柱状黄杆菌常规PCR检测体系的建立

根据NCBI公布的柱状黄杆菌硫酸软骨素裂解酶的基因序列,设计并选取一对能够快速而准确地检测柱状黄杆菌的PCR引物,建立PCR快速检测体系,同时测试该体系的特异性和灵敏度,并对患病的鱼组织进行检测。研究结果表明,使用设计的引物能够扩增出与预计大小相符合的138bp的特异性片段,具有较好的检测特异性,对靶标DNA的检测灵敏度为pg级,对柱状黄杆菌的检测灵敏度为25cfu/20μl。样品的检测结果与实际发病情况一致,表明本研究成功建立了柱状黄杆菌常规PCR检测体系,该体系可以用于柱状黄杆菌的诊断和样品的检测。     

柱状黄杆菌间接ELISA快速检测方法的研究

应用间接酶联免疫吸附试验(Indirect-ELISA)技术,建立了快速检测柱状黄杆菌的方法。结果显示:根据棋盘试验,确定最佳抗原包被浓度和免疫血清最佳工作浓度分别为1×106cfu/mL和1∶5000,酶标抗体最佳工作浓度为1∶10000。在该条件下,所建立的间接ELISA能检测出5×104cfu/mL的柱状黄杆菌,且与爱德华氏菌、哈维氏菌弧菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌等常见鱼类致病菌无交叉反应。结果表明,所建立的间接ELISA可不经细菌培养而直接检测人工感染后草鱼鳃组织中的柱状黄杆菌,该方法对柱状黄杆菌的检测具有快速、敏感、特异、实用的优点。     

用nested—PCR方法快速检测鲑鱼肾杆菌

描述了用嵌套式聚合酶链式反应(nested PCR)快速检测鲑鱼细菌性肾病病原鲑鱼肾杆菌的方法。以BKDR和BKDF为引物,扩增鲑肾杆菌编码57kDa主要可溶性蛋白基因中501bp的DNA片段,再用引物BKDR2和BKDF2扩增其中长度为314bp的DNA片段。用其它15种常见鱼类致病菌验证这两组引物的特异性,结果没有非特异性的DNA片段被扩增出来。用酚抽提法和煮沸加冻融的方法获得的细菌裂解产物,PCR检测的灵敏度均可达到1.8×103CFU·mL-1,用Nested PCR进一步扩增PCR扩增的产物,检测灵敏度可再提高100倍。检测鲑鱼肾杆菌菌悬液与鲟卵的混合物,结果表明,该方法能准确、可靠、快速地检测鲑肾杆菌。     

软烤扇贝加工过程的细菌学研究

对软烤扇贝加工过程中物料的细菌特性和有关理化特性进行了研究,并对细菌菌群进行了定性和定量分析。结果表明,实验室加工中,水分含量和水分活度(Aw)的降低都主要发生在调味腌制、焙干过程,最终产品水分含量为42%左右,Aw为0.902±0.003。工厂加工在焙干、烤制过程水分含量和Aw的降低较多,成品水分含量为42%左右,Aw为0.910±0.007,控制良好。实验室加工pH下降主要发生在调味腌制过程,产品pH为5.83左右,工厂产品pH没有明显下降,最终pH为6.70左右,不符合标准要求。实验室加工原料菌落总数是(4.47±1.59)×102cfu/g,在调味摆盘和包装过程分别上升到(1.35±0.83)×103cfu/g、(7.30±0.53)×102cfu/g,在焙干、烤制过程分别下降到(5.43±0.67)×102cfu/g、(2.90±0.75)×102cfu/g,二次杀菌冷却后产品菌落总数均小于300 cfu/g。工厂加工原料菌落总数为(9.08±0.20)×103cfu/g,焙干过程上升至(4.69±0.10)×105cfu/g,烤制过程下降到(1.12±0.40)×104cfu/g,包装过程上升至(2.58±0.20)×106cfu/g。二次杀菌冷却后3个产品中,有1个产品细菌总数为340 cfu/g,不符合企业标准要求。实验室烤制冷却后样品的主要菌群为芽孢杆菌,但仍含有小比例的葡萄球菌。二次杀菌冷却后,样品中仅残存芽孢杆菌,无球菌。工厂二次杀菌冷却后样品中主要菌群为芽孢杆菌,但仍含有相当数量的球菌,比例接近1/3,表明其生产过程不良,产品质量安全存在一定的问题。     

罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)幼体病原肠杆菌PCR检测技术的建立与应用

根据罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)幼体培育期主要细菌性病原阴沟肠杆菌omp A基因序列、产气肠杆菌gry B基因序列设计特异性引物,通过对PCR扩增产物进行测序鉴定与特异性和敏感性试验,建立了两种病原菌的PCR快速检测方法,并对发病样品进行了检测。结果显示,设计的阴沟肠杆菌与产气肠杆菌检测引物能分别扩增出与预计大小一致的385 bp和201 bp的特异性片段,与其余供试菌株无交叉反应。两种检测方法的灵敏度分别为103 CFU/ml和102 CFU/ml。罗氏沼虾幼体样品的检测结果与实际发病情况一致,建立的检测方法也可直接对样品进行PCR检测,而无需细菌分离培养。本研究建立的阴沟肠杆菌与产气肠杆菌PCR检测方法具有较高的特异性与灵敏度,可缩短检测时间,该方法的建立对罗氏沼虾幼体病原的快速诊断、分子流行病学的调查及无特定病原(SPF)群体的建立具有重要意义。     

龟致病性维氏气单胞菌和鲍曼不动杆菌双重PCR检测方法的建立

应用2对特异性引物,通过对反应条件和体系的优化,成功建立了能快速检测维氏气单胞菌和鲍曼不动杆菌两种病原的双重PCR方法。研究结果表明,该方法特异性强,仅对龟鳖维氏气单胞菌和鲍曼不动杆菌有扩增,而对其他龟鳖常见病原无扩增;该方法对维氏气单胞菌最低检测核酸质量浓度为1.75×10-3 ng/μL,对鲍曼不动杆菌最低检测核酸质量浓度为3.96×10-3 ng/μL,检出率较传统检测方法高。该研究所建立的双重PCR方法灵敏度高、特异性好,可为临床龟鳖维氏气单胞菌和鲍曼不动杆菌感染的诊断和流行病学调查等提供帮助。     

罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)幼体病原肠杆菌PCR检测技术的建立与应用

根据罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)幼体培育期主要细菌性病原阴沟肠杆菌omp A基因序列、产气肠杆菌gry B基因序列设计特异性引物,通过对PCR扩增产物进行测序鉴定与特异性和敏感性试验,建立了两种病原菌的PCR快速检测方法,并对发病样品进行了检测。结果显示,设计的阴沟肠杆菌与产气肠杆菌检测引物能分别扩增出与预计大小一致的385 bp和201 bp的特异性片段,与其余供试菌株无交叉反应。两种检测方法的灵敏度分别为103 CFU/ml和102 CFU/ml。罗氏沼虾幼体样品的检测结果与实际发病情况一致,建立的检测方法也可直接对样品进行PCR检测,而无需细菌分离培养。本研究建立的阴沟肠杆菌与产气肠杆菌PCR检测方法具有较高的特异性与灵敏度,可缩短检测时间,该方法的建立对罗氏沼虾幼体病原的快速诊断、分子流行病学的调查及无特定病原(SPF)群体的建立具有重要意义。     

基于toxR基因病原哈氏弧菌PCR检测方法的建立

基于toxR基因序列设计检测哈氏弧菌的1对特异性引物,通过PCR反应条件优化、PCR反应特异性及敏感性检测,建立一种哈氏弧菌的特异性分子检测方法.试验结果表明,该引物可使哈氏弧菌扩增出大小为390 bp的toxR基因片段,3种水产动物病原弧菌未扩增出任何条带,敏感性检测结果为该PCR反应最低能检测出0.375 ng/μ...     

奶牛结核病的PCR检测方法的建立及应用

根据PCR技术的原理建立了奶牛结核病的PCR诊断方法,并测定出该方法的敏感性为30.9pg/ūL。特异性试验结果表明,除牛结核分枝杆菌的特异扩增带(242bp)外,其他的细菌均未出现特异性扩增带。用该方法对陕西省某奶牛养殖小区的121份乳样中的结核分枝杆菌进行检测,结果显示,在121份乳样中有3份为阳性,阳性检出率2.48%。本试验还用PCR方法对PPD检测和胶体金检测法进行验证,结果表明PCR方法敏感性强,特异性高,是一种提高牛结核病临床诊断的好方法。     

猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立

根据猪圆环病毒2型(PCV2)的基因序列,设计一对能特异性扩增PCV2ORF2基因的引物,通过对PCR方法的优化,建立了快速的PCR检测方法用于病料中PCV2感染的检测。用本方法对猪瘟病毒(HCV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)进行了扩增,均未有条带出现,表明该方法具有良好的特异性;敏感性试验表明,该方法能够检测到的最低DNA模板浓度为1.0×10-5ng/μL;重复性试验表明,该方法具有良好的稳定性。     

