我国一株新型黄头病毒的分子流行病学

为查明黄头病毒(Yellow Head Virus,YHV)在我国的存在和变异情况,本研究采用世界动物卫生组织(OIE)《水生动物诊断手册》中YHV套式RT-PCR检测方法对2012-2014年采集的299份样品进行了YHV监测,并对部分YHV阳性样品基因进行了克隆测序及系统发育分析.流行病学调查显示,299份样品中YHV的阳性率为11％,我国养殖的中国明对虾、凡纳滨对虾、日本囊对虾以及罗氏沼虾的部分样品中均检出了YHV,中国明对虾和罗氏沼虾是本次调查中新发现的YHV自然宿主,而且YHV在中国明对虾中的检出率最高.对6份较强阳性样品YHV基因组ORF1b内1002 bp的分型片段进行克隆测序和序列分析,序列比对结果显示,阳性样品的YHV与国外报道的YHV的6个基因型相似度为81.0％-90.5％;系统发育分析显示,6份阳性样品归于同一分支,但与已知YHV的6个基因型均不在同一分支内,其与YHV基因1型(YHV-1)亲缘关系较近.对阳性样品YHV基因组ORF3内编码gp116蛋白的一段序列进行克隆测序,得出其序列长度为509 bp,与YHV-1a的545 bp、YHV-1b的383 bp和YHV-2(即鳃联病毒GAV)的476 bp均不同;依据该片段构建的系统发育树显示,6份阳性样品归于同一分支,与YHV已知的6个基因型不同,与YHV-1亲缘关系较近,且与YHV-1a相似度大于YHV-1b.对其中两份样品的ORF2序列进行比对显示,两份样品序列相似性为99.8％,蛋白序列完全相同,与YHV-1的序列相似度为85.9％,与YHV-2相似性为80.9％.样品调查结果对增补YHV的宿主范围有重要意义;YHV核酸检测和序列比对结果表明,感染我国养殖对虾的YHV为一种新的致病株型.     

超分支滚环扩增试纸检测对虾黄头病毒

依据对虾黄头病毒(Yellow head virus, YHV)的非结构蛋白N 基因序列,设计特异的锁式探针(Padlock probe, PLP)、检测探针及引物,建立YHV 超分支滚环扩增(Hyper-branched rolling circle amplification, HRCA)检测试纸。灵敏度实验显示,YHV HRCA 检测试纸能检测出的最低模板量为101拷贝,是RT-PCR 灵敏度的100倍。特异性实验结果表明,该试纸能够特异性地对YHV 进行检测。利用该检测试纸对进出口80批次虾样本进行检测,并将检测结果与常规RT-PCR 相比较,结果显示,YHV HRCA 检测试纸灵敏度方面优于常规RT-PCR 方法,且操作简便、结果直观易读。     

致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)自然感染三疣梭子蟹

近年来包括急性肝胰腺坏死病(AHPND)在内的多种新发疫病的流行,使我国甲壳类养殖业遭受了严重的经济损失。为了筛查导致山东潍坊某养殖场中一虾蟹混养池塘内患病三疣梭子蟹感染的可能病原,本研究采用分子生物学检测方法,对三疣梭子蟹样品进行了白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、虾血细胞虹彩病毒(SHIV)、致急性肝胰腺坏死病副溶血孤菌(Vp_(AHPND))、虾肝肠胞虫(EHP)、偷死野田村病毒(CMNV)、黄头病毒(YHV)和肝胰腺细小病毒(HPV)等8种病原的检测,并对样品进行了组织病理和原位杂交分析。分子生物学检测结果显示,患病三疣梭子蟹样品呈Vp_(AHPND)阳性,而呈现WSSV、IHHNV、SHIV、EHP、CMNV、YHV和HPV阴性。对样品进行Vp_(AHPND)套式PCR第二轮扩增产物的序列测定、比对和进化树分析,结果显示,扩增产物序列与致病副溶血弧菌质粒上pirA~(vp)毒力基因片段具有99%的同源性,该序列与已报道的多个致病副溶血弧菌PirA聚在进化树的同一主分支上。组织病理学分析显示,患病三疣梭子蟹的肝胰腺小管上皮细胞坏死,心肌纤维呈溶解样病变,鳃丝上皮柱突细胞明显坏死,胸神经节的神经细胞损伤严重,并且这些组织中还可见大量的细胞核固缩现象;原位杂交结果显示,肝胰腺、心肌、鳃组织及胸神经节中的病变部位均存在Vp_(AHPND)探针的蓝紫色杂交信号。以上表明,虾蟹混养池塘中三疣梭子蟹在自然状态下感染了Vp_(AHPND),并导致肝胰腺、心肌、鳃和胸神经节发生了严重病理损伤。本研究首次在养殖三疣梭子蟹中检测到Vp_(AHPND)感染并揭示了感染所致的病理变化,相关结果为揭示Vp_(AHPND)自然宿主种类和养殖三疣梭子蟹病害防控提供了基础信息。     

