扇贝养殖海区浮游生物携带AVNV的荧光定量分析

为了探明养殖海区浮游生物与AVNV流行传播的关系,实验自2009年5月至11月,分别从青岛沙子口和荣成桑沟湾两个扇贝养殖海区定期采取50和300 cm两个水层水样,经25、3和0.22 μm 3个孔径的滤膜分级过滤收集3个粒径的浮游生物组分,利用荧光定量PCR技术对浮游生物携带AVNV的情况进行了定量检测。结果表明两个海区浮游生物样品均检测到AVNV,检测的AVNV数量也均在8月份达到峰值,沙子口海区每升海水中浮游生物携带4.11×10⁶拷贝的AVNV,桑沟湾海区浮游生物携带1.49×10⁵拷贝的AVNV。两个海区3个粒径浮游生物组分携带AVNV的数量从高到低依次为0.22~3 μm组分、3~ 25 μm组分和大于25 μm组分,但两个水层(50和300 cm)浮游生物携带AVNV的数量则没有显著差异。结合养殖期间扇贝摄食浮游生物的特点,研究认为,扇贝在养殖期间可能会通过滤食携带病毒的浮游饵料而感染AVNV,海区浮游生物可能是导致AVNV流行的重要传播媒介。     

扇贝养殖海区浮游生物及大型海藻携带AVNV病毒的检测分析

为了解扇贝养殖海区浮游生物及大型海藻与急性病毒性坏死症病毒(AVNV)流行传播的关系,本研究于2008年和2009年从青岛沙子口和荣成桑沟湾2个养殖海区采集水样,离心收集浮游生物并随机采集大型海藻,采用荧光定量PCR(FQ-PCR)技术对这些样品携带AVNV情况进行检测。结果显示,沙子口海区8月份的浮游生物样品中检测到AVNV,每升海水中浮游生物携带的病毒数量为6.92×105拷贝;桑沟湾海区4月份的浮游生物样品也检测到AVNV,每升海水中浮游生物携带的病毒数量为1.26×103拷贝。从青岛沙子口海区随机采集的10种大型海藻中有7种[包括孔石莼(Uiva pertusa)、浒苔(Enteromorpha prolifera)、细毛石花菜(Gelidium crinale)、缘管浒苔(E.Linza)、海膜(Halymenia floresia)、扁江蓠(Gracilaria textorii)、刚毛藻(Cladophora)]检测到病毒,带毒样品占到检测样品总数的55.56%,其中在12份孔石莼样品中,11份样品检测到病毒,携带病毒数量最高为7.68×104/0.1(g2009年8月25日)。从荣成桑沟湾海区采集的14种大型海藻样品中有3种(包括孔石莼、海膜和马尾藻)检测到病毒,带毒样品占到检测样品总数的20.83%,其中2009年7月采集的孔石莼样品携带病毒数量最高,为3.06×103/0.1g。这一结果说明海区浮游生物及部分大型海藻均可携带AVNV,而摄食携带病毒的浮游生物可能是扇贝感染发病的原因,有关大型海藻携带AVNV在该病原流行传播中的作用还有待进一步研究。     

两个海区栉孔扇贝感染AVNV的比较分析

急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)是一种能导致栉孔扇贝大规模死亡的DNA病毒,研究通过检测不同养殖模式和不同苗种来源的栉孔扇贝样本携带AVNV的情况,以寻找合理的养殖模式和苗种,降低疾病的发生。以扇贝单一养殖的青岛流清河海区和贝藻间养的荣成桑沟湾海区为采样点,每月(2010年3月—2011年4月)定期采集2个海区野生苗养殖和人工苗养殖的栉孔扇贝样品各10只,共得到扇贝样本480只。取扇贝外套膜组织,提取DNA,采用巢式PCR检测扇贝感染AVNV的情况,并对2个海区2类栉孔扇贝AVNV感染率进行比较。结果显示,在2个海区的2类栉孔扇贝体内均检测到AVNV,流清河海区野生苗和人工苗养殖栉孔扇贝AVNV感染率分别为21.1%和18.9%,桑沟湾海区2类扇贝AVNV感染率分别为11.1%和5.6%;2个海区AVNV感染扇贝均集中在7、8月份,其中,流清河海区最高可达80%,桑沟湾海区最高仅40%。研究表明,贝藻间养和选用人工苗能有效减少AVNV对养殖扇贝的感染,是控制养殖扇贝发病死亡的有效措施。     

栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒巢式PCR检测方法的建立

为更好地实现对养殖海区栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)的快速诊断和分子流行病学的调查,以及AVNV的疫情监测,选择AVNV全基因组序列中的保守区段,应用Accelrys gene 2.5软件设计一对巢式引物,用于AVNV的检测.结果显示,引物的扩增片段分别为979和548 bp.实验优化了PCR体系中Mg2+和dNTPs浓度及扩增程序中的退火温度,并建立了完善的AVNV巢式PCR检测技术.研究表明,该PCR检测技术具有较高的敏感性,可稳定检测出5 pg扇贝样品组织总核酸中5×10 copies的病毒粒子.     

