扇贝养殖海区浮游生物携带AVNV的荧光定量分析

为了探明养殖海区浮游生物与AVNV流行传播的关系,实验自2009年5月至11月,分别从青岛沙子口和荣成桑沟湾两个扇贝养殖海区定期采取50和300 cm两个水层水样,经25、3和0.22 μm 3个孔径的滤膜分级过滤收集3个粒径的浮游生物组分,利用荧光定量PCR技术对浮游生物携带AVNV的情况进行了定量检测。结果表明两个海区浮游生物样品均检测到AVNV,检测的AVNV数量也均在8月份达到峰值,沙子口海区每升海水中浮游生物携带4.11×10⁶拷贝的AVNV,桑沟湾海区浮游生物携带1.49×10⁵拷贝的AVNV。两个海区3个粒径浮游生物组分携带AVNV的数量从高到低依次为0.22~3 μm组分、3~ 25 μm组分和大于25 μm组分,但两个水层(50和300 cm)浮游生物携带AVNV的数量则没有显著差异。结合养殖期间扇贝摄食浮游生物的特点,研究认为,扇贝在养殖期间可能会通过滤食携带病毒的浮游饵料而感染AVNV,海区浮游生物可能是导致AVNV流行的重要传播媒介。     

扇贝养殖海区中小型浮游生物携带AVNV的荧光定量检测

为了解中小型浮游生物与扇贝急性病毒性坏死症(AVND)的流行传播关系,于2009年对青岛流清河与荣成桑沟湾2个不同扇贝养殖海区的浮游生物进行了采样调查,利用荧光定量PCR(Fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)技术对所采集样品携带急性病毒性坏死病毒(AVNV)的情况进行了定量检测.结果表明,2个扇贝养殖海区的浮游生物样品均检测到AVNV,而且不同粒径的浮游生物携带AVNV载量有差异(P<0.05):小于200目粒径的浮游生物携带AVNV载量最大,达到9.45×106 copy/mg (DNA)； 60～200目粒径的浮游生物次之,大于60目粒径的浮游生物携带量最少,仅为5.81×104 copy/mg(DNA).在上述2个扇贝养殖海区,均在8月份检测到浮游生物携带AVNV.该结果与栉孔扇贝夏季大规模死亡在时间上是吻合的.结论认为,中小型浮游生物可以携带AVNV,并有可能在扇贝急性病毒性坏死症的流行和传播中起到传播媒介的作用.     

扇贝养殖海区浮游生物及大型海藻携带AVNV病毒的检测分析

为了解扇贝养殖海区浮游生物及大型海藻与急性病毒性坏死症病毒(AVNV)流行传播的关系,本研究于2008年和2009年从青岛沙子口和荣成桑沟湾2个养殖海区采集水样,离心收集浮游生物并随机采集大型海藻,采用荧光定量PCR(FQ-PCR)技术对这些样品携带AVNV情况进行检测。结果显示,沙子口海区8月份的浮游生物样品中检测到AVNV,每升海水中浮游生物携带的病毒数量为6.92×105拷贝;桑沟湾海区4月份的浮游生物样品也检测到AVNV,每升海水中浮游生物携带的病毒数量为1.26×103拷贝。从青岛沙子口海区随机采集的10种大型海藻中有7种[包括孔石莼(Uiva pertusa)、浒苔(Enteromorpha prolifera)、细毛石花菜(Gelidium crinale)、缘管浒苔(E.Linza)、海膜(Halymenia floresia)、扁江蓠(Gracilaria textorii)、刚毛藻(Cladophora)]检测到病毒,带毒样品占到检测样品总数的55.56%,其中在12份孔石莼样品中,11份样品检测到病毒,携带病毒数量最高为7.68×104/0.1(g2009年8月25日)。从荣成桑沟湾海区采集的14种大型海藻样品中有3种(包括孔石莼、海膜和马尾藻)检测到病毒,带毒样品占到检测样品总数的20.83%,其中2009年7月采集的孔石莼样品携带病毒数量最高,为3.06×103/0.1g。这一结果说明海区浮游生物及部分大型海藻均可携带AVNV,而摄食携带病毒的浮游生物可能是扇贝感染发病的原因,有关大型海藻携带AVNV在该病原流行传播中的作用还有待进一步研究。     

