聚合酶链反应（PCR）检测养殖对虾的白斑症病毒（WSSV）感染

对虾WSSV病是亚洲对虾养殖业中的一个棘手问题。本研究采用Kimura引物 ,用PCR技术对不同生长期的中国对虾 (Penaeuschinensis)进行了WSSV的检测 ,同时也检测了对虾发病时养殖池中多见的野生厚蟹 (Helicesp .)和矛尾刺虎鱼 (Acanthogobiushasta)。检测结果表明 :分别在检测的 5尾亲虾中的 1尾 ,6尾仔虾中的 1尾 ,5尾稚虾中的 3尾及所检测的 5尾病虾和 2只厚蟹中获得到 982bp的PCR扩增产物 ,说明为WSSV感染阳性。在检测的 2尾矛尾刺虎鱼中均未获得PCR扩增产物 ,说明为WSSV感染阴性。在亲虾、虾苗以及虾池内的野生厚蟹中检测到WSSV感染的阳性结果表明 :WSSV感染的亲虾有可能是病毒的储主 ,WSSV感染的野生厚蟹有可能是病毒中间宿主或病毒的携带者 ,它们在对虾WSSV病的感染、传播中起了重要的作用     

感染白斑综合病毒（WSSV）对虾相关免疫因子的研究

129尾中国对虾（Penaeus chinensis)分别捕自未暴发白斑综合症（WSSV病毒所致）虾池、WSSV暴发虾池以及曾暴发WSSV虾池。用斑点杂交和组织病理学方法确定各尾对虾的染毒（WSSV）程度。用96孔酶标板法测量相应个体血淋巴上清液的抗菌活力（Ua)、溶菌活力（UL）、酚氧化酶（PO）活性以及过氧化酶（POD）相对活性；用硝酸纤维膜斑点法测定其碱性磷酸酶（ALP）相对活性；用血凝法测定其凝集效价（HAT）。通过对以上免疫指标进行统计分析，结果表明，WSSV感染与对血淋巴PO活性以及ALP相对活性变化有紧密联系；不同虾池各免疫因子差异显著，发病虾池虾样各免疫指标平均值均低于其他虾池；曾发病虾池的虾样PO活性较强；WSSV与HPV感染无统计学意义上的相关性；未发病虾池与曾发病虾池实验对虾的Ua与UL相关性极显著，发病虾池实验对虾Ua与UL呈负相关；发病虾池对虾PO与ALP活性相关性显著。不同性别中国对虾血淋巴上清液的免疫因子活性没有显著差异。     

预防对虾病毒病的十二项措施

对虾白斑综合症病毒(WSSV)是全世界危害最严重的对虾病毒。目前对于该病毒尚没有特效药对付。最根本的办法就是预防感染,采取综合措施,实现健康养虾。笔者从1993～2003年在3．33 hm2(50亩)虾池中连续做     

用DNA斑点杂交法检测对虾及其饵料和环境生物携带白斑综合症病毒状况的调查

于1996-1998年采用DNA斑点杂交法,完成了共计836份养殖对虾,213份对虾饵料和环境生物样品的检测。结果显示,对虾在每年的4-10月都可检测出白斑综合症病毒（WSSV）,6月出现最高峰,阳性检出率达到42.6%;其次,为7月和5月,分别达31.6%和24.5%。在对虾不同生长阶段（包括亲虾、各期幼体、仔虾、幼虾及成虾）均可检出WSSV,其中以仔虾的带毒率最高,达36.4%,其次为糠虾幼体,达34.6%。体长范围1.1-2.0cm的仔虾阳性率最高,其次体长为5.1-6.0cm的幼虾样品。检测的中国对虾样品（625份）带毒率为16.8%,日本对虾样品（211份）带毒率为45.0%。对虾主要饵料及环境生物类群包括鱼类、虾类、蟹类、桡足类、端足类、沙蚕、卤虫均可检出WSSV,其中小型虾类、端足类、桡足类、蟹类样品的WSSV检出率均高于20%。     