应用DGGE技术研究扇贝养殖海域微型真核浮游生物多样性

为了研究扇贝养殖海区微型真核浮游生物群落多样性,明确养殖扇贝发病时期高丰度微型真核浮游生物种类,探讨微型真核浮游生物与栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)水平传播的可能关系。于2009年和2010年从青岛流清河湾扇贝养殖海区采集了9个月份的海水样品,经25和3 μm的滤膜过滤收集海水中3~25 μm的浮游生物,扩增18S rDNA可变区序列,并利用变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gelelectrophoresis,DGGE)技术对扩增序列进行分离以分析微型真核浮游生物多样性。结果表明,该养殖海区微型真核生物包括甲藻、纤毛虫、眼虫、定鞭藻、硅藻、盘蜷虫、隐藻、领鞭毛虫、变形虫和Cercozoan,其中甲藻类和纤毛类生物的最高相对丰度分别达41.0%和38.2%,是海区的优势种类。各月份DGGE谱带聚类分析结果表明,2009年6、7、8、9月份浮游生物群落组成较为相似。中肋骨条藻在扇贝发病前后均有分布。结合相关扇贝AVNV已有的研究结果,研究认为中肋骨条藻是AVNV水平传播的参与者之一,但海区中广泛分布的甲藻和纤毛虫与AVNV传播的关系还有必要进一步研究。     

主要浮游微藻携带急性病毒性坏死症病毒(AVNV)的研究

研究常见浮游微藻对栉孔扇贝“急性病毒性坏死症病毒”(AVNV)的黏附和携带,探讨微藻作为病毒水平传播媒介的可能性,进而了解AVNV的水平传播途径。我们选取培养17种海区常见浮游微藻,在微藻生长的指数增长期混入AVNV病毒粗提液,用PCR等分子检测法定期对试验微藻携带AVNV的情况进行检测。实验结果表明,亚心形扁藻、小球藻、绿色杜氏藻、四爿藻、中肋骨条藻和小新月菱形藻可以在一定时间内携带AVNV,占到实验微藻总数的35.3%。用携带AVNV的6种微藻投喂试验栉孔扇贝以分析其致病力,结果表明,试验扇贝表现出典型的急性病毒性死亡症状,在试验的9 d时间内,6组感染组试验扇贝的累积死亡率均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于对照组,表明携带AVNV的微藻具有显著的致病性。本研究的结果表明,栉孔扇贝通过摄食携带AVNV的微藻而感染发病是可能的,浮游微藻可能是AVNV水平传播的重要传递体。     

科技信息

扇贝急性病毒性坏死病毒全基因组序列测定近日,为探讨扇贝急性病毒性坏死病毒(AVNV)分类地位,建立快速、灵敏的核酸诊断技术,在国家863课题"浅海生态养殖扇贝流行病控制技术"的资助下,中国水产科学研究院黄海水产研究所海水养殖生物疾病控制与分子病理学实验室首次完成了     

栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒荧光定量PCR检测方法的建立和应用

根据栉孔扇贝(Chlamys farreri)急性病毒性坏死病毒(Acute viral necmbiotic virus,AVNV)的基因序列,选择保守区段,应用Beacon Designer 7.0软件设计了一对能特异性扩增90 bp片段的引物和Taq Man探针,建立并完善了AVNV荧光定量聚合酶链式反应(Huorescent quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)诊断方法.该方法在108～102病毒拷贝范围内有较好的线性关系,AVNV拷贝数(X)和循环数(G1)的相关关系为:IgX=-0.29C1+13.28(相关系数R2=0.998);检测AVNV的灵敏度为102拷贝;特异性实验表明只对AVNV基因组呈阳性反应.应用FQ-PCR对76份采自夏季发病期前后的栉孔扇贝样品进行检测,结果发现68份样品检测结果为阳性,阳性检出率为89.47%,高于普通PCR的阳性检出率(80.26%).研究结果表明,该方法快速、灵敏,特异、重复性良好且能实现AVNV的定量检测,对AVNV的快速诊断和分子流行病学的调查以及AVNV疫情监测具有重要意义.     