多重RT-PCR体系检测4种虾病毒的方法

根据多重RT-PCR的技术原理,利用对虾传染性表皮与造血组织坏死症病毒、白斑综合征病毒、黄头病毒和桃拉综合征病毒的基因序列分别设计了4对特异引物,建立多重RT-PCR体系用于虾4种病毒的检测。多重RT-PCR体系能特异地扩增出IHHNV、WSSV、YHV和TSV的目的片段:TSV特异性扩增片段508 bp,WSSV 特异性扩增片段435 bp,IHHNV 特异性扩增片段301 bp 和YHV。特异性扩增片段614 bp。结果表明,多重PCR虾病毒检测系统具有较高的特异性和敏感性,并对其它对虾病原呈阴性。IHHNV、TSV、WSSV和YHV模板在多重PCR虾病毒检测体系中的检测下限分别为0.1,1,0.02和0.2 pg。病毒感染病料检测试验中,该检测体系的检测结果与单纯PCR的检测结果呈现出较好的吻合度。     

南美白对虾的病害防(二)

3.黄头病【病因】该病病原是黄头病病毒,呈杆状,有囊膜,病毒粒子(50～95)纳米×(130～380)纳米,属单链RNA病毒。【症状】病虾早期游动迟缓,头胸甲呈黄色或发白,膨大,鳃变成淡黄色到棕色,肝胰腺变成淡黄色。主要感染鳃组织、淋巴器官、血细胞和结缔组织等。该病毒毒力较强,对虾被感染后3～5天内可全军覆灭。患病虾组织多处坏死。胞核缩小或破裂,核周围细胞质内有嗜碱性的球形包涵体。染毒组织的血窦中有一种独特的数目不等的球形细胞。其胞质嗜碱性、球形胞核居中。【流行及危害】该病首先在印度斑节对虾的精养塘中发现,后在东亚地区的其它…     

现代生物技术检测对虾病毒在商业化应用中的限制

对虾病毒性疾病有多种,如白斑病毒、桃拉病毒、黄头病毒等。多年来,科研人员对病毒病的诊断方法进行了大量的研究,现代生物检测技术得到较多应用,如酶联免疫吸附(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)、核酸探针斑点杂交等．发表了较多提取病毒、改进病毒检测方     

一例日本囊对虾暴发性死亡的病原分析

为了阐明山东省潍坊市一对虾养殖场发生日本囊对虾暴发性死亡的原因,采用分子生物学检测方法,对发病对虾进行了白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)、桃拉综合征病毒(Taura syndrome virus,TSV)、黄头病毒(yellow head virus,YHV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)、传染性肌肉坏死病毒(infectious myonecrosis virus,IMNV)、偷死野田村病毒(covert mortality nodavirus,CMNV)及急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease,AHPND)7种病原的检测,且对发病对虾进行了常规组织病理学观察。同时采用16S r DNA细菌鉴定方法及浸泡回接感染实验对分离自发病对虾体内的可疑病原菌进行了分子鉴定及毒力测试。结果显示,发病对虾样品核酸检测呈现WSSV强阳性,IHHNV和CMNV为弱阳性,其他4种病原为阴性。组织病理学观察发现,在对虾的胃、鳃等上皮组织中存在WSSV包涵体,头部肌肉纤维出现离散。对分离编号为2901、2902、2903的3株优势可疑病原菌鉴定结果显示,3株菌分别与印度格里蒙菌、交替单胞菌及溶藻弧菌相似,相似度分别为99%、99%及100%。攻毒结果显示,3株可疑病原菌的LC50分别为9.8×107、1.1×108与2.3×108 CFU/m L,各细菌毒力均较弱,非导致对虾出现暴发性死亡的病原。研究表明,导致本次日本囊对虾暴发性死亡的病因与混合感染病原WSSV、IHHNV、CMNV有关,其中WSSV感染是造成日本囊对虾暴发性死亡的主因,研究结果可为解析当前养殖日本囊对虾疾病暴发及其成因提供参考。     

