长鳍吻免疫因子基因cDNA部分序列克隆及其组织表达差异

根据鲤科鱼类同源序列设计并合成了长鳍吻(Rhinogobio ventralis)应激因子HSP70、抗体IgM、抑炎性因子IL-10和促炎性因子IL-1b基因特异引物,以长鳍吻皮肤组织总RNA为模板,RT-PCR扩增获得长度分别为412、463、520和217 bp的上述4种免疫因子基因cDNA部分序列。同时通过RT-PCR比较患小瓜虫病长鳍吻和对照组长鳍吻皮肤和肠道组织中各免疫因子的表达差异,结果显示:在皮肤组织中,IgM和IL-10在感染组鱼体中表达量显著高于对照鱼(P<0.05),HSP 70和IL-1b的表达则没有差异;在肠道组织中,IgM、IL-10和IL-1b在感染组鱼体中表达量显著增高,HSP 70的表达量没有差异。本研究首次对长鳍吻的免疫因子进行了分析,指出免疫因子IgM和IL-10在鱼体中免疫应答反应中较为灵敏,为养殖过程中长鳍吻应激监测方面奠定了理论基础。     

大鳍鳠免疫球蛋白M 重链基因的克隆及表达分析

用RACE-PCR和RT-PCR方法获得大鳍鳠分泌型免疫球蛋白M(sIgM)重链基因的全长cDNA序列.大鳍鳠sIgM的cDNA全长为1 992 bp,包含5 '非编码区53 bp,3’非编码区226 bp,开放阅读框1 713,编码570个氨基酸.推测的大鳍鳠sIgM蛋白质序列可变区含有4个骨架区(FR)和3个互补决定区(CDR),恒定区(CH)含有CH1、CH2、CH3和CH4 4个部分.与其它6种硬骨鱼类IgM氨基酸序列比对分析表明,大鳍鳠sIgM存在半胱氨酸和色氨酸保守位点；其氨基酸序列与斑点叉尾鲴IgM的相似性最高,为54.3％；与石斑鱼的相似性最低,为24.6％.进化树分析表明,大鳍鳠sIgM与斑点叉尾鲴聚为一支.RT-PCR显示,大鳍鳠IgM基因主要在血细胞、脾脏、头肾和中肾中转录表达；注射嗜水气单胞菌后,血细胞、脾脏和头肾IgM重链基因转录表达量在1～10 d内有显著上升.     

红鳍东方鲀3个白介素基因的序列特征及表达分析

本试验分析体质量(190.34±2.13)g的红鳍东方鲀白介素基因IL-1b、IL-8和IL-10的序列特征,检测其在红鳍东方鲀脑、鳃、心脏、肌肉、肝脏和脾脏中的表达,以及每尾红鳍东方鲀注射密度1×10^7 cfu/mL的哈维氏弧菌菌液0.1 mL后0、12、24、48 h在肝脏和脾脏中的表达。试验结果表明,IL-1b、IL-8和IL-10基因的序列全长分别为771、822 bp和844 bp。3个基因在健康成鱼脑、鳃、心脏、肌肉、肝脏、脾脏中均有表达,其中肝脏和脾脏表达显著(P<0.05)。感染哈维氏弧菌后12 h,IL-1b基因在肝脏中显著上调,12 h和48 h在脾脏中显著升高(P<0.05)。感染哈维氏弧菌后12 h和24 h IL-8基因在肝脏和脾脏中均显著上调(P<0.05);而感染后24 h和48 h IL-10基因在肝脏中显著升高,在脾脏中12 h和48 h显著升高(P<0.05)。笔者首次探讨红鳍东方鲀IL-1b、IL-8和IL-10基因的序列特性及表达特征,为研究3个基因的原核表达提供了试验信息,将为进一步深入探究重组蛋白活性及其在红鳍东方鲀健康养殖中的应用奠定基础。     

