虾夷扇贝EST-SSR标记在栉孔扇贝中的通用性研究

为研究虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)和栉孔扇贝(Chlamys farreri)的群体遗传多样性并分析其亲缘关系,对在虾夷扇贝中开发的60个EST-SSR位点在栉孔扇贝中的通用性进行了研究。结果显示,21个位点可在栉孔扇贝中扩增出特异性条带,通用性比例达35.00%,其中,17个位点具有多态性,多态性比例达28.33%。在虾夷扇贝和栉孔扇贝群体中,平均等位基因数(N_a)分别为2.7647和2.3529;平均有效等位基因数(N_e)分别为1.9487和1.6350;平均观测杂合度(H_o)为0.6314和0.3333;平均期望杂合度(H_e)为0.4569和0.3139;平均多态信息含量(PIC)为0.3726和0.2597;Nei's(1973)基因多样性指数(I)分别为0.4493和0.3087;Shannon信息指数分别为0.7176和0.5041;固定指数(F_(is))检测发现,7个位点偏离了Hardy-Weinberg平衡;遗传分化系数(F_(st))为0.2398。本研究开发的21对通用性EST-SSR标记,为进一步开展虾夷扇贝和栉孔扇贝遗传多样性分析、分子辅助育种、基因发掘和种质资源评价奠定了基础。     

栉孔扇贝♀×虾夷扇贝♂杂交子一代与其双亲同工酶的比较研究

采用不连续垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳法,对栉孔扇贝(Chlamys farreri)♀、虾夷扇贝(Pa-tinopecten yessoensis)♂及其杂交子一代的ADH、MDH、SDH、IDH、ME和SOD共6种同工酶的酶谱进行分析,以探讨双亲遗传物质在杂交子代中的表达情况及杂交子代基因的表达特征。结果表明,杂交子代的同工酶酶谱与母本栉孔扇贝的相似,而与父本虾夷扇贝的明显不同,说明父本虾夷扇贝的同工酶在杂交子代中没有表达。幼虫阶段的同工酶酶谱亦表明,父本虾夷扇贝的同工酶在杂交子代的幼虫阶段仍然没有表达。另外,在对母本栉孔扇贝群体和杂交子代群体的同工酶酶谱进行比较研究时发现,在杂交子代中出现了一定比例的杂合子,因此不能确定杂交子代是由雌核发育而来。     

基于线粒体12S rDNA序列分析岩扇贝与国内主要经济扇贝的亲缘关系

应用PCR扩增和测序技术获得了引进种岩扇贝(Crassadoma gigantea)及我国主要经济扇贝:虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)、栉孔扇贝(Chlamys farreri)和海湾扇贝(Argopecten irradians)的12SrDNA全序列,并进行了相关分析。结果表明,四种扇贝12SrDNA的序列长度在906~964bp之间,其A+T含量在50.57%~56.77%之间;单倍型数、多态性位点数、单倍型多样性指数、核苷酸多样性指数和平均核苷酸差异数分别在2~3、2~3、0.264~0.623、0.000 75~0.002 07和0.427~1.882之间,均表现出较低的遗传多样性水平;种间遗传距离在0.079~0.306之间,其中虾夷扇贝与栉孔扇贝的遗传距离最近,其次是岩扇贝与虾夷扇贝,而岩扇贝与海湾扇贝的遗传距离最远,并且系统进化树分析结果显示虾夷扇贝先与栉孔扇贝聚为一支,再与岩扇贝进行聚类,而海湾扇贝则与其它扇贝聚为另一个单系群,进一步阐明了四种扇贝间的亲缘关系。     

3种扇贝遗传结构的RAPD分析

用RAPD方法对扇贝科中的虾夷扇贝、海湾扇贝和栉孔扇贝的基因组DNA的特异性遗传标记进行分析,筛选了43个随机引物,有13个引物获得了片段长度在250～2000 bp之间且重复性良好的谱带,每个引物分别获得了4～17个大小不等的片段,共获得了170个扩增片段,其中12个引物得到特异性片段58个,可以将两种或者3种扇贝区别开来。通过Popgene 3.2分析软件包统计表明,虾夷扇贝与海湾扇贝的遗传距离最大,为0.2481;栉孔扇贝与海湾扇贝的遗传距离次之,为0.2161;虾夷扇贝和栉孔扇贝遗传距离最小,其值为0.2133。根据遗传距离指数,用MEGA3统计软件中的UPGMA方法进行聚类分析,构建系统树。     