应用DGGE技术分析流清河湾扇贝养殖海区细菌群落结构的季节变化

细菌是海区生态环境的重要组成部分,为了解扇贝养殖海区细菌群落结构的季节性变化,连续11个月(2009年5月—2010年4月,2月除外)定期采集青岛流清河湾扇贝养殖海区水深0.5 m处水样,过滤收集粒径0.22～3.00μm的微生物,采用CTAB法提取样品总DNA,PCR扩增细菌16S rDNA V3-V5可变区序列,并通过DGGE技术对所得序列进行分离,结果共得到36条不同位置的条带,1月份水样细菌群落条带数最为丰富,3月份水样的细菌群落条带数最少。基于各月份DGGE条带数目和相对光密度,对11个月份样品的细菌群落多样性进行UPGMA聚类分析,结果表明,3、4和5月份细菌群落多样性具有较高的相似性,优先聚为一支,其余月份中,7月和8月,9月和12月,10月和11月分别优先聚为一支,而1月份和6月份均单独分为一支。剪切DGGE图谱中的20条主要谱带重扩增、测序,并进行BLAST比对。结果表明,20条序列与已知序列的相似性均在94%以上,这20条序列所代表的细菌分属于α-变形菌亚门(α-Proteobacteria)、β-变形菌亚门(β-Proteobacteria)、γ-变形菌亚门(γ-Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobia)。     

大冶湖和朱婆湖中微型和超微型真核浮游生物多样性研究

应用常规浮游生物调查策略以及18S rRNA的V4可变区进行高通量测序,并结合实时荧光定量PCR技术以及相关统计学分析方法,在大冶湖和朱婆湖分别选取6个和3个采样站位,于2017年春季(4月)对两个湖泊中粒级5~20μm的部分微型(Nano粒级,2~20μm)和超微型(Pico粒级,≤5μm)真核浮游生物的多样性进行初步探究。结果表明,大冶湖超微型真核浮游生物物种相对丰度最高的是隐藻门种类(约占OTU总数的28%),5~20μm的部分微型真核浮游生物物种相对丰度最高的分别是纤毛虫(约19%)和绿藻门种类(约18%);朱婆湖超微型真核浮游生物物种相对丰度最高的分别是纤毛虫(约23%)和顶复门种类(约23%),5~20μm的部分微型真核浮游生物物种相对丰度最高的是硅藻门种类(约33%)。大冶湖和朱婆湖中,两种粒级真核浮游生物的多样性之间均存在显著性差异,且大冶湖的真核浮游生物多样性高于朱婆湖。大冶湖超微型真核浮游生物多样性高于5~20μm的部分微型真核浮游生物,朱婆湖两粒级真核浮游生物多样性无显著性差异。大冶湖中的超微型真核浮游生物种类最为繁多,生物多样性最高。与真核浮游生物自身粒级大小的影响相比,水环境差异可能是影响真核浮游生物多样性更为重要的因素。     

两个海区栉孔扇贝感染AVNV的比较分析

急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)是一种能导致栉孔扇贝大规模死亡的DNA病毒,研究通过检测不同养殖模式和不同苗种来源的栉孔扇贝样本携带AVNV的情况,以寻找合理的养殖模式和苗种,降低疾病的发生。以扇贝单一养殖的青岛流清河海区和贝藻间养的荣成桑沟湾海区为采样点,每月(2010年3月—2011年4月)定期采集2个海区野生苗养殖和人工苗养殖的栉孔扇贝样品各10只,共得到扇贝样本480只。取扇贝外套膜组织,提取DNA,采用巢式PCR检测扇贝感染AVNV的情况,并对2个海区2类栉孔扇贝AVNV感染率进行比较。结果显示,在2个海区的2类栉孔扇贝体内均检测到AVNV,流清河海区野生苗和人工苗养殖栉孔扇贝AVNV感染率分别为21.1%和18.9%,桑沟湾海区2类扇贝AVNV感染率分别为11.1%和5.6%;2个海区AVNV感染扇贝均集中在7、8月份,其中,流清河海区最高可达80%,桑沟湾海区最高仅40%。研究表明,贝藻间养和选用人工苗能有效减少AVNV对养殖扇贝的感染,是控制养殖扇贝发病死亡的有效措施。     

