低盐胁迫下松江鲈HSPB1、HSPB7和HSPB11基因的表达变化规律

为了探究小分子热休克蛋白基因HSPB1、HSPB7和HSPB11在松江鲈(Trachidermus fasciatus)应对低盐胁迫过程中的调节作用,本研究基于前期转录组数据,获取3个目标基因的序列信息并进行了系统进化分析,利用实时荧光定量PCR技术检测了3个基因在两种低盐胁迫处理下不同时间点(0 h、12 h、24 h和48 h)在鳃、肠、肾和肝组织中的表达水平。系统进化分析结果表明, HSPB1、HSPB7和HSPB11基因分别聚类形成独立分支;在各基因分支中,松江鲈与已报道的鲈形目、鲤形目和鳉形目等鱼种共同聚为硬骨鱼类分支。在两种低盐胁迫处理下, 3个基因在鳃组织中的表达量均在12h显著升高,而在肠、肾和肝组织中的表达量则呈现不同的变化趋势。肠组织中,HSPB7和HSPB11在盐度渐变低盐胁迫(盐度变化速率1.1/h)下表达量均显著升高, HSPB1表达量在48 h显著降低;盐度骤变低盐胁迫(盐度变化速率27/h)下HSPB1和HSPB7表达量在24 h显著升高, HSPB11表达量显著降低。肾组织中,HSPB1、HSPB7和HSPB11表达量均仅在盐度渐变低盐胁迫24h显著升高;盐度骤变低盐胁迫下HSPB1表达量显著降低, HSPB7和HSPB11表达量则显著升高。肝组织中, HSPB7无表达; HSPB1表达量在盐度渐变低盐胁迫下无显著变化,但在盐度骤变低盐胁迫下则显著升高;HSPB11表达量在两种处理下均显著升高。本研究比较分析了HSPB1、HSPB7和HSPB11基因在松江鲈应对不同低盐胁迫时表达变化规律的异同,相关结果为探讨小分子热休克蛋白在鱼类应激调节过程中的作用及洄游性鱼类适应盐度变化的分子调控机制提供了理论依据。     

低盐胁迫对刺参 4 个盐度调节相关基因表达丰度的影响

从刺参(Apostichopus japonicus)低盐转录组数据库中选取与应激(热休克蛋白70基因)和离子传递(甘氨酸转运蛋白基因、锌转运蛋白基因、神经乙酰胆碱受体基因)相关的4个差异表达基因,利用qRT-PCR技术分析这4个基因在不同组织中的表达水平及低盐对其表达丰度的影响.结果表明甘氨酸转运蛋白基因在刺参呼吸树中表达水平最高,肠次之,体腔液表达较低;锌指蛋白基因和神经乙酰胆碱受体基因均在体腔液中表达最高,肠次之,在呼吸树中不表达;热休克蛋白70基因在体腔液中表达量最高,其次是呼吸树和肠组织.低盐胁迫下这4种基因的表达量均随着胁迫时间的延长呈波动性增减,其中甘氨酸转运蛋白在体腔液中的表达低于正常表达水平,在胁迫后3h时达到最低表达量.神经乙酰胆碱受体基因除在体腔液中48 h出现明显的上调外,在体腔液其他时间点和肠组织中处于下调表达状态.低盐胁迫下这4个基因表达丰度的变化,说明这些基因或作为功能蛋白直接参与机体的代谢调节,或作为调控蛋白调节胁迫功能蛋白的表达和活性来提高刺参对低盐胁迫的耐受能力.研究结果可为刺参盐度调节适应机制的研究奠定基础.     

