草鱼出血病病毒VP6蛋白的原核表达、纯化及免疫效果

为了探讨草鱼出血病病毒(GCRV)VP6亚单位疫苗对草鱼出血病的免疫保护作用,将vp6基因克隆进原核表达载体pET-28a(+),构建了重组质粒pET28a(+)-VP6。SDS-PAGE和Western-blotting显示,重组VP6蛋白的分子量约为43 ku,主要以包涵体形式存在,重组蛋白占菌体总蛋白的20%左右;Ni2+柱纯化后的重组蛋白,以每尾500μg肌肉注射免疫草鱼(14～20 cm,60～120 g),并在第14、21、28、49、70天通过间接凝集反应检测抗体水平,结果显示,免疫注射后第14天可检测到鱼体产生的特异性抗体,第21天达到最高峰,第70天仍可检测到抗体的存在;免疫注射第21天人工接种GCRV,免疫后的草鱼对出血病的保护力达100%。     

草鱼出血病基因疫苗的免疫效果

为探讨含有草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP6基因的重组基因疫苗对草鱼出血病的免疫效果，将重组基因疫苗分别配制为10、30和60μg三个梯度，同时设30μg pFastBacTMDual空载体组，均以等体积的氢氧化铝佐剂为免疫增强剂，对草鱼进行注射，以未经处理的草鱼作为对照组。定期采血测定抗体效价，最后对各组草鱼进行攻毒试验并计算死亡率和免疫保护力。结果显示：注射疫苗的三组草鱼均产生抗体，10μg组效价为1：6～1：11；30μg组为1：9-1：13；60μg组为1：11-1：17，且各组效价均在第28天测定最高，免疫保护率依次为100％、100％和95％，而空载体组和对照组为70％和0％。研究表明，疫苗能够诱导草鱼产生免疫反应，为草鱼出血病核酸疫苗的生产应用和产业化提供了重要的理论依据。     

草鱼呼肠孤病毒VP7基因核酸疫苗的构建及免疫效果

将草鱼呼肠孤病毒( GCRV)外衣壳蛋白VP7双基因(约0.9 kb)及团头鲂的β-肌动蛋白启动子(约0.56 kp)经扩增并鉴定正确后,克隆至基因转移载体pFastBacTM Dual中,获得重组质粒pFastBac-β-VP71 -VP72,以此研究草鱼免疫实验及免疫效果.重组质粒按10、30、60μg分为3组,同时设30 μg空载体组及对照组.于免疫后第14、21、28、49天通过RT-PCR检测VP7的转录水平、间接凝集反应测定抗体水平及攻毒试验检测免疫保护效果.结果显示,pFastBac-β-VP71 -VP72导入鱼体后,VP7基因在β-肌动蛋白启动子的驱动下持续表达,至第49天仍能检测到目的基因的转录；各免疫组均有抗体产生,抗体效价在免疫后第21天达到最高,攻毒后10、30、60 μg核酸疫苗免疫组死亡率分别为0％、0％、5％,而空载体组和对照组分别为30％和100％,表明pFastBac-β-VP71-VP72作为核酸疫苗对草鱼病毒性出血病有较好的免疫保护效果.研究结果为草鱼呼肠孤病毒核酸疫苗的研发与生产应用奠定了基础.     