大鳍鳠IL-1β基因cDNA克隆及表达分析

白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)作为炎症反应的关键介导物,通过开启基因的表达来调控免疫反应。为了丰富鱼类该基因的研究,实验采用RT-PCR和RACE-PCR技术,首次从鲇形目鱼类大鳍鳠中获得IL-1β基因cDNA的全序列。大鳍鳠IL-1β基因cDNA全长1 194 bp,包括3'非编码区域(UTR)为224 bp,5'UTR为82 bp,开放阅读框(ORF)为888 bp,编码296个氨基酸。预测的蛋白质分子量为33.843 43 ku,等电点为5.00。与斑点叉尾等其他8种脊椎动物进行同源性分析发现,大鳍鳠IL-1β氨基酸序列与斑点叉尾相似性最高,为79.0%,与原鸡的相似性最低,为22.0%。进化树分析表明,大鳍鳠IL-1β与斑点叉尾聚为一支。半定量PCR显示,大鳍鳠IL-1β基因在肌肉、脑、脾脏、头肾、体肾、胃、皮肤、肝脏及肠等组织中都有不同程度的表达;经嗜水气单胞菌刺激后大鳍鳠IL-1β基因在头肾和脾脏的转录表达显示,1 d后该基因在头肾与脾脏中的表达量都达到最大,15 d后恢复到刺激前的水平。研究显示,大鳍鳠IL-1β在抵御病原感染过程中发挥重要作用。     

长江上游长鳍吻鮈群体线粒体控制区遗传多样性分析

分析长鳍吻鮈群体遗传结构和遗传多样性,为研究过度捕捞、水电开发等人类活动对长鳍吻鮈的长期生态学效应及其物种适应机制提供基础数据,同时也为该物种保护策略的制定和调整提供科学数据支持。2014和2015年,于长江上游干流江津、宜宾、皎平渡和格里坪采集长鳍吻鮈,利用线粒体控制区序列的特异性引物,通过PCR扩增以及序列测定,获得125份长鳍吻鮈线粒体控制区序列。结果表明:125尾长鳍吻鮈样品共检测到多态位点25个,单倍型30种,平均单倍型多样性指数(Hd)和核苷酸多样性指数(Pi)分别为0.785和0.00140;中性检验(Tajima's D为-1.97524,P0.05;Fu's Fs为-31.374,P=0.000)和序列错配分布结果表明,长江上游长鳍吻鮈历史上经历过"遗传瓶颈"和种群扩张;分子方差分析(AMOVA)结果表明,群体间的遗传变异绝大部分来源于群体内部(99.07%),群体间无显著遗传分化(Fst=0.00933,P0.05);单倍型网络、Kinura 2-Parameter遗传距离和平均基因流均显示,4个长鳍吻鮈群体间存在广泛的基因交流,群体间无遗传分化。各群体间没有显著遗传分化,基因交流频繁,可将长江上游长鳍吻鮈作为单一的进化显著单元(ESU)进行管理。     

大鳍鳠 IL-1β基因cDNA克隆及表达分析

白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)作为炎症反应的关键介导物,通过开启基因的表达来调控免疫反应。为了丰富鱼类该基因的研究,实验采用RT-PCR和RACE-PCR技术,首次从鲇形目鱼类大鳍鳠中获得IL-1β基因cDNA的全序列。大鳍鳠IL-1β基因cDNA全长1 194 bp,包括3’非编码区域(UTR)为224 bp,5’UTR为82 bp,开放阅读框(ORF)为888 bp,编码296个氨基酸。预测的蛋白质分子量为33.843 43 ku,等电点为5.00。与斑点叉尾等其他8种脊椎动物进行同源性分析发现,大鳍鳠IL-1β氨基酸序列与斑点叉尾相似性最高,为79.0%,与原鸡的相似性最低,为22.0%。进化树分析表明,大鳍鳠IL-1β与斑点叉尾聚为一支。半定量PCR显示,大鳍鳠IL-1β基因在肌肉、脑、脾脏、头肾、体肾、胃、皮肤、肝脏及肠等组织中都有不同程度的表达;经嗜水气单胞菌刺激后大鳍鳠IL-1β基因在头肾和脾脏的转录表达显示,1 d后该基因在头肾与脾脏中的表达量都达到最大,15 d后恢复到刺激前的水平。研究显示,大鳍鳠IL-1β在抵御病原感染过程中发挥重要作用。     