台湾发现斑节对虾感染黄头病毒

对斑节对虾进行白点综合病毒（ＷＳＳＶ）分离和提纯实验中，台湾发现了一种意想不到的病毒。病毒棒状，１４０～２００ ｎｍ×３５～５０ ｎm。密度１．１５４～１． １６２ ｇ／ｍｌ，麻醉后发现至少有 ２０、６３、１１０ ＫＤａ ３种病毒结构蛋白质。将此病毒给斑节对虾注射，迅速引起大量死亡。组织病理发现病虾的淋巴、鳃、胃、肝、胰、心脏中均有大量的嗜碱病毒粒子。电子显微镜检查病虾的淋巴器官，观察到许多发育的病毒粒子和核壳，包埋在细胞质泡中。此病毒的形态、组织病理和结构蛋白质与泰国的黄头病毒（ＹＨＶ）近似，ＲＴ—Ｐ…     

微流控芯片技术检测虾四种病原微生物方法的建立

针对虾的白斑综合征病毒、桃拉综合征病毒、黄头病毒和十足目虹彩病毒1的基因保守序列设计LAMP引物,将引物包被于芯片反应槽中,将微流控芯片技术与LAMP等温扩增技术相结合,建立针对这四种病毒的高效准确检测方法。用不同浓度的病毒阳性模板检测了建立的检测方法对4种虾病毒与另1种常见虾病毒的特异性,并对20份阳性和30份阴性虾组织样本的特异性、敏感性和重复性进行了临床对比验证实验。结果表明：本研究方法灵敏度高,特异性强,重复性好,各病毒间无交叉反应,为同时快速检测虾的四种病毒提供了技术手段。     

病例研究：未知病因的凡纳滨对虾溞状幼体的病原和微生物组分析

从某对虾育苗场2个育苗池中分别采集了发生摄食下降、活力降低及死亡率增高等症状的未知疾病的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)溞状幼体3期(Z3)和1期(Z1)的样品。用PCR检测白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病病毒(IHHNV)、急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)、桃拉综合征病毒(TSV)、传染性肌坏死病毒(IMNV)、黄头病毒(YHV)、虾肝肠胞虫(EHP)、偷死野田村病毒(CMNV)和虾血细胞虹彩病毒(SHIV)等9种已知病原为阴性。组织病理学诊断观察到肝胰腺小管上皮细胞内存在不明褐色团块。使用2216E培养基对致病菌分离鉴定，得到2株溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)，浸浴感染悉生卤虫(Artemia franciscana)幼体后的平均存活率分别为58%和83%。采用Illumina HiSeq高通量测序方法对这2个溞状幼体样品中细菌16S rRNA基因的2个高变区(V3~V4)进行总细菌菌群的测序，分析揭示了未知病因病虾中细菌菌群的多样性和相对丰度，门水平上2个样品的优势菌群均包括变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)，但相对丰度有显著差异；在属水平上相对丰度最高的均为弧菌属(Vibrio)，在2个样品中的丰度分别为74.3%和60.5%，此外，Z1样品相对高丰度(21.9%)的属为黏着杆菌属(Tenacibaculum)。育苗管理信息及上述病例分析结果提示，该疾病可能是由于在过期存放的幼体饲料质量下降所致的营养障碍情况下，有一定致病性的溶藻弧菌条件性感染所引起的疾病。     

