草鱼Ⅱ型干扰素的单克隆抗体制备与鉴定

Ⅱ型干扰素，也称干扰素-γ（IFN-γ），是参与辅助性T淋巴细胞1（Th1）免疫应答的关键细胞因子之一。研究表明，鱼类与哺乳类Ⅱ型干扰素同源，不同的是真骨鱼类（Teleost）有两种Ⅱ型干扰素，即IFN-γ和干扰素-γ相关因子（IFN-γrel）。迄今，对鱼类IFN-γ基因的表达规律和功能已有大量报道，而对IFN-γrel的研究尚不深入，产生IFN-γ和IFN-γrel的细胞来源不清楚，它们是否有功能差异也存在争议。为此，本研究构建原核表达质粒，在大肠杆菌DE3中表达草鱼（Ci）IFN-γ和CiIFN-γrel重组蛋白。实验结果显示，重组CiIFN-γ蛋白为可溶性蛋白，而CiIFN-γrel蛋白则不可溶。通过亲和层析和分子筛层析获得了高纯度CiIFN-γ和CiIFN-γrel重组蛋白，免疫小鼠制备了单克隆抗体。通过Western Blotting筛选获得4株特异性高、亲和力强的抗体，结果表明CiIFN-γ单克隆抗体与CiIFN-γrel没有交叉反应，反之亦然，其中FITC标记的两株抗体可用于免疫荧光和流式细胞术分析。此外，Western Blotting分析显示草鱼IFN-γ和IFN-γrel单克隆抗体不识别斑马鱼的同源Ⅱ型干扰素蛋白。本研究制备了首个IFN-γrel的单克隆抗体，为深入研究草鱼Ⅱ型干扰素的产生和生物学功能奠定基础。     

鱼类的干扰素系统：研究进展与我国学者的贡献

干扰素（interferon,IFN）是一类具有抗病毒、抗细菌和免疫调节等多种功能的细胞因子。根据其分子结构、受体、信号通路以及生物学功能等,脊椎动物IFNs被分为I型、II型、III型和IV型。鱼类属于低等脊椎动物,是脊椎动物中种类最多的一个类群,也是最早拥有完善且复杂IFN系统的脊椎动物,是研究IFN系统组成、功能和演化的重要对象。根据系统发育关系,鱼类I型IFNs被分成8个亚群,分别为IFNa–IFNf以及IFNh和IFNi。不同亚群可选择性利用不同的受体复合物,通过保守的JAK/STAT信号通路诱导干扰素诱导基因（interferon stimulated genes, ISGs）的表达,从而发挥抗病毒等功能。鱼类II型IFNs有2个成员,即IFN-γ和IFN-γrel,它们可分别利用CRFB13/CRFB6和CRFB17受体,通过STAT1传递信号。目前,在硬骨鱼类中还未鉴定到III型IFNs,但软骨鱼类中已鉴定到了III型IFNs及其受体亚基。IV型IFN是我国学者近期在鱼类和原始哺乳动物中鉴定到的一类新IFN基因,具有显著的抗病毒功能,受体由CRFB12和CRFB4组成。...     

黑头软口鲦上皮瘤细胞ifn-1基因的表达及抗病毒活性

为了体外表达黑头软口鲦上皮瘤细胞(EPC)I型干扰素(IFN-1),本实验通过RTPCR从EPC中扩增ifn-1基因,构建重组表达质粒pET-32a-IFN-1,并转化到感受态细胞Transetta(DE3),体外纯化后检测其抗病毒活性。结果显示,ifn-1编码区大小为552 bp,编码184个氨基酸,与草鱼干扰素1(CiIFN1)亲缘关系最近。通过SDS-PAGE分析,重组表达质粒pET-32a-IFN-1在宿主菌中可明显表达约35 ku的融合蛋白条带,且部分呈可溶性表达,进而通过亲和纯化可溶性重组IFN-1(rIFN-1),免疫新西兰大白兔获得效价较高的抗IFN-1多克隆抗体,可用于检测细胞内源性的IFN-1。定量PCR显示rIFN-1与EPC细胞孵育可以诱导抗病毒蛋白Mx1的表达,并抑制鲤春病毒血症病毒(SVCV)引起的细胞病变(CPE)及SVCV的复制,表明rIFN-1具有抗病毒活性。     