急性低盐胁迫下红鳍东方鲀幼鱼IgM、NKCC1和Hsp70基因的表达

为探讨红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)耐低盐的分子机制,以自然海水组为对照,利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术,分析红鳍东方鲀幼鱼在盐度16、12、8和4胁迫下,鳃和肾中免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)、钠钾氯协同转运蛋白1(Na-K-Cl cotransporter 1,NKCC1)和热休克蛋白70(heat shock protein 70,Hsp70)3个基因的表达情况。结果表明,3个基因在鳃和肾中均有表达,IgM和Hsp70基因在鳃和肾中的表达量均无显著性差异(P0.05),而NKCC1基因在鳃中的表达量显著高于肾(P0.05)。同一盐度下,随着时间的增加,鳃中IgM基因的表达量大致呈现先降低后升高的趋势,肾中则呈现先降低后升高再趋于平稳的趋势;同一时间内,鳃中低盐度组与对照组的IgM基因表达量差异比肾中差异更为明显。在鳃中,相同时间内NKCC1基因在各低盐度组的表达量低于对照组,尤其在6h和72h两个时间点时显著低于对照组(P0.05);肾中各时间点的表达量基本都高于0h表达量。在相同时间内,3h、6h、24h、72h的各低盐度组,在鳃中,Hsp70基因的表达量均与同一时间对照组之间差异明显(P0.05);在肾中,从6h开始,各低盐组与对照组之间差异性显著(P0.05)。以上结果表明,红鳍东方鲀幼鱼IgM、NKCC1、Hsp70 3个基因的表达量在不同盐度不同时间下存在差异,由此推测这3个基因对红鳍东方鲀幼鱼的渗透压调节起重要作用。     

草鱼HSP70基因cDNA部分序列克隆及其组织表达差异

根据鲤热休克蛋白70(Heat shock protein,HSP70)序列(AY120894)设计并合成一对引物,以草鱼(Cteno-pharyngodon idella)肝胰脏组织总RNA为模板,RT-PCR扩增获得草鱼HSP70基因cDNA部分序列,并进行了组织表达差异性研究。结果显示:所获为序列为480 bp,获得GeneBank登陆号为FJ483832。序列测序结果显示,HSP70扩增序列与鲤、斑马鱼、鲋的同源性为:93%、91%、93%。另外,所获序列HSP70在草鱼脂肪、肌肉、肠、脑、粘液、性腺、鳔、肝胰脏、心脏、脾脏、鳃、鳍12个组织的表达存在差异,HSP70在草鱼这12个组织中均检测到表达,其中在鳍中表达最高,极显著高于其他组织(P<0.01);在鳔中表达次之,且与脑、心脏、性腺中表达差异不显著;在粘液中表达最低。     

Gln对中华鳖免疫应激后肝脏.脾脏及肠道HSP70表达的影响

本试验通过研究谷氨酰胺/脂多糖（Gln/LPS）对中华鳖肝脏、脾脏和肠道组织热应激蛋白HSP70表达的影响，考察Gln对中华鳖免疫应激的保护作用与其诱导组织HSP70表达的关系。试验选择体重接近的健康中华鳖24只，随机分为4组，分别腹腔注射0.7%Nacl、500 ugLPS/kgBW、100 mgGln/kgBW和500 ugLPS+100 mgGln/kgBW。采用免疫组化法检测中华鳖肝脏、肠道和脾脏中HSP70的表达，放射免疫法测定血浆皮质醇（COR）含量。结果表明：腹腔注射500 μgLPS/kgBW显著增强了中华鳖肝脏和脾脏组织HSP70的表达（P<0.05），而补充100 mgGln/kg BW抑制了中华鳖肠道、肝脏和脾脏组织HSP70的表达。推测Gln对免疫应激中华鳖的保护作用与其诱导机体组织HSP70的表达无关。     

黄鳍鲷白细胞介素1β基因2种表达载体的构建

根据黄鳍鲷白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)基因全长cDNA序列(GenBank登录号为AY669059)设计、合成1对特异性引物,扩增编码黄鳍鲷IL-1β基因前体肽的基因序列,通过T-A克隆构建了克隆载体pMD18T-IL1β。以克隆载体pMD18T-IL1β为模板,以设计合成的带酶切位点的引物分别扩增黄鳍鲷IL-1β的前体肽和预测的成熟肽基因序列,经BamHI和SalI双酶切后将其插入表达载体pQE30中,构建了原核表达质粒pQE30-pIL1β和pQE30-mIL1β。经酶切、PCR鉴定并最终通过序列测定表明,基因已正确插入到载体的多克隆位点,序列和读码框都正确无误,为黄鳍鲷IL-1β基因的体外重组表达研究打下了基础。     