草鱼呼肠孤病毒HZ08株抗体IPMA检测方法的建立及应用

为建立一种检测草鱼呼肠孤病毒HZ08株(HZ08)抗体的免疫学方法,本实验以接种HZ08病毒的细胞培养板为抗原板,以免疫弱毒疫苗的草鱼血清为抗体,通过反应条件优化,建立了检测GCRV HZ08血清抗体的免疫过氧化物酶单层细胞实验(IPMA)方法,并对该方法特异性、敏感性、重复性、与ELISA检测结果的符合率及对临床血清样品的检测效果等进行了验证。结果显示,HZ08株种毒按照1×103拷贝/μL浓度接种后72h固定,HRP-Ig G二抗1∶1000稀释,待检血清1∶100稀释时效果最佳;该IPMA方法与草鱼阴性血清、免疫细菌三联疫苗的草鱼血清、感染GCRV JX0901(GCRVⅠ型)的草鱼血清无交叉反应;GCRV HZ08株阳性血清稀释至1∶800时仍能检出;批内和批间重复性实验显示,该方法具有良好的重复性;符合性实验结果显示,该IPMA方法与ELSIA方法的阳性和阴性符合率分别为95.7%和87.5%;用建立的IPMA方法检测草鱼出血病弱毒疫苗免疫草鱼,免疫2周后抗体水平达到峰值;对现地送检的126份草鱼血清样本进行检测,平均检出阳性率为72.2%。研究表明,建立的HZ08株IPMA方法特异性强、重复性好、敏感性高,为GCRVⅡ型的流行病学调查、疫苗免疫效果评价及抗原抗体检测提供了一种有效的检测手段。     

vp28重组核酸疫苗对凡纳滨对虾抗WSSV感染的免疫反应和保护效果

利用改构的pEGFP-N1-ie1强启动子载体构建含vp28基因的核酸疫苗,通过肌肉注射和饲料添加的形式免疫对虾,分析各实验组相对保护率和免疫基因(Dicer,Argonaute,STAT和Lyzome)表达,研究构建vp28重组核酸疫苗对凡纳滨对虾的保护效果。RT-PCR结果表明,注射和口服vp28组均可在对虾鳃组织中检测到vp28基因表达。在注射组中vp28的相对保护率为22.4%,饲料免疫组中vp28的相对保护率可达到36.84%。相对于对照组,vp28的注射组的STAT基因和Dicer基因表达量于第7天达到最大值。Argonaute基因表达量于第3天达到最大值,以后呈下降趋势。溶菌酶基因表达量一直呈相对较高的趋势。vp28的饲料投喂组的STAT基因和Argo-naute基因表达量于第7天达到最大值,以后呈下降趋势。Dicer基因表达量第3天达到最大值。实验结果表明,构建的vp28核酸疫苗在对虾抗WSSV防治中具有潜在应用价值。     

传染性造血器官坏死病核酸疫苗的构建及其抗性基因对环境细菌抗性的影响

本研究以传染性造血器官坏死病毒(infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)分离株XJ-13为研究对象,克隆其糖蛋白(glycoprotein,G)基因并连接到商业化载体pcDNA3.1(+),成功构建了真核表达载体pIHNxj-G。为了检测该载体作为核酸疫苗的可能性,本研究以2μg/尾的剂量采用背鳍基部注射免疫虹鳟(Oncorhynchus mykiss)鱼苗[(5±0.5)g]。在免疫后第4天及第30天,以100 TCID_(50)的剂量利用IHNV-XJ-13对虹鳟进行腹腔注射攻毒;在免疫后第4天及第7天,利用Real-time PCR技术检测虹鳟头肾及接种部位肌肉组织Mx-1基因表达情况;在免疫后第4天及30天检测虹鳟血清IHNV中和抗体效价;在免疫后65 d内,分别于不同时间点采集循环水池里的粪便、水以及虹鳟的肠内容物,进行氨苄青霉素抗性菌的分离鉴定。攻毒试验结果显示,核酸疫苗在免疫后第4天和第30天的相对保护率均高于90%;Mx-1基因检测结果显示,Mx-1基因在头肾和接种部位肌肉中均显著上调表达;中和抗体效价测定结果显示,在免疫后第4天,所有血清中均不存在中和抗体(效价均20);而在免疫后第30天,10尾虹鳟中有8尾血清中存在中和抗体,最高效价为160;抗性菌分离结果显示,分离到的氨苄青霉素抗性菌均是天然具有氨苄青霉素抗性的气单胞菌(Aeromonas sp.)和柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.),并未分离到包括大肠杆菌在内的任何具有氨苄青霉素抗性的指示菌,且实验组和对照组的氨苄青霉素抗性菌的种类和数量均没有发生统计学意义的改变。本研究提供了具有良好保护效果的IHN核酸疫苗,并为IHN核酸疫苗的安全评价提供了基础数据。     