感染白斑综合症病毒中国对虾雄性生殖系统的PCR检测与电镜观察

通过人工投喂携带WSSV的毒饵，对性腺发育成熟的中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）雄虾（♂）进行感染实验。采用nest-PCR（巢式PCR）技术，检测感染后的中国对虾雄性生殖系统受WSSV感染情况，同时选取感染严重的虾样进行电镜观察。巢式PCR检测结果表明，感染组中国对虾的精巢、输精管和精囊均被WSSV感染，其中精囊呈阳性的最多，输精管次之，精巢最少。通过电镜进一步观察发现，WSSV粒子只存在于精巢、输精管和精囊的结缔组织中，而在其他组织和生殖细胞中均未发现病毒粒子。其中，精巢中WSSV粒子存在于精巢内两个生精小管之间的结缔组织；输精管中WSSV粒子存在于管壁的结缔组织；精囊中WSSV粒子也只存在于精囊内膜的结缔组织和精荚膜的结缔组织中。PCR检测和电镜观察结果均表明，WSSV粒子能感染中国对虾的雄性生殖系统且对性腺感染存在着一定的组织特异性。     

虾病病原及对策

对虾养殖业的发展,随之而来虾病的发生也越来越频繁,发病区域不断扩大,危害性越来越严重。我国台湾省1987年因为虾病流行,造成对虾产量急剧下降。我国大陆沿海各地养虾地区,于1990-1993年也先后发生暴发性流行病,虾病种类及危害性也逐年增加,使养虾业遭受重大挫折。 虾病是全球性养虾业可持续发展的最主要制约因素,成为养虾成败的关键。1992年以来,中、南美洲的凡纳对虾曾多次发生对东、西两半球危害性最大的桃拉病毒综合症(Taura syndrome viruses, TSV)和白斑病毒综合症(WSSV),死亡率80%~100%:1997-1998年,台湾省又掀起凡纳对虾养殖…     

对虾白斑综合症的研究综述

对虾白斑综合症是由对虾白斑综合症病毒（white spot syndrome virus WSSV)引发的暴发性流行病，典型症状是病虾甲壳内侧出现0.5-2mm大小不等的白色斑点，此病病程短，死亡率高。白斑综合症病毒（WSSV）的形态结构与杆状病毒相似，杆状病毒分子分布于患病组织细胞核内，WSSV不仅水平传播，还存在垂直传播的可能性，到目前为上，诊断技术己较为进步，但尚无有效手段控制该病的发生。今后的研究重点在防治上。     

对虾白斑综合症病毒的分子生物学研究进展

对虾白斑综合症病毒(wkite spot syndrome virus，WSSV)又称对虾白斑杆状病毒(white spot bacilliform virus WSBV)，是对全球对虾养殖业危害最大的病原之一。该病毒分子量较大、结构特异，是已知动物病毒中最大的病毒。自1992年以来，各国学者对WSSV进行研究。由于他们研究的方法及研究的侧重点不同，对该病毒命名各异。陈秀男(1993)称之为白斑综合症杆状病毒(WSBV)；荷兰Wongteerasupaya(1995)称其为系统外胚层和中胚层杆状病毒(SEMBV)；     

感染白斑综合症病毒（WSSV）对虾相关免疫因子的研究

129尾中国对虾（Penaeus chinensis）分别捕自未暴发白斑综合症（WSSV病毒所致）虾池、WSSV暴发虾池以及曾暴发WSSV虾池。用斑点杂交和组织病理学方法确定各尾对虾的染毒（WSSV）程度。用96孔酶标板法测量相应个体血淋巴上清液的抗菌活力（Ua）、溶菌活力（U↓（L））、酚氧化     

白斑综合征病毒感染与对虾的免疫防御反应

对虾白斑综合征病毒（WSSV）感染对虾后，最典型的免疫反应是对虾开放循环系统的血淋巴细胞数量急剧下降，血淋巴凝结功能下降，感染部位聚集了大量的血淋巴细胞，且以颗粒细胞为主。WSSV可感染对虾颗粒细胞和小颗粒细胞，其中小颗粒细胞感染率高、感染速率快，感染后大颗粒细胞占血细胞总数的比例可增加到50％；血淋巴中的总糖、总碳水化合物、总蛋白和游离氨基酸显著提高，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和诱导性一氧化氮合成酶的活性显著降低。自然状态下广泛存在WSSV潜伏感染，潜伏感染的存在会导致存在免疫反应情况下的感染复发，并且有助于病毒的传播；不同WSSV感染状态下过氧化物（POD）差异显著，其平均值由大到小依次为：潜伏感染虾样、中度感染虾样、严重感染虾样。而其抗菌活性（UA）、溶菌活性（UL）、酶氧化酶活性（PO）、碱性磷酸酶（ALP）和凝集效价（HAT）差异不显著；潜伏感染个体对再次接种WSSV有“类免疫应答”的抗性，这种抗性不是来源于发病期对虾的天然抗性，而是WSSV感染后的一种免疫系统增强。宿主细胞凋亡可能是感染对虾在高温时反而维持较高成活率的主要机制。免疫增强剂可对对虾防御WSSV感染产生影响，脂多糖、葡聚糖、肽聚糖、岩藻依聚糖和双链核糖核酸都已被证实可提高对虾抗病毒感染的免疫保护。WSSV主要囊膜蛋白VP28可诱导对虾对WSSV感染产生抗性降低累积死亡率，高效价的病毒抗血清具有良好的保护作用；对虾抗菌肽也可通过抑制病毒的复制而起保护作用。     