斑石鲷irf3基因鉴定及其在虹彩病毒感染下的表达模式分析

干扰素调节因子（irf3）是干扰素调节因子（IRF）家族的一员,是I型干扰素依赖性免疫反应的主要转录调节因子,在针对DNA和RNA病毒的先天免疫反应中发挥重要作用。本研究中,斑石鲷irf3基因（Oplegnathus punctatus interferon regulatory factors 3,Opirf3）来自实验室斑石鲷基因组数据库,经分析鉴定Opirf3的CDS序列全长1362 bp,可编码453个氨基酸,预测其蛋白分子量为50.0 kDa,理论等电点为4.97,有一个IRF结构域和一个IRF-3结构域。荧光定量分析显示,Opirf3在斑石鲷肝脏、鳃、心脏、皮肤、脾脏、肠、脑、肾、胃和头肾组织均有表达;虹彩病毒感染7 d时,免疫组织肝、脾和肾脏中Opirf3的表达水平显著上调。斑石鲷肾细胞系体外刺激实验显示,不同浓度poly I:C刺激后,Opirf3的表达量较对照组均显著升高,poly I:C浓度为100 μg/mL时,肾细胞中Opirf3的相对表达水平升高,为对照组的86.8倍。siRNA干扰后,斑石鲷肾细胞系中Opirf3表达水平显著下调30%,下游基因IFN-α、CD40、CD80和IL-1β显著下调,IL-6显著上调。以上结果可能表明Opirf3基因参与了I型IFN在斑石鲷抗虹彩病毒过程中的先天免疫反应。本研究可为斑石鲷抗病分子育种提供理论依据。     

干扰素-Tau的生物活性及研究进展

干扰素-Tau(IFN-τ)作为从反刍动物体内发现的一种新型干扰素,具有抗黄体溶解、免疫调节、低细胞毒性等生物学功能,特别是对反转录病毒抑制的高度特异性。IFN-τ在胚胎滋养层细胞中表达,无需病毒诱导;该文对IFN—τ的结构、生物功能及研究进展一一作了描述。     

鸡α干扰素基因的原核和真核表达载体的构建及鉴定

目的:为了构建鸡α干扰素基因真核和原核表达载体。方法:参照Genebank中发表的鸡源α干扰素基因进行密码子优化后,人工合成α干扰素基因片段489 bp,成功构建了干扰素基因克隆载体p MD18-T-IFN-α,经双酶切后,回收获得干扰素基因,分别与原核表达载体p ET-28a和真核表达载体p GAPZαA连接,转化到大肠杆菌Ressota和毕赤酵母中,分别进行PCR、酶切和测序鉴定。结果:成功构建了原核表达载体p ET-28a-IFN-α和真核表达载体p GAPZαA-IFN-α。结论:成功构建了鸡IFN-α基因的真核和原核表达载体,为鸡IFN-α干扰素的抗病毒活性研究提供了基础。     