传染性造血器官坏死病核酸疫苗的构建及其在虹鳟接种部位的消长规律

本研究将传染性造血器官坏死病病毒(infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)分离株SD-12糖蛋白(glycoprotein,G)基因克隆进商业化载体pc DNA3.1(+),构建了IHNV G的表达载体,即传染性造血器官坏死病(infectious hematopoietic necrosis,IHN)核酸疫苗,命名为p IHNsd-G。采用背鳍基部肌肉注射的方式,以2μg/尾的剂量免疫虹鳟(Oncorhynchus mykiss)鱼苗(5.0±0.5)g。于免疫后第4天及第7天,利用real-time PCR技术检测免疫虹鳟头肾及接种部位肌肉组织Mx-1基因表达情况;于免疫后第21天,以100倍半数组织培养感染剂量(tissue culture infective dose,TCID50)采取腹腔注射的方式进行攻毒实验,计算核酸疫苗相对保护率(relative percent survival,RPS);于免疫后第60天及150天检测免疫虹鳟血清IHNV中和抗体效价;最后,以p IHNsd-G的启动子序列和氨苄青霉素抗性基因序列为目标基因,利用PCR方法监测p IHNsd-G在免疫虹鳟接种部位的动态分布情况。结果显示:Mx-1基因在头肾和接种部位肌肉中均显著上调表达,并且在接种部位肌肉组织中明显高于同一时间点的头肾组织;攻毒实验中p IHNsd-G对虹鳟的相对保护率高达94.4%;而在免疫后第60天,所有免疫虹鳟血清中均存在中和抗体,其最高效价高达320,在免疫后第150天,最高抗体效价为80,自此,说明已成功获得有效的IHN核酸疫苗。p IHNsd-G在虹鳟接种部位的PCR监测结果显示:在免疫后的第1天即可在注射部位的肌肉中检测到全部p IHNsd-G目标片段,在第84天时已经无法从注射部位肌肉中扩增出全长氨苄青霉素抗性基因,而所有目标基因在第150天时均消失不见。本研究在成功构建IHN核酸疫苗并系统地验证了其有效性的基础上,开展了该疫苗在接种部位的动态分析研究,为IHN核酸疫苗的研发和安全性评价研究提供了基础数据。     

草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型VP6蛋白多克隆抗体制备及其特异性分析

为了制备高效的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型VP6蛋白多克隆抗体并对其特异性进行鉴定,实验以草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型HZ08株为模板,采用PCR方法扩增S9基因,将该S9基因与p ET-32a(+)载体连接构建p ET-32a-S9原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)后用IPTG诱导表达;纯化后的重组VP6蛋白免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,使用间接ELISA方法测定抗体效价,Western blot和IFA试验鉴定抗VP6蛋白多克隆抗体特异性。结果显示草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型的S9基因在原核表达载体中能够正确地表达VP6蛋白,纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备的抗VP6多克隆抗体,经间接ELISA方法测定其效价约为1∶105,Western blot和IFA试验结果显示制备的多克隆抗体能特异性识别GCRVⅡ型毒株,而不能识别GCRV I型、Ⅲ型以及其它病毒,表明该多克隆抗体具有较高的特异性。研究表明制备的抗VP6蛋白多克隆抗体能够特异性识别GCRVⅡ型病毒,为GCRVⅡ型病原学研究及草鱼出血病临床诊断奠定基础。     