江苏地区对虾3种病毒病的流行病学调查及5株IHHNV的编码区基因序列分析

对虾白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉综合征病毒(TSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)是威胁对虾养殖的重要病毒。为了调查这3种病在江苏境内的流行情况,根据世界动物卫生组织(OIE)推荐的《水生动物疾病诊断手册》的PCR检测法对2015年5月—2016年5月采集的1436尾对虾样品进行3种疾病的流行病学调查。结果显示WSSV阳性率为17.20%,TSV阳性率为0%,IHHNV阳性率为39.48%。对江苏不同地区分离出的5株IHHNV进行基因序列分析,数据显示这5个地区的毒株均属于Ⅰ型感染株,与韩国株的进化关系较为接近。本研究通过调查以上3种病毒病在江苏境内的流行情况,并进行序列分析,发现江苏不同地区的凡纳滨对虾IHHNV感染均为Ⅰ型,研究结果对养殖虾的疾病防控有重要参考价值。     

养殖南美白对虾桃拉综合征病原的确认及其组织病理学观察

应用RT-PCR技术，对福建南部养殖南美白对虾(Litopenaeus vannamei)自然暴发的急性传染病病原进行了检测。结果检出桃拉综合征病毒。对231bp的扩增产物进行了测序，并与Genbank桃拉综合征病毒相应序列进行比较，其同源性超过97．O％。临床观察也表明，虾体表发红、有的虾体表散布有一些灰白色病灶，附肢及尾扇发红，还有一些病虾体表散布大量黑色不规则病灶，为桃拉综合征病毒感染引起的典型症状。组织病理学检查表明，病虾体表、附肢、鳃等组织的表皮上皮有许多坏死病灶，结缔组织细胞与相邻横纹肌纤维基底部也有病变。病变细胞嗜酸性颗粒增多，细胞核固缩或破裂。部分病虾肝胰腺出现脂肪化和空泡变性。     

应用PCR和RT-PCR技术对4种对虾病毒的检测

探讨了应用PCR和RT－PCR技术对4种主要的对虾病毒进行检测的方法。同时使用该方法检测了对虾天然饵料－－卤虫中的4种对虾病毒。结果显示，含病毒核酸的阳性对照样品分别扩增出了大小为824bp,705bp,260bp和216bp的预期产物，但未能从卤虫样品中检测到此4种病毒的存在。本文报道的病毒检测方法具有快速、灵敏、准确的特点，可以用于进出口贸易中对活体或冰冻对虾，虾苗，对虾饵料等进行相关对虾病毒的检疫，也为制定我国对虾病毒检疫检验规范提供了技术参考。     

The molecular detection of Taura syndrome virus emerging with White spot syndrome virus in penaeid shrimps of Thailand

This study is to investigate the outbreak of the Taura syndrome (TS) in penaeid shrimps of Thailand. Following the outbreak in 2003, the Taura syndrome virus (TSV) was detected in two closely related penaeids; the Pacific white shrimp, Penaeus vannamei, and the black tiger prawn, Penaeus monodon. Multiple viral infections were detected, we found that the TSV-infected P. vannamei also presented evidence of the White spot syndrome virus (WSSV) as evidenced by histological examination and molecular diagnostic methods. Infections of TSV and WSSV were investigated over a period of ten months between October 2003 and July 2004. TSV infection in shrimps was diagnosed by RT-PCR using the OIE recommended 9195/9992 primers. Positive shrimp gave the expected amplicon of 231 bp. We also amplified and sequenced a fragment of the vp1 gene (354 bp). The pairwise comparisons of vp1 revealed that Thai TSV was phylogenetically related to the Taiwanese strains (98.3% identity).     