养殖三疣梭子蟹十足目虹彩病毒1的检出及组织病理学分析

为探究浙江省舟山市某养殖池塘中三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)暴发疾病的病因, 应用组织病理学、 分子生物学和荧光原位杂交等技术手段, 对患病三疣梭子蟹组织进行检验。研究发现, 患病三疣梭子蟹的临床症状主要表现为食欲下降, 行动迟缓, 鳃水肿; 光学显微镜下观察鳃及血淋巴液未发现寄生虫, 肝胰腺等组织中也未分离到致病菌; 采用 PCR 方法对病蟹进行血卵涡鞭虫(hematodinium)、白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)、青蟹双顺反子病毒(mud crab discistrovirus-1, MCDV-1)以及青蟹呼肠孤病毒(Scylla serrata reovirus, SSRV) 蟹类常见病原 PCR 检测, 结果均为阴性; 病蟹的肝胰腺、心脏、鳃等组织的病理切片中可观察到明显的细胞病变和嗜酸性包涵体; 超薄切片电镜观察显示: 病蟹的肝胰腺、心脏和鳃组织中均存在六边形病毒颗粒, 粒子直径 150 nm 左右, 与已报道的十足目虹彩病毒 1 (decapoda iridescent virus 1, DIV1)形态特征相似。采用特异性套式 PCR 检测方法对患病蟹组织样品进行 DIV1 病原检测, 所有样本均扩增出 457 bp 和 129 bp 大小的目的片段。进一步根据 GenBank 中 DIV1 的主要衣壳蛋白(major capsid protein, MCP)表达基因和三磷酸腺苷酶(ATPase)表达基因序列设计特异性引物, 均能从病蟹样品中扩增出预期大小的 MCP 和 ATPase 基因开放阅读框(open reading frame, ORF)区全长。将扩增获得的 MCP 和 ATPase 基因 ORF 区全长进行测序和同源序列比对分析, 进化树分析结果表明其与十足目虹彩病毒属(Decapodiridovirus)病毒的 MCP 和 ATPase 基因序列自然聚为一支, 判定导致此次三疣梭子蟹发病病原为 DIV1。根据原位杂交探针设计原则, 以 DIV1 的 MCP 和 ATPase 基因的保守区域为靶位点分别设计探针, 通过荧光原位杂交获得了病毒粒子在病蟹肝胰腺、心脏、肌肉和鳃组织的分布情况, 与电镜切片观察和套式 PCR 检测结果相符。研究结果可为海水养殖三疣梭子蟹十足目虹彩病毒 1 病诊断与防控提供参考。     

WSSV与IHHNV竞争对虾鳃细胞膜受体的研究

本研究对白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)与传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus,IHHNV)能否竞争虾鳃细胞膜上的NM23蛋白受体进行探索。先用蔗糖梯度离心法提纯WSSV的全蛋白,利用病毒覆盖蛋白印迹技术(VOPBA)与对虾鳃细胞膜NM23蛋白作用,将疑似蛋白条带进行LC-MS/MS分析,初步筛选出3种WSSV蛋白,分别为WSSV013、Wsv497和Wsv035,再构建这3种蛋白的原核表达载体,通过VOPBA和免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)验证了Wsv497、Wsv035能与NM23蛋白相互作用,WSSV013不能与NM23蛋白相互作用。初步推测WSSV与IHHNV可能竞争对虾鳃细胞膜上的NM23蛋白受体,该结果为今后研究两种病毒竞争细胞膜受体和虾病毒蛋白作用机制提供理论基础。     

鲤浮肿病的危害及防控

正近年来我国河南、河北、辽宁、天津等地养殖鲤、锦鲤多次爆发一种"鲤急性烂鳃病",发病鱼出现烂鰓、眼凹陷等症状,具有发病急、死亡率高等特点,造成严重经济损失。有关专家经实验室检测确定此病为鲤浮肿病,这是一种境外传入我国的新发疫病。鲤浮肿病是由鲤浮肿病毒(Carp edema virus,CEV)感染引发的疫病,或称为锦鲤昏睡病(koi sleepy disease,KSD)。发病鱼有昏睡、烂鳃、凹眼等临床症状,可引起较高的死亡率。上世纪七十年代,日     

应用免疫技术检测牙鲆组织内的淋巴囊肿病毒

应用免疫荧光抗体技术(IFAT)和标记链亲和素-生物素(LSAB)免疫组化法对患淋巴囊肿病牙鲆(Paralichthys olivaceus的肝、脾、肾、胃、幽门、肠、心脏、性腺、鳃、表皮10种组织进行了检测，结果发现体表有囊肿症状病鱼的胃、肠、鳃和表皮组织内有淋巴囊肿病毒存在；体表未见囊肿症状病鱼的胃、肠和表皮组织内也检测到了病毒，说明这两种免疫技术可以应用于牙鲆淋巴囊肿病的检测与诊断。同时本文还对淋巴囊肿病毒通过消化道感染的可能进行了探讨。     

用MTT法对不同冷冻速率冻存的鲤鱼上皮瘤细胞复苏对比分析

细胞体外培养被广泛地应用到各种生物研究领域,水产的病毒检测的定性实验也是用细胞培养进行各种病毒的分离,如:传染性造血器官坏死病的病毒可以在铜吻磷鳃太阳鱼成纤维细胞(BF-2)培养中出现细胞病变(CPE)、鲤春病毒血症的病毒在鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)培养中出现CPE,常用的细胞系有,铜吻磷鳃太阳鱼成纤维细胞(BF-2)、大鳞大马哈鱼胚胎细胞(CHSE-214)、鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)、虹鳟鱼性腺细胞(RTG-2)等.当细胞一旦在体外培养时,有时会出现因操作不甚,造成的污染;有时也因受到外界各种因素的影响,发生生物特性的变化,引起细胞系的退变或死亡.     