间接免疫荧光法检测栉孔扇贝急性病毒性坏死症病毒

用纯化栉孔扇贝(Chlamys farrei)急性病毒性坏死症病毒(AVNV)免疫兔子,以兔抗血清为一抗,荧光标记的羊抗兔抗体为二抗,采用冰冻切片技术,建立了栉孔扇贝AVNV的间接免疫荧光检测方法。用该方法分析栉孔扇贝和海湾扇贝(Argopecten irradians)体内AVNV感染强度,并对感染率进行统计。结果表明,栉孔扇贝的肾脏、肝胰腺中,AVNV阳性信号最强,呈现中度到重度感染,其AVNV感染率100％。鳃丝、性腺及闭壳肌中未检测到阳性信号。在海湾扇贝的肝胰腺及肾中AVNV的感染率也较高。提示AVNV感染扇贝的靶器官主要是肾脏、肝胰腺。对与栉孔扇贝同一海区养殖的海湾扇贝在栉孔扇贝发病期间存活率较高的原因进行了讨论。     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)及虾肝肠胞虫(EHP)的荧光定量PCR检测

2013年,河北、天津等地区养殖的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)育苗期出现死苗、出苗率低的情况,生产上,仔虾个体大小差异较大,造成了严重损失。本研究采用荧光定量PCR方法(Real-time PCR)对天津大港地区采集的108尾凡纳滨对虾仔虾样品进行单尾病原检测。结果显示,传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)和虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)均有检出。IHHNV阳性检出率100%,每微克对虾组织DNA的病毒拷贝数为10~3–10~7,且个体较大的样品(1.2–2.0 cm)携带病毒拷贝数偏高;EHP阳性检出率为49.1%,每微克对虾组织DNA的拷贝数为10~3–10~5,且集中于个体较小样品(0.7–1.1 cm)。对IHHNV和EHP阳性凡纳滨对虾样品进行生物学体长与病毒载量指数相关性分析,显示IHHNV载量指数与对虾生长速率呈正相关,虾组织IHHNV平均载量达8.51×10~4 copies/μg DNA,为较高的感染水平;EHP的载量与对虾生长速率呈负相关关系,与较大个体阳性检出率较低相对应,虾组织EHP平均载量达到2.19×10~4 copies/μg DNA,为较高的感染水平。由此,该批凡纳滨对虾仔虾患病为IHHNV和EHP的混合感染所致,本研究数据为IHHNV和EHP病原混合感染流行情况及其对养殖育苗期仔虾生长的影响提供科学依据。     

Plankton populations at the bifurcation of the North Pacific Current

As the eastward‐flowing North Pacific Current approaches the North American continent it bifurcates into the southward‐flowing California Current and the northward‐flowing Alaska Current. This bifurcation occurs in the south‐eastern Gulf of Alaska and can vary in position. Dynamic height data from Project Argo floats have recently enabled the creation of surface circulation maps which show the likely position of the bifurcation; during 2002 it was relatively far north at ∼53°N then, during early 2003, it moved southwards to a more normal position at ∼45°N. Two ship‐of‐opportunity transects collecting plankton samples with a Continuous Plankton Recorder across the Gulf of Alaska were sampled seasonally during 2002 and 2003. Their position was dependent on the commercial ship’s operations; however, most transects sampled across the bifurcation. We show that the oceanic plankton differed in community composition according to the current system they occurred in during spring and fall of 2002 and 2003, although winter populations were more mixed. Displacement of the plankton communities could have impacts on the plankton’s reproduction and development if they use cues such as day length, and also on foraging of higher trophic‐level organisms that use particular regions of the ocean if the nutritional value of the communities is different. Although we identify some indicator taxa for the Alaska and California currents, functional differences in the plankton communities on either side of the bifurcation need to be better established to determine the impacts of bifurcation movement on the ecosystems of the north‐east Pacific.     

急性病毒性坏死病毒dUTPase基因的克隆、表达及其产物的酶学活性分析

根据已测定完成的栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)基因组序列,设计特异性引物,以提取的发病扇贝组织总DNA为模板,PCR扩增得到编码AVNV dUTPase的开放阅读框ORF074,将产物克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建表达质粒pET32a-dut。然后,将其转化至E.coli BL21(DE3)进行诱导表达。SDS-PAGE检测显示,诱导表达蛋白分子量约为46 ku,与预期表达蛋白大小一致。经Western-blotting及质谱分析鉴定,所表达蛋白即为重组dUTPase。表达产物经Co²⁺柱纯化后进行酶学活性测定。结果显示,重组dUTPase能特异性催化dUTP,EDTA可以抑制dUTPase的活性,而Mg²⁺可以增强其活性。     

栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒（AVNV）卵内的垂直传播途径

急性病毒性坏死病毒已被证实为是一种对养殖栉孔扇贝危害极大的病原体，探讨其传播途径是防控扇贝“大规模死亡症”的前提之一。将亲贝各放在一独立育苗水体内产卵、孵化，并进行幼虫培育。通过春季和秋季室内人工育苗，从40个独立育苗水体中，采获亲贝、卵各23个家系样品，受精卵、D形幼虫、壳顶幼虫各12个家系样品，眼点幼虫2个家系样品。采用间接ELISA法、间接免疫荧光技术和电子显微镜技术对亲贝、卵和发育各期的幼虫进行定性和定位的检测。结果发现，栉孔扇贝的性腺组织中存在病毒粒子，而卵、受精卵及各期发育幼虫体内均未检测到病毒。由此可以判断：AVNV可以感染栉孔扇贝的性腺，但并不存在卵内垂直传播的可能性。     

急性病毒性坏死病毒IAP-86基因的克隆、表达及抗凋亡研究

在已经完成的栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)全基因组序列测序与分析的基础上,设计特异性引物,克隆得到了ORF86编码的杆状病毒凋亡抑制蛋白基因(IAP-86)。IAP-86基因与pET32a(+)质粒连接构建得到重组质粒pET32a-IAP86,将重组质粒转化到E.coil BL21(DE3)中,使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,SDS-PAGE检测显示表达蛋白分子量约为40 ku,经Western-blotting和质谱分析证明,该蛋白即为IAP-86融合蛋白,Co2+柱纯化后得到了纯化的IAP-86融合蛋白。将重组的IAP-86蛋白用FITC标记,荧光显微镜下观察,发现重组的IAP-86蛋白最终能够与栉孔扇贝血淋巴细胞的细胞核和细胞质结合。细胞凋亡检测实验发现,重组的IAP-86蛋白能够在一定程度上抑制栉孔扇贝血淋巴细胞凋亡,凋亡抑制率为7%。本实验应用原核表达成功得到了IAP-86蛋白,并证明IAP-86对栉孔扇贝细胞的凋亡有一定抑制作用,这为进一步研究AVNV的侵染机制提供依据。     

Two monoclonal antibodies for the recognition of Mytilus spp. larvae: studies on cultured larvae and tests on plankton samples

Monoclonal antibodies (mAbs) were generated against 2-day-old mussel larvae in an attempt to develop a rapid and rigorous method for the identification of mussel larvae in field plankton samples. Previously, we have shown that two of these mAbs recognised Galician Mytilus galloprovincialis obtained from monospecific cultures, but did not recognise the larvae of other bivalve species present in that area. To assess the possibility of using these mAbs in routine assays for measuring the abundance of mussel larvae in plankton, studies on cultured mussel larvae, at different stages of development, and tests on bivalve larvae from plankton samples were carried out. Initially, to see whether the two mAbs also recognise other mussel larval stages, they were tested against mussel larvae of different ages obtained from monospecific cultures. The results indicate that both antibodies stain all the stages tested, even 1-month-old postlarvae. In addition, we also demonstrate that these mAbs also recognise other forms of Mytilus. Both antibodies bind to M. galloprovincialis larvae from the Mediterranean Sea and M. edulis larvae. Finally, and more significantly, studies on field plankton samples were performed to confirm if both mAbs are really mussel-specific, and do not cross-react with larvae of any other bivalve species existing in the plankton. The results presented here clearly indicate that our two monoclonal antibodies specifically recognise the mussel larvae in field plankton samples from different geographical regions, but not the larvae of any other bivalve species. Thus, these monoclonal antibodies could be used for routine monitoring of mussel larvae in plankton samples from different sources.     

雅鲁藏布江谢通门江段浮游生物资源现状及其季节动态

为加强对高原河流浮游生物的群落结构的了解,对雅鲁藏布江中游的浮游生物进行定性和定量分析,调查其资源现状和季节变化,并探究浮游生物的丰度与环境因子的相关性。分别于2008年10月（秋季）、12月（冬季）和2009年3月（春季）、8月（夏季）在西藏雅鲁藏布江中游谢通门江段选取4个采样点进行浮游生物资源现状调查。本次调查共检出浮游植物6门、74属、107种,以硅藻门最多（31属、63种）,其次为绿藻门（22属、23种）和蓝藻门（22属、23种）,黄藻门（22属、23种）、裸藻门（22属、23种）和金藻门（22属、23种）较少。浮游植物的密度和生物量以秋季最高,分别为7.758×105个/L 和3.402 mg/L;夏季最低,分别为2.088×105个/L和1.281mg/L;共检出浮游动物3门、47属、54种,以原生动物和轮虫居多,罕见枝角类和桡足类。浮游动物的密度和生物量以秋季最高,分别为526.5 个/L和0.055 mg/L;冬季最低,分别为125.1 个/L和0.004 mg/L。研究表明,雅鲁藏布江谢通门江段浮游生物的种类数和现存量呈现明显的季节差异,主要与透明度和水温等环境因子相关。