主要浮游微藻携带急性病毒性坏死症病毒(AVNV)的研究

研究常见浮游微藻对栉孔扇贝“急性病毒性坏死症病毒”(AVNV)的黏附和携带,探讨微藻作为病毒水平传播媒介的可能性,进而了解AVNV的水平传播途径。我们选取培养17种海区常见浮游微藻,在微藻生长的指数增长期混入AVNV病毒粗提液,用PCR等分子检测法定期对试验微藻携带AVNV的情况进行检测。实验结果表明,亚心形扁藻、小球藻、绿色杜氏藻、四爿藻、中肋骨条藻和小新月菱形藻可以在一定时间内携带AVNV,占到实验微藻总数的35.3%。用携带AVNV的6种微藻投喂试验栉孔扇贝以分析其致病力,结果表明,试验扇贝表现出典型的急性病毒性死亡症状,在试验的9 d时间内,6组感染组试验扇贝的累积死亡率均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于对照组,表明携带AVNV的微藻具有显著的致病性。本研究的结果表明,栉孔扇贝通过摄食携带AVNV的微藻而感染发病是可能的,浮游微藻可能是AVNV水平传播的重要传递体。     

栉孔扇贝消化盲囊细菌群落组成的季节变化分析

为分析栉孔扇贝消化盲囊内细菌群落组成及其季节变化,于2009年6月—2010年6月(2月份除外)定期从青岛沙子口流清河湾扇贝养殖海区采集养殖的2龄栉孔扇贝,采用SDS方法提取消化盲囊的总DNA,并通过引物358f和907r采用PCR扩增细菌16S rDNA的V3～V5区序列,利用变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)分离所得扩增序列。DGGE图谱显示,12个月份的样品共有不同位置的谱带11条,其中9条谱带作为共有谱带在所有月份的栉孔扇贝消化盲囊中均有分布,占总谱带数的81.82%,表明整个养殖季节栉孔扇贝消化盲囊内的细菌群落组成相对稳定。对11条DGGE条带进行切胶回收、PCR扩增、纯化、克隆后测序,其中9条谱带克隆测序成功。经BLAST比对搜索,结果显示9条序列与NCBI数据库中的序列相似性达97%～99%,所代表的细菌分别属于4大类群,变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)和放线菌门(Actinobacteria);NCBI数据库中与其相近的细菌主要为马赛菌属(Massilia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、聚球藻属(Synechococcus)、红球菌属(Rhodococcus)和未培养菌。     

用18S rRNA高通量测序分析比较万峰湖丰水期和枯水期生物多样性

为了比较贵州省黔西南州万峰湖丰水期和枯水期真核浮游生物的多样性,分别于2020年丰水期(11月)和2021年枯水期(5月)对兴义市万峰湖进行2次共计20个地点进行采样,采用18S r RNA高通量测序技术研究其群落组成。结果表明：序列多样性和丰度分析显示,丰水期OTUs平均为325个,枯水期OTUs平均198个,丰水期物种的丰度比枯水期丰富,而群落分布多样性和物种均匀度均低于枯水期。通过两次调查,丰水期真核浮游生物主要由节肢动物门、绿藻门和壶菌门等23个门,枯水期主要由绿藻门、节肢动物门、轮虫动物门等16门的生物组成。其中,丰水期的优势物种为节肢动物门,枯水期优势物种为绿藻门。在种的水平上,丰水期由147种生物组成,枯水期由187种生物组成,两个时期均有的物种有马索隐藻、拟蛋白核隐藻和光滑鱼鳞藻等,丰水期的优势物种为右突新镖水蚤、甲藻和马索隐藻;枯水期的优势物种为真镖水蚤、马索隐藻和拟二叉角甲藻。研究表明,万峰湖丰水期和枯水期真核浮游生物群落组成和多样性存在显著差异。通过分析浮游生物群落、优势种、浮游生物丰度、多样性指数和均匀度指数分析,评价万峰湖的水质状况,为研究喀斯特水体中生物多样...     

栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒巢式PCR检测方法的建立

为更好地实现对养殖海区栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)的快速诊断和分子流行病学的调查,以及AVNV的疫情监测,选择AVNV全基因组序列中的保守区段,应用Accelrys gene 2.5软件设计一对巢式引物,用于AVNV的检测.结果显示,引物的扩增片段分别为979和548 bp.实验优化了PCR体系中Mg2+和dNTPs浓度及扩增程序中的退火温度,并建立了完善的AVNV巢式PCR检测技术.研究表明,该PCR检测技术具有较高的敏感性,可稳定检测出5 pg扇贝样品组织总核酸中5×10 copies的病毒粒子.     

沿海滩涂异育银鲫养殖池塘真核浮游生物群落DNA指纹结构与理化因子的关系

为研究沿海滩涂异育银鲫养殖池塘浮游生物群落周年变化及其与理化因子的关系,2011年每月采集养殖池塘水样,测定相关理化因子。采用18s rDNA PCR-DGGE技术对真核浮游生物群落多样性进行了分析。运用CCA方法分析了真核浮游生物与理化因子的关系。结果表明:TP含量为0.17~1.12 mg/L,7月出现峰值。PO4-P含量为0.04~0.30 mg/L,7月和8月较高。NO2-N含量为0.02~0.57 mg/L,12月最高。NH+4-N含量为0.20~2.37 mg/L,5月出现峰值。NO3-N含量为0.04~10.47 mg/L,11月出现峰值。DGGE结果显示,1—12月共有73条谱带,平均每月谱带数为24.67。5月、6月、8月和9月份多样性指数较高。谱带匹配后聚类分析表明:除3月、7月和11月份外,真核浮游生物变化具有季节性,其中8月、9月和10月聚为一支,4月、5月和6月聚为一支,1月、2月和12月聚为一支。CCA分析表明,温度、TP和NH+4-N与真核浮游生物群落结构组成显著相关,为养殖生态调控和养殖模式优化提供理论依据。     

栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒（AVNV）卵内的垂直传播途径

急性病毒性坏死病毒已被证实为是一种对养殖栉孔扇贝危害极大的病原体，探讨其传播途径是防控扇贝“大规模死亡症”的前提之一。将亲贝各放在一独立育苗水体内产卵、孵化，并进行幼虫培育。通过春季和秋季室内人工育苗，从40个独立育苗水体中，采获亲贝、卵各23个家系样品，受精卵、D形幼虫、壳顶幼虫各12个家系样品，眼点幼虫2个家系样品。采用间接ELISA法、间接免疫荧光技术和电子显微镜技术对亲贝、卵和发育各期的幼虫进行定性和定位的检测。结果发现，栉孔扇贝的性腺组织中存在病毒粒子，而卵、受精卵及各期发育幼虫体内均未检测到病毒。由此可以判断：AVNV可以感染栉孔扇贝的性腺，但并不存在卵内垂直传播的可能性。     

间接免疫荧光法检测栉孔扇贝急性病毒性坏死症病毒

用纯化栉孔扇贝(Chlamys farrei)急性病毒性坏死症病毒(AVNV)免疫兔子,以兔抗血清为一抗,荧光标记的羊抗兔抗体为二抗,采用冰冻切片技术,建立了栉孔扇贝AVNV的间接免疫荧光检测方法。用该方法分析栉孔扇贝和海湾扇贝(Argopecten irradians)体内AVNV感染强度,并对感染率进行统计。结果表明,栉孔扇贝的肾脏、肝胰腺中,AVNV阳性信号最强,呈现中度到重度感染,其AVNV感染率100％。鳃丝、性腺及闭壳肌中未检测到阳性信号。在海湾扇贝的肝胰腺及肾中AVNV的感染率也较高。提示AVNV感染扇贝的靶器官主要是肾脏、肝胰腺。对与栉孔扇贝同一海区养殖的海湾扇贝在栉孔扇贝发病期间存活率较高的原因进行了讨论。     