栉孔扇贝（♀）×虾夷扇贝（♂）杂交子代胚后发育过程中遗传构成变化研究

采用RAPD和GISH技术对栉孔扇贝（♀）和虾夷扇贝（♂）杂交子代胚后发育4个重要时期（担轮幼虫期、D形幼虫期、壳顶幼虫期和眼点幼虫期）的遗传构成进行了检测。在RAPD检测中,50条随机引物在亲贝中共扩增出35条栉孔扇贝的特异条带和28条虾夷扇贝特异条带,其中栉孔扇贝特异条带在杂交子代4个时期出现的条数分别为：担轮幼虫期21条、D形幼虫期19条、壳顶幼虫期23条和眼点幼虫期23条;而虾夷扇贝特异条带在杂交子代4个时期出现的条数分别为：17、16、1和1。GISH结果表明,杂交扇贝在担轮幼虫期和D形幼虫期均继承了来自父母本遗传物质,而在壳顶幼虫期和眼点幼虫期未检测到来自父本的遗传物质。结果表明,杂交子代遗传结构在进入壳顶幼虫期时发生重大改变,大部分父本遗传物质从杂交贝基因组中丧失。     

两种壳色虾夷扇贝的RAPD分析

采用RAPD技术对两种壳色虾夷扇贝Patinopecten yessoensis的遗传多样性和遗传结构及其分化进行研究。用筛选出的22个随机引物对白色贝和褐色贝各40个个体进行RAPD扩增，进行群体内及群体间的遗传学分析。白色贝共检测出128个多态位点，多态位点的比例为79．5％，Shannon遗传多样性指数为0．424；褐色贝共检测出127个多态位点，多态位点的比例为78．9％，Shannon遗传多样性指数为0．423。白色贝和褐色贝之间的遗传相似性指数和遗传距离为0．961和0．039，二者之间的遗传分化指数Gst为0．052，遗传分化的程度较低。结果表明，白色贝和褐色贝之间的等位基因频率、多态位点的比例和遗传多样性等的差别不明显，遗传变异主要来自于群体内。S285—1在褐色贝大部分个体中都能获得扩增片段，但在白色贝所有个体中均未见这个位点的扩增片段，推断S285—1为白色贝的特异阴性片段。     

栉孔扇贝和虾夷扇贝杂交子代的GlSH鉴定及其免疫学特性

以栉孔扇贝[Chlamys farreri(Jones etPreston)](♀)和虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)(♂)杂交子代担轮幼虫为材料，分别用栉孔扇贝和虾夷扇贝基因组作探针，采用基因组荧光原位杂交(GISH)的方法，对杂交后代杂交子的确切身份进行初步鉴定。结果表明，子代分别继承了双亲各     

栉孔扇贝和虾夷扇贝杂交子代的GISH鉴定及其免疫学特性

以栉孔扇贝[Chlamys farreri（Jones et Preston）]（♀）和虾夷扇贝（Patinopecten yessoensis）（♂）杂交子代担轮幼虫为材料，分别用栉孔扇贝和虾夷扇贝基因组作探针，采用基因组荧光原位杂交（GISH）的方法，对杂交后代杂交子的确切身份进行初步鉴定。结果表明，子代分别继承了双亲各一套染色体（n=19），为真正的杂交种。为了解杂交扇贝的免疫学特性，在自然海域栉孔扇贝大规模死亡的情况下，分别对杂交扇贝及其亲本3个扇贝群体血细胞的胞内活性氧含量（ROIs）、血清凝集素效价（HA）、溶菌酶活力（LSZ）、抑菌活力、酚氧化酶活性（P0）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）以及酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（ALP）等9种非特异性免疫学指标进行测定。结果表明，栉孔扇贝除ROIs、SOD、ACP等3个指标显著低于虾夷扇贝外（P〈0．01），其他6种指标均高于虾夷扇贝，且除血清凝集素效价外均达显著水平（P〈0．05）。在杂交子代中，上述免疫指标除SOD活性低于低值亲本外（P〉0．6），其余8种免疫指标均介于双亲之间。杂交子代在9种免疫指标中有8种与母本无显著性差异，而子代与父本之间9种免疫指标中有7种达显著差异（P〈0．05）。这些结果说明，杂交扇贝在非特异性免疫上存在明显的偏母性特征，这点与子代在外形特征上的偏母性相吻合。因此杂交扇贝相对于其母本在生产实践中表现出的一定程度的抗逆优势可能与非特异性免疫无明显关系。[中国水产科学，2006，13（4）：597—602]     