草鱼出血病细胞培养弱毒疫苗的最小免疫量、免疫期和保存期

草鱼出血病细胞培养弱毒疫苗对草鱼的最小免疫最为稀释１０＾３倍、０．２ｍｌ／尾。免疫产生期为疫苗注射后的第２天；免疫保护期达１５个月。     

草鱼出血病细胞培养弱毒疫苗的最小免疫量、免疫期和保存期

草鱼出血病细胞培养弱毒疫苗对草鱼的最小免疫量为稀释10∧3倍，0.2毫升/尾，免疫产生期为疫苗注射后的第2天；免疫保护期达15个月。弱毒疫苗的保存期为-30℃30个月、-10℃24个月，4℃8个月，15-20℃1个月左右。     

In vivo antiviral efficacy of moroxydine hydrochloride against grass carp reovirus and the drug safety assessment

Our previous studies have verified that moroxydine hydrochloride (Mor) could inhibit replication of grass carp reovirus (GCRV) and suppress apoptosis of Ctenopharyngodon idella kidney cells, but be lack of information whether exists on antiviral activity in vivo. The paper was undertaken to explore the antiviral response of Mor against GCRV in grass carp and investigate the safety of drug for aquatic organisms. The results showed that injection treatment of Mor could more effectively inhibit GCRV replication than immersion administration. All the RNA systheses of vp3 and vp6 on day 7 in head kidney, gill, hepatopancreas and dorsal muscle in the Mor injection group were lesser than 0.07‐fold than that of in control group. And the GCRV‐inducing grass carp mortality was effectively controlled within 7 days post Mor injection therapy. Additionally, the reduction of superoxide dismutase activity, total antioxidant capacity and catalase activity in serum was effectively controlled by Mor. Moreover, drug safety assessment results showed that 500 mg/L of Mor was safe to C. idella, Bacillus subtilis, Chlorella vulgaris and Tetrahymena thermophila, which was far higher than the therapeutic concentration. The present study proved Mor as harmless formulations or products had potential value in the control of GCRV in aquaculture, with the advantage of super in vivo antiviral activity and environmental safety.     

Growth and performance of Atlantic salmon, Salmo salar L., following administration of a rhabdovirus DNA vaccine alone or concurrently with an oil-adjuvanted, polyvalent vaccine

This research demonstrates for the first time an absence of growth-related side effects in Atlantic salmon, Salmo salar L., following the injection of a DNA vaccine alone or concurrently with a commercially available, polyvalent, oil-adjuvanted vaccine. Using weight and specific growth rate measurements, individually tagged Atlantic salmon were monitored for 2028 degree days (dd) post-vaccination. During this time, DNA-vaccinated fish did not differ in weight, length, condition factor or specific growth rate compared to unvaccinated control fish. While differences in weight were observed between unvaccinated control and concurrently vaccinated fish, there were no significant differences in weight, length, condition factor or specific growth rate between concurrently vaccinated fish and adjuvant-vaccinated fish, suggesting that only adjuvant vaccination affected growth. To further determine if concurrent injection of a DNA vaccine and a polyvalent, oil-adjuvanted vaccine had a physiological impact on the Atlantic salmon, swimming performance tests were performed at 106 dd post-vaccination with U _crit,1, U _crit,2, the U _crit recovery ratio (RR) and the normalized RR being similar to values obtained from unvaccinated control fish. In summary, this study shows that concurrent injection of a DNA vaccine and a polyvalent, oil-adjuvanted vaccine does not negatively influence the growth or swimming performance of Atlantic salmon compared to adjuvant vaccination alone.     