对虾的主要疾病及其诊断方法

诊断对虾病原的方法有传统的形态病理学（光镜和电镜直接观察和组织病理学等）、扩增和生物测定、微生物学和血清学方法，对皮下及造血组织坏死病毒病（IHHNV）、肝胰脏细小病毒病（HPV）、拖拉症（Taura syndrome,TS）、白斑综合症（WSSV）、斑节对虾型杆状病毒病（MBV）和杆状对虾病毒病（BP）等病原均采用非放射性的基因组探针目前已研制出了NHP、某些弧菌（Vibrio spp）和微孢子虫的传统基因探针，根据聚合酶链式反应（PCR），采用DNA扩增方法确立的检测某些病原的高敏感性方法也应用在对虾病原诊断上。     

多重RT-PCR体系检测4种虾病毒的方法

根据多重RT-PCR的技术原理,利用对虾传染性表皮与造血组织坏死症病毒、白斑综合征病毒、黄头病毒和桃拉综合征病毒的基因序列分别设计了4对特异引物,建立多重RT-PCR体系用于虾4种病毒的检测。多重RT-PCR体系能特异地扩增出IHHNV、WSSV、YHV和TSV的目的片段:TSV特异性扩增片段508 bp,WSSV 特异性扩增片段435 bp,IHHNV 特异性扩增片段301 bp 和YHV。特异性扩增片段614 bp。结果表明,多重PCR虾病毒检测系统具有较高的特异性和敏感性,并对其它对虾病原呈阴性。IHHNV、TSV、WSSV和YHV模板在多重PCR虾病毒检测体系中的检测下限分别为0.1,1,0.02和0.2 pg。病毒感染病料检测试验中,该检测体系的检测结果与单纯PCR的检测结果呈现出较好的吻合度。     

对虾6种病毒多重PCR检测方法的建立

本研究针对养殖对虾6种病毒,包括白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、肝胰腺细小病毒(HPV)、桃拉综合征病毒(TSV)、对虾杆状病毒(BP)和传染性肌肉坏死病毒(IMNV),选择各自的基因分别设计特异性引物和探针,首先进行了单一病毒的PCR验证,在此基础上建立了同时特异性检测6种对虾病毒的多重PCR检测体系。对反应条件进行优化并进行特异性和灵敏度的验证。50μl反应体系,Mg2+的最佳浓度为5mmol/L,ExTaq酶最佳用量为3.75U,反应程序中最佳退火温度为55.5℃。6种病毒之间以及与对虾基因组都存在很好的特异性。最终经试验验证,该系统的检测灵敏度对WSSV可达104拷贝,IHHNV可达102拷贝,HPV可达104拷贝,TSV可达103拷贝,BP可达105拷贝,IMNV可达105拷贝。虽然该多重PCR方法灵敏度不如单一的PCR检测高,但是通过实际样品检测验证了该方法省时、消耗较少,又不失准确性,在实际应用中具有可靠性和应用价值。     

High efficacy of white spot syndrome virus replication in tissues of freshwater rice‐field crab,Paratelphusa hydrodomous (Herbst)

An attempt was made to determine the replication efficiency of white spot syndrome virus (WSSV) of shrimp in different organs of freshwater rice‐field crab, Paratelphusa hydrodomous (Herbst), using bioassay, PCR, RT‐PCR, ELISA, Western blot and real‐time PCR analyses, and also to use this crab instead of penaeid shrimp for the large‐scale production of WSSV. This crab was found to be highly susceptible to WSSV by intramuscular injection. PCR and Western blot analyses confirmed the systemic WSSV infection in freshwater crab. The RT‐PCR analysis revealed the expression of VP28 gene in different organs of infected crab. The indirect ELISA was used to quantify the VP28 protein in different organs of crab. It was found that there was a high concentration of VP28 protein in gill tissue, muscle, haemolymph and heart tissue. The copy number of WSSV in different organs of infected crab was quantified by real‐time PCR, and the results revealed a steady increase in copy number in different organs of infected crab during the course of infection. The viral inoculum prepared from different organs of infected crab caused significant mortality in tiger prawn, Penaeus monodon (Fabricius). The results revealed that this crab can be used as an alternate host for WSSV replication and production.     

白斑综合症病毒（WSSV）在对虾养殖过程中传播途径的调查

为探讨人工养殖条件下池塘中对虾是如何感染暴发性流行病，作者通过对人工养殖对虾暴发白斑综合症的池塘进行生物调查和取样，经ＰＣＲ检测，获得了一些有意义的结果。发现：在暴发白斑病的池塘中，中国对虾和日本对虾以及池中的脊尾白均可检测到阳性，阳性率大小与发病的程度有关；蟹类未检测到阳性个体；鱼类和底栖的沙蚕亦未检测到阳怕；浮游动物的糠虾类未检测到阳性；桡足类检测为阳性，说明桡足类是对虾白斑病毒中宿主之一，由携带病毒的桡足类水平传播给对虾等以此为饵的甲壳类动物。