栉孔扇贝转录组来源单核苷酸多态性位点的多态性分析

应用高分辨率熔解曲线技术对栉孔扇贝转录组来源的单核苷酸多态性位点进行验证分型和多态性分析.根据栉孔扇贝转录组单核苷酸多态性位点序列信息,对其中150个位点设计引物和探针,在4个栉孔扇贝野生群体中进行验证分型.其中,103对引物扩增出目的产物,76个位点成功分型,58个多态位点中51个是二等位多态性单核苷酸多态性(34.0％).进一步在荣成野生群体中对51个二态单核苷酸多态性位点进行多态性验证和群体遗传学分析,其中49个位点呈现多态性,且均为二态,最小等位基因频率为0.0610～0.5000,观测杂合度和期望杂合度分别为0.0833～0.8889和0.0833～0.5833.经Boferroni校正,有2个位点(C1630S115_AG和C19848S286_CA)在该群体中偏离Hardy-Weinberg平衡.各位点之间未检测到连锁不平衡.这些多态单核苷酸多态性位点可用于栉孔扇贝连锁图谱构建、分子标记辅助育种以及数量性状的基因定位等遗传学研究.     

栉孔扇贝、虾夷扇贝及其杂交子代的MSAP分析

运用甲基化敏感扩增多态性(methylation-sensitive amplification polymorphism,MSAP)技术对栉孔扇贝(♀)、虾夷扇贝(♂)及其杂交子一代、子二代基因组DNA胞嘧啶甲基化水平进行了研究,并分析了DNA甲基化与各性状的相关性及其与杂种优势的关系。结果表明,(1)DNA甲基化率与壳宽、总重等表型值呈正相关的关系,而与壳长、壳高、软体重和闭壳肌重4个性状表型值呈负相关的关系,其中闭壳肌重与甲基化率的相关性达到极显著水平(P<0.01);(2)虾夷扇贝、栉孔扇贝、F1代、F2代的总甲基化率分别为32.79%、24.13%、19.98%、20.18%,杂交种F1代的甲基化水平低于双亲,是两种扇贝杂交的结果;F1代的甲基化模式经过了重新调整,其变化相对其亲本主要有4种类型:甲基化水平相同、去甲基化、超甲基化、次甲基化,且去甲基化位点多于超甲基化位点。结果证实杂种优势的产生与杂交种F1代基因组DNA甲基化模式的改变和重新调整有关,丰富了杂种优势机理研究内容。     