低盐胁迫对刺参存活、摄食和生长的影响

采用实验生态学的方法设置包括自然海水在内的4个盐度组,分别为31(自然海水,对照组A)、26(B组)、22(C组)、18(D组)。按逐步降盐(DG)与盐度突变(DS)两种盐度变化模式对各组刺参进行盐度胁迫实验。结果表明,B组仅个别较小个体出现死亡现象,C组和D组刺参个体的DG与DS实验组的成活率均出现显著差异(P<0.05),DS-D组的成活率最低,仅为45.67%。不同盐度胁迫的各实验组之间,摄食率与食物转化率存在显著差异(P<0.05);而各实验组内,DG处理和DS处理的刺参个体的FR和FCR差异均未见显著(P>0.05)。B组内的两种降盐方式在降盐后的前10d生长有显著差异(P<0.05),之后20d内差异不显著(P>0.05)。C组和D组的刺参个体在实验中均出现体重负增长,与其余各组的SGR差异显著(P<0.05)。     

低盐胁迫下松江鲈ATP1A3和ATP2B1基因的表达变化规律

为了探究Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶在松江鲈(Trachidermus fasciatus)应对低盐胁迫过程中的调节作用,本研究基于前期转录组数据,获取目标基因ATP1A3 (Na+/K+-ATP酶α3亚基基因)和ATP2B1 (Ca2+-ATP酶1基因)的序列信息并进行了系统进化分析。利用实时荧光定量PCR技术检测了松江鲈的鳃、肠、肾脏和肝脏组织中2个基因在2种低盐胁迫处理(盐度渐变处理,盐度变化速率为1.1/h;盐度骤变处理,盐度变化速率为27/h)下,不同时间点(0 h、12 h、24 h和48 h)的表达水平。系统进化分析结果表明,ATP1A3和ATP2B1基因分别聚类形成独立分支;在各基因分支中,松江鲈与已报道的鲈形目和鲽形目等鱼类共同聚在硬骨鱼类分支中。在2种低盐胁迫处理下,2个基因在鳃、肠、肾脏和肝脏组织中的表达量呈现不同的变化趋势。鳃组织中ATP1A3表达量在盐度渐变处理下先上升后下降,ATP2B1表达量仅在24 h显著升高;盐度骤变处理下,ATP1A3表达量显著下降,ATP2B1表达量显著上升。2种盐度渐变处理下,肠组织中ATP1A3表达量均在24 h显著下降;ATP2B1表达量在盐度渐变处理下显著上升,盐度骤变处理下在24 h显著上升。在盐度渐变处理下,肾脏组织中2个基因的表达量均在24 h显著上升至最大值;ATP1A3表达量在盐度骤变处理下显著上升,ATP2B1表达量在12 h和48 h显著上升。肝脏组织中2个基因的表达量在盐度渐变处理下均无显著变化;盐度骤变处理下,ATP1A3表达量持续显著上升,ATP2B1表达量在48 h显著上升。结果表明,低盐胁迫处理显著影响了ATP1A3和ATP2B1基因的表达水平,但2个基因的表达量变化规律存在显著性差异。上述结果为探讨Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶在鱼类渗透压调节过程中的作用及洄游性鱼类适应盐度变化的分子调控机制提供了理论依据。     

急性盐度胁迫对施氏鲟的皮质醇、代谢反应及渗透调节的影响

以淡水组为对照,通过对施氏鲟(Acipenser schrenckii)幼鱼96 h的急性盐度(15和22)胁迫试验,研究了幼鱼对水体盐度突变的血浆皮质醇和代谢反应,并探讨了施氏鲟适应环境盐度变化的渗透调节机理.结果表明,盐度胁迫导致幼鱼的血浆皮质醇、血糖及乳酸浓度呈现不同程度的升高,随后各项指标逐渐下降,并分别于24、48、96 h时基本恢复至正常(对照组)水平.盐度15组的血浆皮质醇、血糖及乳酸浓度分别在胁迫5、24和48 h时达峰值,而盐度22组则分别在0.5、24和24 h时即达峰值,且胁迫后0.5 h时的皮质醇浓度、12 h时的血糖及12～48 h时的乳酸浓度均显著高于盐度15处理组(P＜0.05);各处理组的Na+浓度随着盐度的升高及时间的延长而升高,而Cl-浓度在15和22盐度组中匀先升高后降低,血浆K+浓度在盐度组(15和22)与对照组之间无显著性差异(P＞0.05).盐度突变导致血浆渗透压升高,并在24 h达最大值,胁迫12 h和24 h时22盐度组幼鱼血浆渗透压的浓度显著高于15盐度组(P＜0.05).15和22盐度组的Na+/K+-ATP酶活性变化趋势基本一致,均在12 h时达最高值,随后下降,但在12～96 h内均处于较高的水平,且均显著高于对照组(P＜0.05).结果提示,盐度突变可在第一时间内导致施氏鲟血浆皮质醇浓度显著升高,而血糖及乳酸的变化则明显滞后于皮质醇的变化,且通过对幼鱼血浆中皮质醇、血糖及乳酸浓度变化的分析,发现通过机体的生理调整,至96 h时施氏鲟幼鱼对水体盐度突变有了较好的适应性.     