水产科学研究中被忽视的II型错误

显著性检验利用样本信息来判断对总体所做假设的合理性,检验结果可能犯2类错误,即I型错误和Ⅱ型错误(分别为弃真错误和纳伪错误)。随着水产科学研究的不断规范与深入,显著性检验方法的使用越来越频繁。在国内6个水产期刊近5年(2011年1月–2015年4月)发表的3 829篇学术文章中,使用了显著性检验方法的有2 235篇,占到58.4%。然而,这些显著性检验均只关注了I型错误,完全忽略了对Ⅱ型错误的分析。事实上,Ⅱ型错误并非不重要,犯该错误的概率也往往会大于I型错误,而且有时其带来的危害比I型错误更加严重。在水产科学研究中同样如此,对Ⅱ型错误的忽视,很可能导致管理失误,从而引起渔业资源衰退。本研究对国内外水产科学研究中Ⅱ型错误分析的应用进行了总结,阐明了国内水产科学研究中有关Ⅱ型错误分析缺失的现状;通过实例,简要介绍了犯Ⅱ型错误概率β(或检验效能power=1–β)的计算方法;分析阐述了影响检验效能的几个主要因素与β之间的关系;针对Ⅱ型错误分析,探讨今后水产科学研究与管理中需要注意的问题,并对其未来发展进行了展望。     

日本鳗鲡Ⅱ型干扰素基因(IFN-γ和IFN-γrel)的原核表达与纯化研究

分别以日本鳗鲡(Anguilla japonica)pMD19-T-IFNγ和pMD19-T-IFN-γrel重组克隆质粒为模板,采用PCR方法扩增日本鳗鲡IFN-γ和IFN-γrel基因,而后分别将IFN-γ和IFN-γrel成熟肽的编码序列克隆至原核表达载体pQE30和pET32a上,成功构建了重组表达载体pQE30-IFN-γ和pET32a-IFN-γrel。将重组表达载体pQE30-IFN-γ和pET32a-IFN-γrel分别转化入Escherichia coli M15和Escherichia coli BL21感受态细胞进行表达,并优化IPTG诱导表达体系后用SDS-PAGE电泳鉴定IFN-γ与IFN-γrel重组蛋白表达形式。IFN-γ与IFN-γrel重组蛋白经镍柱纯化后进行SDS-PAGE电泳检测和Western blot鉴定。结果显示,重组表达载体pQE30-IFN-γ与pET32a-IFN-γrel分别在E.coli M15和E.coli BL21中得以正确表达。重组IFN-γ蛋白分子量为21 kD左右,表达的融合蛋白以可溶性形式存在;重组IFN-γrel蛋白分子量为31 kD左右,以包涵体形式存在。且两者均在1.0 mmol·L~(-1) IPTG诱导6 h时表达量最高。经镍柱纯化和Western blot检测,成功获得高纯度的IFN-γ和IFN-γrel重组蛋白。建立了日本鳗鲡IFN-γ和IFN-γrel基因的原核表达系统,为进一步研究日本鳗鲡干扰素系统的功能及调控机制奠定了基础。     

斜带石斑鱼IFN-γ基因的克隆与表达分析

IFN-γ在天然免疫和适应性免疫应答中均发挥着重要的作用。由于低等脊椎动物IFN-γ与哺乳动物IFN-γ相似性非常低,硬骨鱼类的IFN-γ近年来才得到鉴定。本研究报道了斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)的IFN-γ基因,并对其表达进行了分析。斜带石斑鱼IFN-γcDNA全长为867 bp,编码200个氨基酸。其基因组全长为5 104 bp,由4个外显子、3个内含子组成。氨基酸序列比对显示斜带石斑鱼IFN-γ与高等脊椎动物IFN-γ的序列相似性较低,仅为32.5%～39%,与其他硬骨鱼类的IFN-γ相似性为38.0%～68.5%。序列分析结果显示,斜带石斑鱼IFN-γ分子C末端中存在IFN-γ的特征序列以及核定位基序。二级结构分析结果显示斜带石斑鱼IFN-γ序列中包含6个α螺旋结构,其排列与高等脊椎动物的IFN-γ类似。应用荧光定量PCR检测了IFN-γ基因在Poly I:C诱导后的表达变化。发现在肾、脾、鳃、头肾、皮肤和胸腺组织中,Poly I:C能显著诱导IFN-γ的表达,在胸腺中上调倍数最高,其次为头肾、脾、肾、皮肤和鳃,而在脑和心脏组织中没有显著变化。据此推测,IFN-γ在斜带石斑鱼抵抗病毒感染的过程中起有十分重要的作用。     