盐度、pH对文蛤肌肉、鳃、外套膜HSP70基因表达的影响

为探讨池塘养殖文蛤的适宜盐度和pH范围,以β-actin为内参基因,采用实时荧光定量聚合酶链式反应技术,检测不同盐度(16、18、20、22、24)和pH(6.7、7.7、8.7、9.7、10.7)梯度下文蛤肌肉、鳃、外套膜中HSP70基因mRNA的表达水平。结果显示,盐度16、18、22、24处理组肌肉中HSP70基因的表达量显著高于盐度20的对照组(P0.05);除盐度18组鳃和盐度24组外套膜HSP70基因的表达量与对照组差异不显著外(P0.05),16、18、22、24盐度组鳃和外套膜中HSP70基因的表达量均显著高于对照组(P0.05)。pH 6.7、7.7、9.7、10.7处理组肌肉、鳃、外套膜中HSP70基因的表达量与pH为8.7的对照组差异显著(P0.05)。试验结果表明,超出一定盐度、pH范围,可显著诱导文蛤肌肉、鳃、外套膜中HSP70基因的过量表达,研究结果可为池塘文蛤的健康养殖提供参考。     

Modulation of antioxidant defense and immune response in zebra fish (<Emphasis Type="Italic">Danio rerio</Emphasis>) using dietary sodium propionate

The present study explores the effect of dietary sodium propionate on mucosal immune response and expression of antioxidant enzyme genes in zebra fish (Danio rerio). Six hundred healthy zebra fish (0.42 ± 0.06 g) supplied, randomly stocked in 12 aquariums and fed on basal diets supplemented with different levels of sodium propionate [0 (control), 5, 10 and 20 g kg^?1] for 8 weeks. At the end of the feeding trial, mucosal immune parameters (TNF-α, IL-1β, Lyz), antioxidant enzyme (SOD, CAT) as well as heat shock protein 70 (HSP70) gene expression were measured. The results revealed feeding on sodium propionate significantly up-regulated inflammatory response genes (TNF-α, IL-1β, Lyz) in a dose-dependent manner (P < 0.05). However, antioxidant enzyme genes significantly down-regulated in the treated group compared with control (P < 0.05). Also, HSP70 gene expression was higher in the liver of fish fed the basal diet and deceased with elevation of sodium propionate levels in the diet. These results showed beneficial effects of dietary sodium propionate on mucosal immune response as well as the antioxidant defense of zebra fish.     

拥挤胁迫对已接种疫苗的大菱鲆部分免疫和应激指标的影响

通过对3个养殖初始密度(低、中、高密度组分别为5、10、20 kg/m~2)的大菱鲆(Scophthalmus maximus)接种减毒迟缓爱德华氏菌疫苗,观察其血液、脾脏、头肾、鳃和皮肤中部分免疫和应激指标的变化规律,研究经接种疫苗操作后大菱鲆应对拥挤胁迫的应激响应。结果显示,低密度养殖的白细胞介素(1L-1β)、补体(C3)、免疫球蛋白M(IgM)、溶菌酶(LZM)和肿瘤坏死因子(TNF-α)等免疫指标显著高于中、高密度组(P0.05),高密度组血液中皮质醇的含量高于中、低密度组(P0.05);通过基因表达分析发现,高密度组的热休克蛋白(HSP70)表达量显著高于中、低密度组;低密度组的免疫球蛋白M(IGM)表达量高于中、高密度组。研究表明,为提高大菱鲆的免疫效果、减少应激反应,可以采用低密度(5 kg/m~2)养殖。     