三疣梭子蟹PtDNMT1基因的克隆及其 在低盐适应中的表达分析

甲基转移酶是维持基因组甲基化状态的重要基因，本研究利用SMART-RACE技术克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)甲基转移酶基因(PtDNMT1)。PtDNMT1基因cDNA序列全长5919 bp，包括4832 bp的开放阅读框，编码1610个氨基酸，预测分子量为148.15 kDa，理论等电点为4.68。结构预测发现，PtDNMT1有2个特殊的结构域，分别是锌指结构域(zf-CXXC)和甲基转移酶家族特有的Dcm结构域。进化树分析显示，PtDNMT1基因与昆虫类的DNMT基因聚为一支。组织表达分析发现，PtDNMT1基因在肝胰腺、鳃、卵巢、肌肉、胃、心脏、血液中均有表达，其中在肝胰腺中表达最高，卵巢和鳃次之。进一步研究了低盐胁迫后PtDNMT1基因在鳃、肝胰腺和肌肉组织中的表达变化规律为胁迫6 h时鳃组织中PtDNMT1基因的表达即达到峰值(5.3倍)，并一直持续到12 h (4倍)，随后逐步下降，在72 h时仍显著高于对照组(2.3倍)；PtDNMT1基因在肝胰腺中的表达规律类似于鳃，然而其达到峰值的时间稍晚于鳃(24 h)，且上调倍数高于鳃(8倍)；低盐胁迫后PtDNMT1基因在肌肉中的表达最初呈现下调趋势，之后(24 h)上调表达至峰值(2.2倍)，且一直上调表达至72 h。本研究首次克隆了PtDNMT1基因，根据其在各组织中的表达分布特征以及盐度胁迫后的表达变化情况，推测DNA甲基化在三疣梭子蟹低盐适应中发挥了重要作用。     

Cd对凡纳滨对虾血细胞活性氧含量(ROS)、细胞凋亡率及应激反应基因表达的影响

为探讨镉(Cd)对虾类血细胞的免疫毒性, 以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为研究对象, 设置 0 mg/L 对照组和 10.5 mg/L Cd 处理组, 利用流式细胞仪检测血细胞中的活性氧含量(ROS)和细胞凋亡率, 并利用实时荧光定量 PCR 技术检测血细胞中抗氧化酶(Cu-Zn SOD、CAT 和 GPx)、金属硫蛋白(MT)、热休克蛋白(HSP60、HSP70 和 HSP90)以及 caspase-3 基因的表达量变化。结果显示, 与对照组相比, Cd 胁迫导致血细胞 ROS 含量在胁迫后 3~48 h 极显著升高(P<0.01), 在 24 h 达到最大值; 细胞凋亡率在 3 h 达到最大值 87.99 %(P<0.01), 在 12~48 h 显著升高 (P<0.05); Cu-Zn SOD 和 HSP60 基因表达水平分别在 3~48 h 和 12~48 h 显著升高(P<0.05); GPx 基因表达量在 12 h 和 48 h 显著上调(P<0.05); CAT、MT、HSP60 和 HSP90 的基因表达水平在胁迫 3 h 显著下降(P<0.05), 在胁迫后期显著升高(P<0.05); HSP70 表达量在 3~24 h 无显著变化(P>0.05), 在 48 h 显著上升(P<0.05); caspase-3 基因表达水平在 12~24 h 显著上升(P<0.05)。综上所述, Cd 诱导血细胞产生过量 ROS, 影响应激反应基因的表达水平, 最终促进细胞凋亡。     