哲罗鲑(♂)与细鳞鲑(♀)属间杂交不相容现象的SSR分析

利用哲罗鲑(Hucho taimen,♂)与细鳞鲑(Brachymystaxc lenok,♀)进行属间杂交,出现了仔鱼上浮率低和畸形率高等杂交不相容现象,为探究哲罗鲑与细鳞鲑属间杂交不相容现象产生的原因,本研究采用30对微卫星引物对杂交亲本及F1进行遗传分析.结果表明:(1)30对微卫星引物中,2对在细鳞鲑中未出现扩增带,3对在哲罗鲑中未出现扩增带,其余25对在双亲中均扩增出差异条带;(2)在双亲中具有差异的25个微卫星位点中,除Omi84TUF位点在1个F1出现非亲条带外,其余位点所有条带均来自于双亲,其中21个位点完全符合孟德尔遗传规律,表明哲罗鲑与细鳞鲑属间杂交属两性融合生殖,大部分遗传物质来源于父母本双方;(3)4个位点Omi105TUF、Omi156TUF、Omi165TUF及Omy16DIAS在部分子代中出现2条母本条带或父本条带缺失现象,可能是部分亲本染色体在配对或分离过程中产生了异常,出现染色体丢失或异源加倍现象,非整倍体的较早出现可能是导致杂交不相容的直接原因;4)F1与哲罗鲑和细鳞鲑的遗传相似系数分别为0.673 5和0.729 8,遗传距离分别为0.395 3和0.315 0,表明F1与细鳞鲑亲缘关系更近,UPGMA聚类分析也支持这一观点.     

黄海区青岛近海双桩张网网囊网目选择性研究

使用套网法对黄海区青岛近海主要捕捞对象中的鹰爪虾(Trachypenaeus curvirostris)和兼捕对象白姑鱼(Argyrosomus argentatus)进行数据分析,使用Logistic曲线作为其选择性曲线模型,求得不同网目尺寸网囊对鹰爪虾和白姑鱼的体长选择性曲线,并运用极大似然估计法进行曲线参数估算,对桩张网渔具不同网目尺寸的网囊选择性进行分析.结果表明:试验网囊网目尺寸为30 mm、33 mm、40 mm时,鹰爪虾的50%选择体长L50分别为5.309 cm、5.778 cm、6.972 cm,其选择范围(SR)分别为1.091 cm、1.290 cm、1.571 cm;白姑鱼的50%选择体长L50分别为6.581 cm、6.908 cm、7.441 cm,其SR值为1.934 cm、2.144 cm、2.322 cm.随着桩张网网囊网目尺寸的增大,鹰爪虾和白姑鱼的L50随之增大,SR值也逐渐增大.针对鹰爪虾来说,33 mm规格网囊的选择性能比30 mm 和 40 mm的要好.本研究选择该海区的主要捕捞对象鹰爪虾以及兼捕量较大的白姑鱼为研究对象,旨在为合理确定适合黄海区的张网最小网日尺寸提供科学依据,以保证黄海区渔业资源的可持续利用.     

低渗诱导太平洋牡蛎三倍体以及与其他诱导方法的比较

通过低渗方法抑制受精卵第二极体(PB2)的释放,诱导太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)三倍体.在水温为23～25℃的条件下,分别采用不同低渗海水(盐度分别为4、6、8、10、12、14、16),在不同处理时机,即第1个第一极体(PB1)出现、30%的PB1出现、40%的PB1出现、50%的PB1出现以及第1个第二极体(PB2)出现时,对太平洋牡蛎受精卵进行10 min、15 min、20 min、25 min持续处理.处理后,于正常盐度海水中孵化,收集D形幼虫,通过流式细胞仪进行倍性测定,确定最佳诱导条件.结果表明,当太平洋牡蛎受精卵PB1出现40%时,在盐度为8的低渗海水中,持续处理15 min,得到最高三倍体诱导率为(89.16±1.39)%.与对照组相比,低渗诱导获得的三倍体幼虫表现出明显的生长优势.将低渗方法同高温(32℃)、低温(2℃)和6-DMAP(450μmo1/L)处理等多倍体诱导方法进行比较,结果显示,低渗组的卵裂率和孵化率显著高于高温、低温和6-DMAP诱导的太平洋牡蛎三倍体(P＜0.05).6-DMAP诱导的三倍体率虽略高于低渗诱导,但差异不显著(P＞0.05).通过综合评价指数(Ie)比较,认为低渗诱导多倍体的方法比高温、低温和6-DMAP诱导具有明显的优势.     