厦门近岸滩涂底泥中微型真核生物的群落结构及其对双齿围沙蚕扰动的响应

为研究厦门近岸潮间带滩涂底泥中微型真核生物的群落结构及其对双齿围沙蚕扰动的响应,采用PCR-DGGE技术对室内模拟沙蚕生物修复过程中微型真核生物的群落结构及动态变化进行了研究。结果显示,集美滩涂底泥中微型真核生物主要分为后生动物(包括6个门:颚口动物门、环节动物门、线虫动物门、节肢动物门、软体动物门和腹毛动物门),丝足虫门,硅藻门和囊泡虫总门(又分为纤毛虫门和甲藻门)。其中囊泡虫总门的纤毛虫门为优势类群。后生动物中的线虫门为次优势类群。Peridinium quinquecorne(属于囊泡虫总门中的甲藻门)是普遍存在的优势物种。DGGE图谱聚类分析表明播种双齿围沙蚕的处理组样品中微型真核生物的群落结构聚为一支,并与未播种沙蚕的对照样品分开。研究表明,播种双齿围沙蚕对微型真核生物群落结构造成了一定的影响。沙蚕的处理组检测到了更多的线虫动物门,可能是因为双齿围沙蚕的活动促进了这些类群的生长。     

浮筏养殖虾夷扇贝的自然稀疏效应

为了研究虾夷扇贝浮筏养殖自然稀疏效应和科学养殖密度,2009年8月—2010年7月,对不同密度梯度的3个贝龄虾夷扇贝进行浮筏养殖现场实验。在自然稀疏条件下,逐月调查浮筏养殖不同贝龄的虾夷扇贝壳长生长、湿重增长和累计死亡率,并估算了适宜的扇贝浮筏养殖密度。结果表明,在不同养殖密度条件下,3 个贝龄扇贝周年壳长生长都没有显著差异;1龄贝壳长增长最快,年均增长29.53 mm;2龄贝壳长年均增长23.50 mm;3龄贝壳长增长较慢,年均增长15.47 mm;3个贝 龄扇贝周年湿重增长都没有显著差异,3龄贝和2龄贝湿重增长较快,3龄贝的年均增长约54.07 g,2龄贝的年均增长约37.80 g,1龄贝的年均增长约14.69 g;2 龄贝、3龄贝各养殖密度梯度之间累计死亡率都没有显著差异,3龄贝死亡率介于76.30%～83.33%,2龄贝死亡率介于88.89%～91.78%,养殖密度为150个/层的1龄贝与80个/层和50个/层的1龄贝累计死亡率差异显著。依据自然稀疏模型,浮筏养殖适宜密度3龄贝为4～5个/层;2龄贝为8～16个/层,1龄贝为29～124个/层。     

急性病毒性坏死病毒dUTPase基因的克隆、表达及其产物的酶学活性分析

根据已测定完成的栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)基因组序列,设计特异性引物,以提取的发病扇贝组织总DNA为模板,PCR扩增得到编码AVNV dUTPase的开放阅读框ORF074,将产物克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建表达质粒pET32a-dut。然后,将其转化至E.coli BL21(DE3)进行诱导表达。SDS-PAGE检测显示,诱导表达蛋白分子量约为46 ku,与预期表达蛋白大小一致。经Western-blotting及质谱分析鉴定,所表达蛋白即为重组dUTPase。表达产物经Co²⁺柱纯化后进行酶学活性测定。结果显示,重组dUTPase能特异性催化dUTP,EDTA可以抑制dUTPase的活性,而Mg²⁺可以增强其活性。