温度和盐度对红刺参(Apostichopus japonicus)耗氧率与排氨率的影响

采用室内实验生态学方法,研究了不同温度(7、12、17、22、27℃)、盐度(23、26、29、32、35、38)对两种体重S组(1.68–3.48 g)和L组(15.78–20.79 g)红刺参(Apostichopus japonicus)耗氧率(OCR)和排氨率(AER)的影响。结果显示,温度对红刺参OCR和AER均有极显著影响(P<0.01);体重对红刺参OCR无显著影响(P>0.05),而对AER有极显著影响(P<0.01)。温度和体重交互作用对红刺参OCR和AER有极显著影响(P<0.01)。S组红刺参的OCR和AER随温度的升高而增加;L组红刺参OCR和AER均随温度的升高而升高,而在22℃有所降低后又升高。盐度、体重对红刺参OCR和AER均有显著影响(P<0.05)。盐度和体重交互作用对红刺参OCR和AER均无显著影响(P>0.05)。S组和L组红刺参的OCR和AER均随盐度的升高而呈M形变化,在盐度为29和32时较低,而在盐度为26和35时较高。红刺参OCR和AER与体重呈负相关的幂函数方程R = aW b。不同温度下S组和L组红刺参O : N范围分别为4.75–11.74和10.71–15.52;不同盐度S组和L组红刺参O : N范围分别为6.37–12.29和8.24–12.10。综上所述,L组红刺参对高温的耐受能力较S组弱;S组和L组红刺参对低盐和高盐的耐受性较差,其最适盐度范围为29–32。     

脊尾白虾对低盐胁迫响应的转录组学分析

转录组测序可在各种环境条件下对物种进行高通量测序,通过基因结构分析和功能注释,探讨特定条件下相关基因的功能和表达情况。该研究分别获取低盐胁迫组(盐度0.2)和自然海水组(盐度31)脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)样品,通过Illumina平台进行转录组测序,获得13.92 Gb高质量测序数据,组装得到111 618条转录本和72 734条Unigenes,其中有22 879条Unigenes得到注释,比对到Nr数据库的Unigenes为21 931条;筛选出1 492条脊尾白虾低盐胁迫差异显著表达基因,包括829条上调基因和663条下调基因,其中有810条差异表达基因得到注释。通过差异表达基因GO功能注释和富集分析及KEGG通路富集分析,锁定大量脊尾白虾在自然海水和淡水环境下的差异表达基因,为深入探讨脊尾白虾在低盐胁迫条件下的生理保护机制提供了技术支撑。     

刺参体内RNA干扰方法的初步研究

以刺参溶菌酶基因(lysozyme gene,LYZ)为靶基因探索构建刺参体内RNA干扰体系。构建了3个刺参溶菌酶基因特异性的RNA干扰重组质粒,以刺参体腔液原代培养细胞为靶细胞进行筛选;分别以口腔注射和腹腔注射的方式以及不同的注射剂量对刺参LYZ进行体内RNA干扰,并运用qPCR技术测定刺参LYZ的表达量;最后,对刺参LYZ进行体内RNA干扰,并分别运用qPCR技术和比浊法测定刺参LYZ的表达量及其酶活性。结果显示:3种RNA干扰重组质粒的沉默效率分别为40%、45%、0%;体腔注射RNA干扰重组质粒时,各组织中LYZ的表达量均出现了显著的上升(P0.05),而从口腔注射时,体腔液和肌肉中LYZ的表达量均出现极为显著的下降(P0.01),而在管足中未出现明显变化;当其注射剂量为0.5μg和5μg时未对LYZ的表达产生有效的抑制作用;当注射剂量为10μg和25μg时,刺参体内LYZ的表达受到了明显抑制,但是注射剂量为25μg时,部分刺参个体出现吐肠现象;在转染12h后,刺参体腔液、肌肉、体壁、疣足和管足组织中LYZ的表达量开始下降,到第四天后开始回升。表明:只有从口腔注射RNA干扰重组质粒且注射剂量达到10μg时才能有效地抑制靶基因的表达;刺参体内RNA干扰具有系统性,可以在各个组织间相互传导。     