长江常熟溆浦段中华鲟幼鱼出现时间与数量变动

2002-2009年,依托长江渔业资源管理委员会办公室设立在长江常熟溆浦江段的渔业资源监测网(定置张网),对降河中华鲟(Acipenser sinensis)幼鱼进行了监测分析.结果表明,中华鲟幼鱼每年主要于5-7月在常熟溆浦江段出现,出现时间平均86.6 d(n=8),所采获样本(n=8)全长、体长和体质量年度平均值的变化范围分别为25.2～40.1cm、23.2～33.5em和70.7～314.8g.各年采获样本数量差异较大,从2002至2009年呈现出较明显的递减趋势,各年采获样本数量最多的旬也不一致,变化时间为5月中旬至6月下旬.从幼鲟生长来看,不同年份相同时期采获样本的规格差异较大,同一年份同一时间采获样本的规格也存在一定的差异.与三峡工程截流以前进行比较,中华鲟幼鱼在长江口出现的时间没有明显变化,但出现较高数量比例的时间由以前的6月变为5月中下旬和6月,幼鲟规格较截流前也有较大变化,推测造成这种改变的原因可能是因为人工增殖放流活动和三峡工程截流所导致的水文状况的变化.分析认为,水文状况可能是影响中华鲟幼鱼到达长江口时间的重要因素之一.     

光环境因子对循环水养殖系统中大西洋鲑生长和摄食的影响

采用正交实验法,研究了不同光色(白光,A1;蓝光,A2;红光,A3)、光周期(24L︰0D,B1;12L︰12D,B2;8L︰16D,B3)和光强(0.88 W/m2,C1;4.55 W/m2,C2;8.60 W/m2,C3)对循环水养殖系统中体质量(850.97±82.77)g的大西洋鲑(Salmo salar)生长和摄食的影响。实验设A1B1C1(1)、A1B2C2(2)、A1B3C3(3)、A2B1C2(4)、A2B2C3(5)、A2B3C1(6)、A3B1C3(7)、A3B2C1(8)、A3B3C2(9)9个处理组,在相应设定条件下饲养180 d。结果表明,在光色为红光、光周期为12L︰12D和光强8.60 W/m2条件下大西洋鲑的成活率最高,但光色、光周期和光强对成活率的影响差异不显著(P0.05);实验期间各组鱼的相对增重率和肥满度差异均不显著(P0.05);至第120天,2、5、6组鱼的体长特定生长率显著高于1组(P0.05);至第180天,1、2、4、7、8组鱼的体质量特定生长率显著高于6组(P0.05),1、2、3、4、7、8、9组鱼的日增重显著高于6组(P0.05),9组鱼的体质量变异系数显著低于7组(P0.05)。9组鱼血浆中生长激素显著高于1、2、3、4、6、7和8组(P0.05);摄食率、饲料转化效率和饲料系数最佳时的光照条件为:红光、12L︰12D、8.60 W/m2,但光色、光周期和光强对摄食率、饲料转化效率及饲料系数的影响差异不显著(P0.05)。本实验条件下,较为适宜的光照条件是:红光、12L:12D、8.60 W/m2。     

波流作用下网格锚泊的单个重力式网箱缆绳张力

以中国沿海常用的周长40 m×10 m的HDPE重力式网箱作为研究对象,采用渔具模型试验狄克生准则,选用大比例尺(λ=1/10)和小比例尺(λ′＝ 1/2)设计制作模型网箱.网箱锚泊系统采用的网格形式与实际使用的一致.模型试验于日本东京大学生产技术研究所海洋环境工程实验室风浪流水槽[50 m(L)×10 m(W)×5 ...     

鲤免疫应答相关基因的克隆与鉴定

为研究鲤(Cyprinus carpio L.)白细胞免疫应答相关的分子机理,以体外培养的鲤外周血白细胞为实验材料,用荧光标记的mRNA差异显示(FluoroDDRT-PCR)技术,研究丝裂原(50μg/mL LPS、50μg/mL PHA和50μg/mL ConA)在刺激白细胞4、12和24 h内诱导白细胞免疫应答相关基因的mRNA表达差异,共获得92个差异片段,其中87个片段有再扩增产物,再扩增率为94.6%;将差异片段克隆,经PCR鉴定,获得81个阳性克隆,鉴定率为93.1%;差异片段序列同源性功能分析结果表明,本研究共获得3个免疫应答相关的cDNA克隆,它们分别编码鲤的蛋白酶体激活因子PA28α亚基、翻译延伸因子(EF-1α)和基质金属蛋白酶13(Mmp13)部分序列,为进一步研究这些差异表达基因在鱼类免疫中的作用机制奠定了基础。     