蛋白激酶R启动子的研究概况

PKR是干扰素诱导的、并在干扰素抗病毒过程中起重要作用的蛋白激酶,目前对PKR及其启动子的研究多集中于哺乳类的报道.人、小鼠PKR启动子含有干扰素激活效应元件（ISRE）、激酶保守序列（KCS）、负调控结构域（NRD）、γ-干扰素激活序列（GAS）及一些转录因子结合位点.研究表明：Ⅰ型干扰素诱导PKR转录需要ISRE元件,而KCS元件对PKR本底以及干扰素诱导转录活性至关重要,同时,KCS是一个组成型的启动子元件,与ISRE协同发挥作用.负调控结构域（NRD）通过一种依赖于KCS的机制影响PKR转录.     

防治口蹄疫等于防治七种病

<正>1977年世界口蹄疫中心公布口蹄疫病毒有7个血清型(A型、O型、C型、SAT型(南非)I型、SAT(南非)Ⅱ型,SAT(南非)Ⅲ型及Asia(亚洲)I型)。由于流行年代久、分布范围广,已经衍化出二三十个血清型,每个血清型又有很多亚型,目前已知至少有近百个亚     

微卫星DNA鉴别克隆香鱼

实验应用微卫星DNA检测技术，分析了I至Ⅶ组共42尾香鱼的Pal-1*和Pal-2*两个基因座位的基因型。结果显示Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅶ组共22尾在两个基因座位上均为纯合，是基因型完全相同的克隆鱼，并且Ⅶ组l0尾为人工诱导成功的雌核发育二倍体，而I为混入本克隆的其它类型的香鱼；V组9尾为I与海产香鱼的子代；Ⅵ组10尾为Ⅱ或Ⅲ与海产香鱼的子代。     

海湾扇贝消化系统粘液细胞的类型与分布

采用组织化学方法，AB—PAS染色，对人工养殖的1龄海湾扇贝(Argopecten irradians，壳长35—40mm)进行显微观察，发现海湾扇贝唇瓣、口唇、胃、肠、直肠、晶杆囊和肝脏中均有粘液细胞分布，其中，内唇瓣的内表皮和外唇瓣的外表皮粘液细胞数量较多，其中Ⅱ型(AB—PAS染色呈蓝色)最多，Ⅳ型(蓝紫色)次之，Ⅲ型(紫红色)较少，I型(红色)极少；内唇瓣的外表皮和外唇瓣的内表皮粘液细胞仅在每一横褶的皱褶处集中分布，多为Ⅱ型，另有少量Ⅳ型。口唇粘液细胞较多，排列比较紧密，Ⅱ型最多，Ⅳ型次之。胃粘液细胞数量很少，均为Ⅱ型。肠粘液细胞(Ⅱ型)较多，在肠上皮细胞较薄的区域分布密集。直肠粘液细胞(Ⅱ型)较多。晶杆囊粘液细胞(Ⅱ型)仅分布于局部。粘液细胞(Ⅱ型)在肝脏仅有少量分布于输出管壁和外上皮中。     

黄斑篮子鱼消化道组织学和组织化学研究

采用HE和AB—PAS染色方法分别从组织学和组织化学方面对黄斑篮子鱼（Siganus oramin）消化道进行了研究。结果显示,黄斑篮子鱼口小,口咽腔不宽阔。上颌具细长、尖锐齿,下颌齿短,排列紧密。犁骨、腭骨和舌上无齿。鳃耙齿分叉,食道细长,胃部稍膨大,“V”型,幽门盲囊5～6条,肠长比为2．73。胃腺发达,为管状腺体,开口于胃小凹。幽门部粘膜褶高度降低,褶皱上开始出现类似肠绒毛结构。前肠均分布有许多长条形粘膜褶,空泡状杯状细胞丰富。依据AB—PAS的染色结果将该鱼}肖化道的粘液细胞分为4种类型：I型呈红色,Ⅱ型呈蓝色,Ⅲ型呈紫红色,Ⅳ型呈蓝紫色。食道以Ⅱ型和Ⅲ型为主,胃、肠道和幽门盲囊主要以Ⅱ型和Ⅳ型为主,后肠中Ⅱ型〉III型〉IV型,其中中肠和后肠Ⅱ型占总粘液细胞的比率最大。     