慢性氨氮胁迫对刺参摄食与消化酶活性的影响

以刺参(Apostichopus japonicas Selenka)为研究对象,探讨氨氮胁迫浓度为0 mg/L、2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L、10 mg/L时14 d内刺参摄食情况与消化道内3种不同消化酶活性变化。刺参规格分别为小[S,体重(15.13±0.02)g]、中[M,体重(28.42±0.32)g]、大[L,体重(60.14±0.88)g]。结果显示:(1)随着氨氮浓度的升高,实验刺参存活与生长逐渐与对照组出现显著差异。当氨氮浓度高于2 mg/L时,刺参末体重与特定生长率随氨氮浓度升高有显著下降趋势;当氨氮浓度为8~10 mg/L时,3种不同规格刺参均出现了吐肠、化皮,直至死亡,氨氮浓度为10 mg/L时中规格刺参存活率最低,为81.3%。(2)当氨氮浓度低于10 mg/L时,氨氮胁迫对3种规格刺参摄食率(FR)影响差异不显著,而全部实验组的食物转化率(FCE)均显著低于对照(P0.05)。(3)氨氮胁迫对3种不同规格刺参消化酶活性的影响存在差异。随氨氮浓度升高,蛋白酶活性呈降低趋势,氨氮浓度8 mg/L和10 mg/L时全部实验组刺参蛋白酶活性显著低于对照(P0.05);脂肪酶和淀粉酶活性随氨氮浓度升高呈先升后降趋势,在2 mg/L时出现峰值;当氨氮浓度为6 mg/L时,小规格刺参的消化道淀粉酶活性降低到0.30 U/mg(prot),与对照出现显著差异(P0.05);当氨氮浓度从6 mg/L到8 mg/L时,3种规格刺参脂肪酶活性发生急剧变化,显著低于对照(P0.05),中规格刺参在同一氨氮浓度胁迫下的消化酶活性变化显著高于其他规格。研究表明,氨氮胁迫会对刺参摄食、消化与生长产生不利影响,在氨氮浓度4 mg/L以下刺参消化酶活性短期可被显著诱导上调,高氨氮浓度对消化酶活性起抑制效应并可导致生理紊乱,此响应存在体重规格上的差异。     

Large‐scale mortality and limited expression of heat shock proteins of aestivating sea cucumbers Apostichopus japonicus after acute salinity decrease

This study deals with the mortality and related physiological responses of aestivating sea cucumber Apostichopus japonicus to acute salinity decrease. Aestivating and active sea cucumbers were exposed to a decrease in salinity (from 30 to 20 psu) at a rate of 2.5 psu every 6 h, and then maintained at 20 psu for 96 h. The mortality of aestivating sea cucumbers was ~30%, which was significantly higher than that of active sea cucumbers (~10%). This result indicated that sea cucumbers in aestivation were more susceptible to hypo‐salinity stress. To elucidate the underlying physiological mechanisms, the osmotic pressure in coelomic fluid and the levels of hsp70 and hsp90 mRNA in aestivating and active sea cucumbers were measured. No significant difference in osmoregulation was observed between the two groups. The osmotic pressure of coelomic fluid in both groups changed with decrease in ambient salinity. There were significant differences in the time course and magnitude of hsp70 and hsp90 expression between the two groups. After exposure to decreased salinity, aestivating sea cucumbers showed a delayed up‐regulation of hsp70 and hsp90 expression compared with animals in active state, and these levels decreased rapidly to control values. The expression of hsp70 and hsp90 in aestivating sea cucumbers were significantly lower than those in active sea cucumbers after salinity change. The differences in hsp70 and hsp90 expression between the states may partly explain the higher mortality of sea cucumbers in aestivation when exposed to low salinity.     