鳜IRAK4基因的克隆、组织表达及病毒感染后表达分析

为了研究鳜IRAK4生物学特性及其在抗病毒免疫应答中的作用,根据鳜转录组数据中筛选出的IRAK4 unigene序列设计引物,利用SMART-RACE技术克隆得到CDS全长为1389 bp的c DNA(命名为Sc IRAK),编码462个氨基酸,含有1个N端死亡结构域和1个保守的中央蛋白激酶结构域。采用荧光定量RT-PCR方法分析了Sc IRAK4在健康鳜各组织中的表达差异及病毒感染后在脾脏中的表达变化,结果显示,健康鳜中Sc IRAK4在肝脏中表达量最大,与其他组织差异显著,而在血液、脑和胃中表达量最低;传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)感染鳜后Sc IRAK4的表达量呈现下调趋势,24 h脾脏中的表达量达到最低,为对照组的45%;而鳜弹状病毒(siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)感染鳜后Sc IRAK4的表达量呈现上调趋势,12 h脾脏中Sc IRAK4的表达量达到最高,为对照组的8.17倍,表明Sc IRAK4在抗ISKNV和SCRV的免疫应答中可能发挥不同的作用。本研究为进一步揭示Sc IRAK4的抗病毒免疫反应机制提供了依据。     

初探母源免疫处理草鱼母本及其子代5种免疫因子含量的周年变化规律

为探究草鱼母源免疫因子传递特性,本实验借助ELISA和qPCR技术分别检测分析了GCRV弱毒疫苗免疫草鱼母本及其子代（即母源免疫子代）早期胚胎阶段至一龄期间5种免疫因子（IgM、C3、LZM、MBL和Bf）蛋白活性和基因表达水平的周年变化规律。结果显示,草鱼母本经GCRV弱毒疫苗免疫后,血液中5种免疫因子蛋白活性及基因表达水平在产卵期均显著高于对照组1.5倍以上,至免疫后第11个月与对照组无显著差异。母源免疫子代发育至水花（4 d）时,IgM、C3、MBL和Bf的基因表达水平均高于对照组;发育至乌仔（15 d）时,IgM、C3和Bf的蛋白活性水平均略高于对照组;发育至5~11月龄时,5种免疫因子在肝脏、脾脏、肾脏和头肾等免疫器官中仍存在高表达。研究表明,GCRV弱毒疫苗促使母源免疫因子在亲本和子代体内富集表达具有一定的时效性,最长可维持至11个月,为实际生产中草鱼母本疫苗免疫程序的制定提供参考依据。     

pH、氨氮胁迫对中国对虾HSP90基因表达的影响

研究了pH、氨氮胁迫对中国对虾Fenneropenaeus chinensis血细胞、肝胰腺、鳃和肌肉组织HSP90基因时空表达的影响.分别将中国对虾暴露于pH7.0、9.0的水体中148h和不同氨氮浓度的水体中96h,结果表明,pH（7.0,9.0）胁迫条件下中国对虾鳃、肌肉和血细胞HSP90基因表达均上调,肝胰腺HSP90基因表达对两种pH胁迫差异明显：pH7.0胁迫条件下,HSP90基因表达3h达峰值后明显降低;pH 9.0胁迫时,HSP90基因表达水平逐渐升高,整个胁迫过程中均显著高于对照组（P＜0.05）,说明中国对虾肝胰腺组织是高pH胁迫的响应器官.6mg/L氨氮浓度组鳃和肌肉组织HSP90基因表达水平24h达最高值,分别为对照组的5.46和1.55倍;各胁迫组肝胰腺和血细胞HSP90基因表达水平分别于6h和48h达到最高值,为对照组的1.33～2.08倍和2.20～5.45倍.肝胰腺组织对氨氮胁迫表现敏感,短时间内（6h）通过上调HSP90基因表达水平保护细胞;鳃组织HSP90基因表达波动范围最大,说明鳃组织需要更高表达量的HSP90保护细胞.当氨氮浓度持续48～96h维持在2～6mg/L,各组织HSP90基因表达水平显著降低.     