鲢鱼鳞片胶原蛋白的提取

利用酸和酶提取法,从淡水鲢鱼鳞片中提取酸溶性和酶溶性胶原蛋白.经紫外光谱分析显示,所提取的胶原蛋白与I型胶原蛋白标准品接近.氨基酸组成分析表明,ASC和PSC是典型的Ⅰ型胶原蛋白.     

鲢鱼鳞片胶原蛋白的提取

利用酸和酶提取法,从淡水鲢鱼鳞片中提取酸溶性和酶溶性胶原蛋白.经紫外光谱分析显示,所提取的胶原蛋白与I型胶原蛋白标准品接近.氨基酸组成分析表明,ASC和PSC是典型的Ⅰ型胶原蛋白.     

中华鲟幼鱼摄食生物学和人工饲料问题↑（*）

本文用行为学和养殖试验及扫描和透射电镜观察研究T中华鲟(Acipenser sinensis Gray)幼鱼撮食行为、皮肤感觉器官和人工饲料问题。结果表明，中华鲟幼鱼通过不停游动，以吸吮方式撮食底质上的食物，利用皮肤感觉对食物进行识别。吻部腹面存在大量的罗伦氏囊和少量I型或Ⅱ型味蕾     

草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型VP6蛋白多克隆抗体制备及其特异性分析

为了制备高效的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型VP6蛋白多克隆抗体并对其特异性进行鉴定,实验以草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型HZ08株为模板,采用PCR方法扩增S9基因,将该S9基因与p ET-32a(+)载体连接构建p ET-32a-S9原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)后用IPTG诱导表达;纯化后的重组VP6蛋白免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,使用间接ELISA方法测定抗体效价,Western blot和IFA试验鉴定抗VP6蛋白多克隆抗体特异性。结果显示草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型的S9基因在原核表达载体中能够正确地表达VP6蛋白,纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备的抗VP6多克隆抗体,经间接ELISA方法测定其效价约为1∶105,Western blot和IFA试验结果显示制备的多克隆抗体能特异性识别GCRVⅡ型毒株,而不能识别GCRV I型、Ⅲ型以及其它病毒,表明该多克隆抗体具有较高的特异性。研究表明制备的抗VP6蛋白多克隆抗体能够特异性识别GCRVⅡ型病毒,为GCRVⅡ型病原学研究及草鱼出血病临床诊断奠定基础。     

犬a干扰素的基因工程研究进展

干扰素是由脊椎动物细胞产生的一类分泌型蛋白,是由"干扰素诱生剂"诱使动物机体有关细胞所产生的一类特殊"糖蛋白"。这类糖蛋白从其产生细胞产生和释放出来后,又可作用于动物机体的同种其他细胞,并使这些细胞获得相当广泛的"免疫力",具有广谱抗病毒、抗肿瘤、抑制细胞增殖以及提高免疫功能等作用。干扰素可与细     

鸽Ⅰ型副粘病毒病的防治

<正>鸽I型副粘病毒病俗称鸽瘟、鸽新城疫,是由鸽I型副粘病毒感染引起的鸽的一种急性传染病,具有发病快,发病率和死亡率高等特点,以病鸽出现拉稀、扭头为特征症状。1病原鸽I型副粘病毒(PPMV-1),为副粘病毒科成员,同鸡新城疫病毒同属于禽副粘病毒I型(PMV-1)。目前,鸽I型副粘病毒(PPMV-1)可分为3个类型,第一种为对鸽致病而对鸡不致病的鸽强毒株、中强毒株或弱毒株,是引