高丝氨酸内酯酶AI-96对嗜水气单胞菌NJ-1浸浴攻毒斑马鱼保护效应的研究

为评价斑马鱼口服高丝氨酸内脂酶AI-96对嗜水气单胞菌NJ-1浸浴攻毒的保护效应,实验设置基础料与实验料两组饲料,实验料是在基础料中按3 U/g饲料添加N酰基高丝氨酸内酯酶AI-96(以下简称AI-96),通过高浓度(2.5×108 cfu/mL)及低浓度(0.7×108 cfu/mL)两组剂量的嗜水气单胞菌NJ-1(以下简称NJ-1)分别浸浴攻毒斑马鱼,在12h、24 h、3d、7d和14d取鳃丝、肠道壁、肝和肾样,采用实时荧光定量PCR法检测取样器官中NJ-1量,并统计攻毒周期内的死亡率,来评价高丝氨酸内酯酶AI-96的保护力.结果显示:在攻毒周期内所取组织内均检测到NJ-1,按菌数肠＞鳃＞肝＞肾,其中高NJ-1剂量未加酶组各组织NJ-1数量均分别明显高于低剂量处理组.在高剂量攻毒条件下,加酶组各组织NJ-1数量均显著低于未加酶处理组(P＜0.05),鳃除外;在低剂量攻毒条件下,未加酶组的NJ-1数量在鳃(3 d)、肠(0.5、1、3、7及14 d)、肝(3 d)和肾(7 d)显著高于加酶组(P＜0.05),其余差异不显著(P＞0.05).此外无论在高、低剂量攻毒条件下,加酶组的死亡率均低于未加酶组,其中低剂量攻毒7d及以后其死亡率显著低于对照(P＜0.05).结果表明,口服AI-96可以有效预防NJ-1≤0.7×108 cfu/mL范围内的侵袭.     

虹鳟肠炎红嘴病病理模型的构建

为探讨鲁氏耶尔森菌侵染虹鳟的致病机制,本实验建立了鲁氏耶尔森菌感染虹鳟引起的肠炎红嘴病的病理模型,制定相应的临床症状及组织病理学评分系统,并对该模型进行研究。将43尾平均体质量约为12 g的健康虹鳟随机分成5组:3个实验组(n=30)、对照组(n=10)和哨兵组(n=3)。3个实验组分别采用2.0×106、2.0×107和2.0×108 CFU/m L的鲁氏耶尔森菌感染浓度,通过腹腔注射方式进行人工感染试验。对感染鲁氏耶尔森菌的虹鳟肠、肝脏、脾脏和肾脏组织进行镜检及临床症状、剖检病变判断,结合细菌学检测,按制定的评分系统评价各组肠炎红嘴病造模效果,确定最佳造模方案。结果显示,各攻毒组虹鳟感染后72 h均出现不同程度死亡,临床症状表现为红嘴、肛门红肿、鳍(胸鳍、腹鳍、臀鳍)等出现不同程度充血,下颌部、腹部出现出血点等。组织病理学可见肝脏、脾脏、肾脏及肠组织均有炎性细胞浸润现象出现,肝细胞、肠上皮细胞和肾小管上皮细胞等实质细胞变性、坏死,脾脏部位淋巴细胞减少、红细胞死亡堆积。综合各组得分发现,2.0×107 CFU/m L组的鲁氏耶尔森菌感染虹鳟造模效果最佳,患病虹鳟的临床症状显著且组内差异较小,病程迁延较长,便于研究。研究表明,对体质量约12 g的虹鳟幼鱼腹腔注射0.1 m L浓度为2.0×107 CFU/m L的鲁氏耶尔森菌可成功构建肠炎红嘴病病理模型。     

泥鳅养殖水体中一株芽孢杆菌的筛选及其净水效果研究

从泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）养殖池塘水体中分离到4株芽孢杆菌,筛选后获得1株优势目的菌株NQ1;根据形态学特征和生理生化特性结果,将其鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。安全性试验证实,试验浓度（最高为1×107 cfu/mL）的枯草芽孢杆菌NQ1对泥鳅是安全的。水质净化试验结果显示,在泥鳅养殖水体中加入1×107 cfu/mL浓度的NQ1,14天后氨氮和亚硝酸盐含量较对照组分别降低34.97%和89.46%,表明该菌的净水效果明显,具有作为水质改良微生态制剂开发应用的潜力。     

多重PCR在创伤弧菌快速检测中的应用

建立多重PCR方法检测水体及海产品中的创伤弧菌。针对创伤弧菌的gyrB基因的不同位点设计了3对引物，扩增片断的大小分别为481、702、1065bp。该方法的灵敏度为10^2cfu／ml。共对3种海产品进行了创伤弧菌的检测，结果在3种海产品中均能特异性地检测到创伤弧菌。该方法快速，灵敏度高，特异性强。为海产品及水体中的创伤弧菌的检测提供了有效的方法。     