热应激对大正三色锦鲤非特异性免疫指标及HSP70基因表达的影响

为探讨锦鲤的抗逆机理,在实验室条件下研究了持续热应激对大正三色锦鲤非特异性免疫指标及HSP70基因相对表达量的影响。分别于应激前、应激后2、6、10、14、18、22、26 h进行取样测定呼吸爆发、补体蛋白3(C3)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)以及热休克蛋白70(HSP70)基因的相对表达量。结果发现,热应激后呼吸爆发降低,在应激后2、10、18～26h降低显著(P<0.05);热应激2 h后血清中C3含量略有上升,应激6～26 h过程中与应激前相比均下降,应激14～22 h显著地下降(P<0.05);热应激下血清中SOD有上升的趋势,但差异不显著(P>0.05);热应激下,血清中MDA浓度升高,应激10～18 h上升显著(P<0.05);应激后2、26 h HSP70基因的相对表达量与应激前相比显著性地上升了5.93倍、2倍(P<0.05),应激后6～22 h HSP70基因的相对表达量与应激前水平无显著性差异(P>0.05)。结果表明,热应激影响锦鲤非特性免疫指标,降低锦鲤非特异性免疫力;HSP70的表达受热应激调节,热应激下诱导合成的HSP70对锦鲤起到一定的应激保护作用。     

重组tHsp70对罗非鱼腹腔巨噬细胞免疫功能的影响

利用酵母分泌表达的重组罗非鱼热休克蛋白70(heat shock protein 70 of tilapia,tHsp70),与海豚链球菌(Streptococcus iniae)抗原在体外非共价结合形成tHsp70-抗原复合物,通过对体外培养的腹腔巨噬细胞NO释放水平、吞噬活性及免疫相关基因表达进行检测,研究tHsp70对罗非鱼细胞免疫功能的影响。结果显示,tHsp70在体外能够与海豚链球菌菌体、胞外分泌物(extracellular bacteria products,ECP)结合形成tHsp70-抗原复合物;tHsp70-抗原复合物和tHsp70均可显著增强罗非鱼腹腔巨噬细胞的贴壁和生长、NO释放及吞噬活性(P<0.01),而ECP单独作用可引起腹腔巨噬细胞死亡,显著降低腹腔巨噬细胞NO释放(P<0.05),但tHsp70与ECP体外非共价结合后可减轻ECP对巨噬细胞的损伤;tHsp70-抗原复合物和tHsp70作用于腹腔巨噬细胞,白细胞介素8(IL-8),热休克蛋白70(HSP70),CXC趋化因子受体4(CXCR4)和颗粒蛋白前体(PGRN)4个基因的表达量均显著高于海豚链球菌抗原单独刺激和无刺激对照组(P<0.01)。研究表明tHsp70具有免疫增强和免疫佐剂的功能,为开发罗非鱼链球菌病Hsp70-肽疫苗提供了实验依据。     

GCRV弱毒疫苗免疫草鱼母本的免疫因子代间传递与表达特性

为探究GCRV弱毒疫苗母源性免疫的草鱼母本及其子代免疫因子(IgM、C3、LSZ)表达特性及代间传递效应,采用ELISA、Rt-q PCR等方法检测了草鱼母本产前40 d接种疫苗后,母本血液、子代早期发育阶段及2月龄幼鱼3种免疫因子的蛋白活性及基因表达水平。结果显示,经GCRV弱毒疫苗免疫的草鱼母本血液、早期胚胎及幼鱼阶段IgM蛋白活性均显著高于对照组样品。子代各阶段中,28日龄的夏花样品IgM蛋白活性水平最高,而5日龄水花样品中蛋白活性最低;从受精卵发育至3日龄水花阶段,实验组样品免疫因子C3和LSZ的蛋白活性均显著高于对照组;2组鱼中IgM、C3和LSZ蛋白的活性水平随着发育进行,总体上呈先下降后升高的趋势,从卵细胞至3日龄水花阶段实验组样品C3和LSZ蛋白活性水平均显著高于对照组。实验组和对照组受精卵IgM基因的表达水平差异最大,实验组表达量为对照组的3.4倍。从24 h器官形成期至3日龄水花样品中,实验组C3基因的表达水平显著高于对照组。从卵细胞至3 h囊胚期阶段,实验组LSZ基因表达水平显著高于对照组。实验组2月龄草鱼体肾、头肾、脾脏组织中IgM基因表达量均显著高于对照组;感染GCRV病毒后,实验组死亡尾数(2尾)低于对照组死亡尾数(5尾)。研究表明母源性免疫可在草鱼进行代间传递,并对子代起到一定程度的免疫保护作用。