直低于WT与OE-1株系。结果表明:CmWRKY15-1通过调控病程相关基因参与菊花抵抗白色锈病的反应。综上,CmWRKY15-1对菊花‘C029’抗白色锈病起到调控作用。     

转抗真菌基因水稻对纹枯病的抗性表达分析

采用人工接种和酶活性测定的方法,研究转入几丁质酶基因等1～4个抗真菌基因的13个转基因水稻株系对纹枯病的抗性和几丁质酶活性变化规律.结果表明:13个转基因水稻株系的抗性均显著高于非转基因亲本.母本抗性水平不同或者导入单个及多个抗真菌基因的转基因水稻中均可筛选出抗性优良的株系;转基因水稻病情指数的变异系数为21.93～69.32,高于非转基因亲本的14.37～47.00,表明转基因水稻的抗病性更容易变异.对转基因水稻几丁质酶的活性分析结果表明,除1个转基因水稻株系的酶活性与非转基因亲本相同外,其它转基因水稻酶活性均高于非转基因亲本,但酶活力高低与转基因水稻株系间抗病性的高低无显著的相关性.     

OsHsp18.0-CI调控水稻对白叶枯病的抗性

 热激蛋白广泛存在于各种生物中,响应多种生物胁迫和非生物胁迫。前期研究结果显示,在水稻中超量表达小热激蛋白OsHsp18.0-CI基因,能通过增强水稻的基础防卫反应提高对水稻细菌性条斑病的抗性。本研究发现,OsHsp18.0-CI基因也能够受到白叶枯病菌的诱导表达,超量表达OsHsp18.0-CI的转基因水稻也增强了对多个白叶枯病致病菌株的抗性。转录组测序分析发现,OsHsp18.0-CI基因介导的水稻对白叶枯病的抗病信号途径有部分类似于其介导的对细菌性条斑病的抗性路径,同时也有大量新的未知功能基因的参与。以上结果表明,OsHsp18.0-CI基因受到病原菌的侵染时,也能通过增强水稻的基础防卫反应来提高对白叶枯病的抗性。     

46份野生葡萄株系对霜霉病的抗性鉴定及其相关基因的表达

为明确不同野生葡萄株系对霜霉病的抗性差异,以18个种的46份野生葡萄株系为试材,采用叶盘法鉴定其对霜霉病的抗性,并利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)技术对部分关键基因进行定量分析,探讨其在不同抗病株系中的表达模式差异。结果表明,46份野生葡萄株系的病情指数为0～34.72,其中17份为感病株系,病情指数在25.93～34.72;21份为抗病株系,病情指数在5.32～24.35;5份圆叶葡萄株系均表现为免疫,病情指数为0.00;云南-元谋2、云南-2和木扎岭-3为高抗株系,病情指数分别为1.81、4.40和1.62。当被霜霉病菌侵染后,抗病株系和感病株系中的PAL、PR1、TLP和NPR1基因的诱导表达模式不同;与感病株系相比,抗病株系中的TLP、PR1和NPR1基因有强烈的诱导表达,PAL基因在感病株系比在抗病株系中表达量高。在免疫株系普莱德和高抗株系云南-元谋2中,NPR1与其它3个基因的表达模式差异最大;TLP在抗病株系蘡薁-林县中与其它3个基因的表达模式差异最大;在感病株系秋-嵩县中,NPR1与TLP表达模式相近,PAL和PR1表达模式相近。研究表明,在中国野生葡萄种质中,云南-元谋2、云南-2和木扎岭-3对霜霉病有良好的抗性,可作为抗病育种的原始材料;抗性基因可能在抗病株系中发挥着重要作用。