Identification of Vibrio harveyi,Vibrio ichthyoenteri,and Photobacterium damselae isolated from olive flounder Paralichthys olivaceus in Korea by multiplex PCR developed using the rpoB gene

Major fish bacterial diseases in Korea are edwardsiellosis, streptococcosis, and vibriosis. Among vibrionaceae, Listonella anguillarum, Vibrio harveyi, V. ichthyoenteri, and Photobacterium damselae were identified as causative organisms of vibriosis in flounder. In this study, we developed a multiplex PCR method using the RNA polymerase β subunit (rpoB) gene, known as a housekeeping gene for identification of Vibrio spp. causing vibriosis in flounder. Three pairs of PCR primers were designed based on the rpoB sequence of three species, V. harveyi, V. ichthyoenteri, and P. damselae. The PCR assay, using a mixture of six primers, yielded amplicons of 601, 434, and 533 bp in V. harveyi, V. ichthyoenteri, and P. damselae. None of the untargeted species yielded an amplicon. The detection limits for pure culture in kidney were 2.5 × 10⁴ cfu/g kidney for V. harveyi, 2.5 × 10⁵ cfu/g kidney for V. ichthyoenteri, and 2.5 × 10⁶ cfu/g kidney for P. damselae. From the colonies on TCBS agar plates of different samples, 632 Vibrio spp. isolated from aquacultured flounder between 2004 and 2010 were identified by the multiplex PCR method. As a result, 265 strains (41.9 %) were V. ichthyoenteri; 115 strains (18.2 %) were V. harveyi and 72 strains (11.4 %) were P. damselae.     

软包装即食醉鱼制品细菌学品质安全分析

对上海市场常见品牌的软包装即食醉鱼制品感官、理化、细菌学品质状况进行定性和定量研究,并对潜在病原菌安全性进行评价。结果表明,产品水分含量、水分活度、pH和盐分含量分别为43.50%~56.97%,0.93~0.97,6.07~6.73,2.41%~6.63%,差别较大;细菌菌落总数、耐热菌落总数分别是1.8×102~4.2×105cfu/g,38~3 800 cfu/g;厌氧菌落总数和金黄色葡萄球菌均低于10 cfu/g。由细菌总数计数平板分离256株细菌,鉴定残存主要细菌菌群为芽孢杆菌(34.0%)、葡萄球菌(27.3%)、玫瑰小球菌(14.0%),并出现少量的棒状杆菌(5.5%),表明热杀菌强度不足。产品中残存有一定数量的蜡样芽孢杆菌,对其潜在危害有待进一步研究。     

Bacterial Flora of Artemia Cultured in Earthen Saline Ponds

Aerobic bacteria in pond water, sediments, and Artemia in earthen saline ponds in Saudi Arabia were quantified. Total viable counts (TVC; mean ± SD) in pond water ranged between 7.9 ± 4.8 × 10³ and 1.6 ± 3.7 × 10⁴ colony forming units (cfu)/mL; in sediments between 7.1 ± 4.2 × 10⁶ and 6.5 ± 3.8 × 10⁷ cfu/g; on Artemia surfaces, 3.9 ± 0.9 × 10³ and 1.0 ± 2.9 × 10⁴ cfu/Artemia; and in Artemia homogenate, 4.6 ± 2.4 × 10⁷ and 3.2 ± 3.6 × 10⁸ cfu/g. The bacterial flora was predominantly Gram-negative rods, accounting for 89% of total isolates. Altogether, nine bacterial species of seven genera were identified. Bacteria in pond sediments were the most diverse compared to other populations. In all populations, Vibrio alginolyticus, Vibrio sp., and Staphylococcus sp. were dominant (P < 0.005). The bacterial flora of pond water and sediments were reflected in the bacterial composition on and in Artemia.     

乳酸杆菌LH对水产常用药物的敏感性

采用试管法,以金黄色葡萄球菌ATCC25922为质控菌,研究乳酸杆菌LH菌株对氟苯尼考、土霉素、二氧化氯、二溴海因、强力碘的敏感性。结果显示,在5.0×105cfu/mL时,最小抑菌浓度分别为2μg/mL、4μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、32μg/mL,最小杀菌浓度分别为16μg/mL、64μg/mL、128μg/mL、128μg/mL、128μg/mL;最小抑菌浓度随着菌悬液浓度(104~107cfu/mL)的增大而升高;在杀菌曲线中,药物对菌的抑制作用随着作用时间的延长而逐渐减弱。