初探母源免疫处理草鱼母本及其子代5种免疫因子含量的周年变化规律

为探究草鱼母源免疫因子传递特性,本实验借助ELISA和qPCR技术分别检测分析了GCRV弱毒疫苗免疫草鱼母本及其子代（即母源免疫子代）早期胚胎阶段至一龄期间5种免疫因子（IgM、C3、LZM、MBL和Bf）蛋白活性和基因表达水平的周年变化规律。结果显示,草鱼母本经GCRV弱毒疫苗免疫后,血液中5种免疫因子蛋白活性及基因表达水平在产卵期均显著高于对照组1.5倍以上,至免疫后第11个月与对照组无显著差异。母源免疫子代发育至水花（4 d）时,IgM、C3、MBL和Bf的基因表达水平均高于对照组;发育至乌仔（15 d）时,IgM、C3和Bf的蛋白活性水平均略高于对照组;发育至5~11月龄时,5种免疫因子在肝脏、脾脏、肾脏和头肾等免疫器官中仍存在高表达。研究表明,GCRV弱毒疫苗促使母源免疫因子在亲本和子代体内富集表达具有一定的时效性,最长可维持至11个月,为实际生产中草鱼母本疫苗免疫程序的制定提供参考依据。     

GCRV弱毒疫苗免疫草鱼母本的免疫因子代间传递与表达特性

为探究GCRV弱毒疫苗母源性免疫的草鱼母本及其子代免疫因子(IgM、C3、LSZ)表达特性及代间传递效应,采用ELISA、Rt-q PCR等方法检测了草鱼母本产前40 d接种疫苗后,母本血液、子代早期发育阶段及2月龄幼鱼3种免疫因子的蛋白活性及基因表达水平。结果显示,经GCRV弱毒疫苗免疫的草鱼母本血液、早期胚胎及幼鱼阶段IgM蛋白活性均显著高于对照组样品。子代各阶段中,28日龄的夏花样品IgM蛋白活性水平最高,而5日龄水花样品中蛋白活性最低;从受精卵发育至3日龄水花阶段,实验组样品免疫因子C3和LSZ的蛋白活性均显著高于对照组;2组鱼中IgM、C3和LSZ蛋白的活性水平随着发育进行,总体上呈先下降后升高的趋势,从卵细胞至3日龄水花阶段实验组样品C3和LSZ蛋白活性水平均显著高于对照组。实验组和对照组受精卵IgM基因的表达水平差异最大,实验组表达量为对照组的3.4倍。从24 h器官形成期至3日龄水花样品中,实验组C3基因的表达水平显著高于对照组。从卵细胞至3 h囊胚期阶段,实验组LSZ基因表达水平显著高于对照组。实验组2月龄草鱼体肾、头肾、脾脏组织中IgM基因表达量均显著高于对照组;感染GCRV病毒后,实验组死亡尾数(2尾)低于对照组死亡尾数(5尾)。研究表明母源性免疫可在草鱼进行代间传递,并对子代起到一定程度的免疫保护作用。     

草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白在毕赤酵母中表达的初步研究

根据GeneBank中草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)104株VP6蛋白的全基因序列(HM234682)设计一对特异引物,以提取的GCRV-104核酸为模板,采用RT-PCR技术扩增VP6蛋白编码基因,并将其克隆到含强启动子AOXⅠ的毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZB上。重组酵母质粒pPICZB-VP6经SacⅠ线性化,电击转化到毕赤酵母KM71菌株中,Zeocin抗性平板上筛选高拷贝转化子。阳性转化子在30℃,0.5%(V/V)的甲醇添加量的条件下,连续诱导3 d,表达产物经SDS-PAGE和Western-Blotting检测,结果表明成功实现了GCRV-104 VP6蛋白在毕赤酵母中的胞内表达,重组VP6蛋白相对分子质量约46 000,与天然VP6蛋白相对分子质量接近,并且可与鼠抗草鱼GCRV-104 VP6蛋白的多克隆抗体特异性结合。     

草鱼病毒性出血病研究进展

草鱼出血病是严重困扰着草鱼养殖业发展的一大疾病。根据近几十年来对于该病研究的进展,就草鱼出血病病原的生物学特性、不同发现株之间的比较、分子生物学研究以及疾病的防治等方面进行综合评述,总结了草鱼出血病的研究现状及研究中亟待解决的问题,并提出了该领域以后的重点研究方向。为进一步深入开展对该病的防治研究提供参考,以提高草鱼养殖的生产率。