低盐和高盐环境下刺参选育品系生长与摄食性能研究

为评价刺参(Apostichopus japonicus)耐盐品系选育效果,以G4、G5代刺参耐盐选育品系为研究对象,研究了其在低盐度和高盐度环境下的生长、摄食和消化生理的变化。结果显示,30 d实验期间,G4代和G5代2种规格选育刺参在不同盐度环境中的生长情况相似,在低盐环境中的末体重随着实验盐度的降低而下降,在高盐环境中的末体重均随着实验盐度升高而下降;G4代盐度35实验组的特定生长率(SGR)为(0.82±0.06)%/d,摄食率(FR)为(3.54±0.26)%,均与盐度31对照组无显著差异(P>0.05),G5代实验组刺参呈现相似规律。在盐度为18~31时,G4和G5代的不同规格选育刺参蛋白酶活力随着设置盐度的降低而下降,最低值为G5代盐度18小规格刺参实验组的1.55 U/mg prot;在盐度31~39范围内,各实验组刺参蛋白酶活力随着设置盐度的升高呈降低趋势,但盐度35、37实验组的蛋白酶活力与盐度31对照组差异不显著(P>0.05);G4和G5代的不同规格选育刺参淀粉酶活力随着设置盐度的变化总体无太大差异;在盐度18~31范围内,G4和G5代选育刺参脂肪酶活力随着设置盐度的降低而下降,其中,盐度18和盐度22实验组脂肪酶活力显著低于盐度31对照组(P<0.05)。研究表明,选育刺参在适应生长、摄食及激活消化酶活力的盐度值范围与普通刺参具有显著差异;G4和G5代选育刺参选育性状稳定性较强,历代定向选育对刺参群体抗逆性状的遗传改良起到了积极作用。     

盐碱胁迫对尼罗罗非鱼鳃Na+/HCO3-共转运子、碳酸酐酶基因表达的影响

为了探讨盐碱胁迫条件下鱼类渗透生理调节机制,以尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)为实验材料, PCR扩增得到了Na⁺/HCO₃^-共转运子(NBCe1)基因cDNA部分序列,比较了单盐(盐度10、盐度15)、单碱(1.5 g/L、3 g/L NaHCO₃)、盐碱混合(盐度10,碱度1.5 g/L;盐度15,碱度3 g/L)胁迫后不同时间(0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h)血清渗透压、离子浓度(Na⁺、K⁺、Cl^-、Ca²⁺)以及鳃碳酸酐酶(CA)活性、CA与NBCe1基因mRNA表达变化。结果显示,不同胁迫条件下,血清渗透压、离子浓度、鳃组织CA酶活、CA与NBCe1基因mRNA表达变化均与胁迫强度呈正相关。随时间推移,血清渗透压、离子浓度呈现先上升后下降的变化趋势,单盐、盐碱混合组血清渗透压值较单碱组高。单盐、单碱、盐碱混合组中, NBCe1基因mRNA在鳃中均呈略微上调,但不显著(P>0.05)。单碱组和盐碱混合组鳃CA活性较单盐组高,低盐碱胁迫(盐度10,碱度1.5 g/L)下CA活性较晚达最高值;不同胁迫条件下, CA基因mRNA表达均表现上调,单碱、盐碱混合组更为显著(P<0.05),推测CA较NBCe1对体内HCO₃^-转运作用更为显著。研究结果为尼罗罗非鱼盐碱适应生理调节提供了基础资料。     

三疣梭子蟹心激肽基因克隆及在低盐适应中的功能验证

采用RACE技术克隆获得三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)心激肽(CCAP)基因。该基因全长606 bp, 5￠端非编码区72bp,3￠端非编码区108bp,开放阅读框426bp,编码141个氨基酸,预测分子量15.6kD,理论等电点9.55。同源性分析表明,三疣梭子蟹CCAP与拟穴青蟹(Scylla paramamosain)和蓝蟹(Callinectes sapidus)的CCAP同源性较高,分别为85%和82%。系统进化树分析显示,三疣梭子蟹与蓝蟹首先聚为一支,之后再与拟穴青蟹相聚。组织表达分析发现, CCAP基因在胸神经节中的相对表达量最高,其次是脑和眼柄组织。通过分析CCAP基因在低盐胁迫过程中的表达规律发现,低盐可显著改变CCAP在胸神经节中的表达模式,在24 h, 48 h和72 h实验组的表达量显著高于对照组(P0.05),分别为对照组的1.73, 2.16和2.19倍。体外注射CCAP多肽可降低三疣梭子蟹在低盐条件下的死亡率,并诱发钠钾ATP酶(Na~+/K~+-ATPase)和V型ATP酶(V-ATPase)酶活力显著提高。本实验结果暗示CCAP通过调控Na~+/K~+-ATPase和V-ATPase活力以达到盐度适应的作用。     