北部湾光裸星虫3个地理群体遗传多样性

利用微卫星DNA分子标记对广东湛江乌石(ZJ)、广西北海山口(BH)与越南锦普(JP)3个光裸星虫(Sipunculus nudus)野生群体的遗传多样性进行分析。结果表明, 20个微卫星座位中有3个位点(Snu08、Snu10、Snu14)呈现单态, 17个多态微卫星座位中的等位基因数介于2～9之间, 多态信息含量(PIC)介于0.097～0.797之间。每个群体中有5个位点显著偏离了Hardy-Weinberg平衡, 在位点Snu18上3个群体均偏离Hardy-Weinberg平衡。3个光裸星虫野生群体均表现出中等程度的遗传多样性水平, 锦普群体遗传多样性水平高于北海和湛江群体。群体间F-统计量分析表明, 群体遗传分化处于低等分化水平, 差异不显著(F_st=0.019～0.049, P>0.05); 基于D_A遗传距离构建的NJ和UPGMA聚类树均显示, 地理位置相邻的群体聚在一起。研究表明, 3个光裸星虫地理群体均具有中等的遗传多样性, 杂合度均偏低, 群体间存在较大的基因流, 杂合子明显缺失; 群体间已产生遗传分化, 但分化水平还较低。     

龙须菜新品系GL 家系F1 配子体的性状分析

本研究旨在为深入构建龙须菜(Gracilaria/Gracilariopsis lemaneiformis)育种体系提供基础数据。采用DTOPSIS综合评价法对实验室构建的龙须菜GL家系的F1配子体的性状进行分析与评价,以期把F1配子体的综合性状这一模糊量化指标转化为该株系对理想解的相对接近度Ci值的量化指标,进而对各藻株的综合性状优劣进行综合分析,为未来良种的杂交以及选育提供依据。所测的100株藻体中,线性生长速率变化范围为2.0~7.3%/d,变异系数为26.79%,标准差达到1.28,各藻株之间存在明显的差异。藻株的分枝数分布很不集中,变异极为显著,其平均数为1.93个,标准差为0.8,变异系数为41.17%,差异明显,变异幅度相对很大。主枝基部直径变化范围1.4~2.2 mm,标准差达到0.18,变异系数在3个性状中最小,为9.87%。线性生长速率、分枝数、基部直径等性状分布均呈现明显的正态分布特征,标准差分析显示,各性状相对本身参数变化幅度较大,说明F1配子体存在一定的性状变异,可以挑选性状差异大的藻种进行杂交以期获得优良藻种。DTOPSIS综合评价分析显示20、47、93、6、31株系综合性状的评价值比较高,为后期人工选育优良藻种提供依据。     

马氏珠母贝选育群体4个世代的遗传变异

采用9个多态性微卫星位点分析马氏珠母贝(Pinctada fucata)壳高选育品系(JCS)4个世代的遗传多样性与遗传结构的变化。结果表明, 随着选育的进行,  4个世代每个位点的平均有效等位基因数(N_e)从2.096下降至1.435, 平均等位基因丰度(R_s)从3.556下降至 2.556, 平均观测杂合度从0.492渐次下降至0.269, 遗传多样性呈明显的下降趋势。随着选育世代的增加, 从等位基因频率的变化来看, 部分呈上升趋势, 部分呈下降趋势, 部分基本保持稳定, 其中, 一些低频基因甚至会趋于消失。在所有等位基因中, 大部分的频率呈随机变化趋势, 并在不同的世代间上下波动; HHM20- 158 bp的频率呈有规律的变化, 由中高频逐步上升至高频, 呈富集趋势。结论认为, 经过4代的选育, 马氏珠母贝选育群体遗传多样性呈降低趋势, 遗传结构趋于稳定。本研究旨在为后续的马氏珠母贝选育策略提供理论指导。