鱼用烂鳃灵临床试验初报

为了验证鱼用烂鳃灵在室内小面积范围内对肠炎菌、烂鳃菌、赤皮菌的抑制效果,尤其是针对烂鳃菌的抑制效果。我们进行了小面积感染治疗试验。一、材料与方法 1.试验设施:选用8口水泥试验鱼池。面积每口为2m~2,深度1m,排灌方便。 2.试验鱼种:选用新邵县鱼苗场的当年健康草鱼种,体长10—14cm,体重为43.2—65.0g。试验期间,投喂的饵料均为颗粒膨化饵料。 3.试验菌种:采用中国科学院水生生物研究所提供的萤光假单胞杆菌(赤皮菌)、鱼害粘球菌(烂鳃菌)、肠型点状产气单胞杆菌(肠炎菌)菌株。分别用细     

第十讲——鱼病的预防和治疗

二、治疗在池塘中发现病鱼或死鱼时,要仔细检查,正确诊断,及时对症施药治疗。现将主要鱼病的症状及其治疗方法介绍如下。(一)出血病:病鱼口腔、鳃盖、体侧肌肉及鳍基部出血,患处肌肉呈点状或块状出血,严重时全身肌肉鲜红色;鳃部却因缺血而呈“白鳃”;肠道出血发红,但无腐烂状。常呈“红肌肉”、“红鳍红鳃盖”和“肠炎”型三种症状。病原是呼肠孤病毒,主要危害当年草鱼,其次是一足龄草鱼和青鱼,流行适温为25—30℃。治疗主要是预防1.注射灭活疫苗(10~(-2)的浓度)0.1—0.2毫升(见人工免疫预防)。2.适当稀养、混养或养双季鱼种的办法减少发病。     

隐鳃鲵科的生物地理与种群遗传研究进展

隐鳃鲵科(Cryptobranchidae)现存2属3种,其中大鲵属(Andrias)有2个种,即分布于我国的中国大鲵(A.davidianus)和分布在日本的日本大鲵(A.japonicus);隐鳃鲵属(Cryptobranshus)仅有隐鳃鲵(C.alleganiensis)1种,分布于美国东北部,又称美洲大鲵。由于人类活动的干扰,例如水库修建、森林砍伐、矿山开采、化肥农药使用等导致隐鳃鲵科的物种栖息地遭到严重破坏。此外,过度捕捞使隐鳃鲵科的自然种群数量不断下降,甚至造成某些种群的灭绝。目前,隐鳃鲵科这3个现存物种都处于不同程度的濒危状态。结合现有资料,分析、概述了隐鳃鲵科的生物地理学特点及其种群遗传学研究进展,旨在为其自然种群保护提供参考。     

鳗鱼鳃病及防治技术

鳗鱼诸病中,鳃病是危害最大的一种。有的说夏季是鳃病发病的高峰期,冬季少见,也有的说越冬期间极易发生鳃病。这两种说法都不全面。鳃病分为细菌性和寄生虫性二大类,此外,还有真菌和病毒等引起的鳃病。所以,在任何时候,鳃病的预防工作都应该引起高度重视。     

美研究人员发现快速检测口蹄疫病毒新方法

美国麻省理工学院一位研究人员近日称已研究发现了一种新的检测多种细菌和病毒的方法,可以利用经基因工程改造的细胞"快速准确”地检测到口蹄疫病毒. 美国麻省理工学院林肯实验室的托德@赖德说,这种方法"百分之百的准确”,只用大约30秒的时间就能探测出口蹄疫病毒所在. 据介绍,传统人造探测细菌和病毒的方法都不如免疫系统中自细胞来得灵敏和快速.正是基于这一点考虑,将白细胞与电子学结合制造出新型的"传感器”.赖德用水母体内能发光的细胞修改了B细胞,"修改后的细胞在遇到本身已经识别过的细菌或是病毒时,就会发亮”. 赖德说,目前已经拥有了多种能探测不同细菌和病毒的新型细胞,并称他们将在半年至一年的时间内,在包括曾遭受口蹄疫严重打击的英国郊区建立探测口蹄疫病毒的实地实验.