pH胁迫对刺参存活、生长及抗氧化酶活性的影响

本研究比较分析了在对照组(pH为8.4)、低pH胁迫组(pH为6.8、7.0、7.2、7.4、7.6和7.8)和高pH胁迫组(pH为8.6、8.8、9.0、9.2、9.4和9.6)的养殖水环境下,胁迫36 d对刺参(Apostichopus japonicus Selenka)存活、生长及抗氧化酶活性的影响。结果显示,不同pH对刺参存活、生长及抗氧化酶活性有显著影响。在pH 7.4~9.0范围内,刺参存活率为100%,随着pH胁迫强度和胁迫时间的增加,刺参存活率逐渐降低,当pH为6.8、7.0和9.6时,自第3天起,刺参处于过度应激状态,继而有死亡个体出现,至30 d时刺参死亡率为100%。不同pH显著影响刺参生长,刺参特定生长率随pH胁迫程度增加呈下降趋势,当pH为9.0时,刺参出现负增长。各pH胁迫组刺参超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性均高于对照组,且随pH胁迫程度的增加呈先升高后下降的变化趋势。在低pH组中,以pH=7.4时刺参SOD和CAT活性最高,分别达到(74.92±2.24)U/ml和(14.99±2.38)U/ml,显著高于对照组;而在高pH组中,SOD和CAT活性分别以pH 8.8和9.0时最高,分别达到(72.90±1.10)U/ml和(15.68±0.89)U/ml,显著高于对照组。结果表明,pH在7.4~9.0范围内是刺参存活与生长的适宜水环境,过高或过低均会引起刺参不同程度的应激反应,进而导致刺参的死亡。     

牙鲆趋化因子基因CXCL9的克隆、鉴定与表达分析

趋化因子是一类具有化学趋化功能的小分子分泌性蛋白,能够引导白细胞到损伤或者感染的部位,参与免疫调节和病理反应。为丰富鲆鲽鱼类趋化因子的相关基础研究,本研究克隆了牙鲆(Paralichthys olivaceus)趋化因子基因CXCL9,其全长为910 bp,开放阅读框为408 bp,编码135个氨基酸。该基因具有趋化因子超家族的典型特征,在35、37、60和77个氨基酸位置具有4个保守的半胱氨酸残基,形成两个二硫键。氨基酸序列分析表明,该基因与大菱鲆(Scophthalmus maximus)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的CXCL9基因具有较高的同源性,分别为78.5%和71.0%。实时荧光定量PCR结果显示, CXCL9在正常牙鲆肝脏和脾脏中的表达量非常高,在皮肤和鳃等组织中表达量次之,说明CXCL9特异性地在免疫相关组织中表达。经迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染后,牙鲆肝脏中CXCL9 mRNA表达量在感染后6 h即出现高峰值,而头肾和脾脏中的高峰值出现较晚。经鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后6 h,牙鲆肝脏中CXCL9 mRNA的表达量升高近8倍,头肾中的表达高峰值出现在感染后24 h,而脾脏中CXCL9 mRNA的表达量在感染后6 h迅速升高10倍,逐渐降低后48 h又出现高峰,为正常水平的20倍。上述研究结果说明CXCL9基因在病原菌感染过程中有快速响应,可能参与了免疫防御过程,将有可能发展为一种牙鲆细菌性疾病的生物标记。本研究为牙鲆趋化因子超家族免疫机制的深入研究奠定了基础。