甘肃金鳟RAPD反应体系构建及优化

以甘肃金鳟尾鳍为试验材料,提取基因组DNA。对影响甘肃金鳟RAPD扩增的重要参数进行了优化试验,包括模板DNA浓度、dNTP浓度、引物浓度、Taq酶、变性时间、退火温度等,建立了甘肃金鳟RAPD反应的最适体系。即在25μl反应体系中:模板DNA用量为4.0 ng/μl;Mg2 浓度为2.5mmol/L;dNTP浓度为0.5 mmol/L;引物浓度为0.5μmol/L;Taq酶用量为1 U;扩增程序:94℃预变性4 min,94℃变性45 s,36℃退火50 s,72℃延伸1 min,共35个循环,最后延伸10 min。     

荷斯坦奶牛RAPD反应条件的优化

以中国荷斯坦奶牛为实验材料,研究了Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA浓度、TaqDNA聚合酶,以及退火温度对RAPD反应的影响,建立一套适合中国荷斯坦牛的最佳RAPD反应体系。反应总体积为20μL,Mg2+浓度为2.5mmol/L,TaqDNA聚合酶浓度为1U,引物浓度为2μmol/L,dNTPs浓度为400μmol/L,模板DNA浓度为100ng。PCR反应程序:94℃预变性2min→40循环(94℃变性1min→36℃退火1min→72℃延伸1min)→72℃延伸5min。     

鳜鱼SSR-PCR反应条件的优化探索

以鳜(Siniperca chuatsi)基因组DNA为试验材料,研究MgCl2浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶3个反应参数对微卫星PCR的影响,建立一套适合鳜微卫星PCR反应的最佳体系.结果表明,在25μL的反应体系中,Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶3个参数的适宜浓度分别为1.2 mmol/L、0.2 μmol/L和0.04 U/μL.PCR反应程序为94℃变性5 min,94℃30 s,56℃ 1 min,72℃ 1 min,共30个循环,最后72℃延伸5 min.     

拟穴青蟹ISSR-PCR条件的优化

分析DNA模板、Mg2+、dNTPs、引物和Taq DNA聚合酶及甲酰胺、二甲基亚砜等对拟穴青蟹ISSR-PCR反应的影响.研究结果确定了获得清晰条带的模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶的浓度范围分别为:模板DNA 8～50 ng/μl ,Taq DNA聚合酶0.75～1.0 U, Mg2+1.0～2.0 mmol/L(与引物密切相关),dNTP 0.15～0.20 mmol/L,引物浓度0.6～0.8 μmol/L.甲酰胺的添加并不能优化拟穴青蟹ISSR-PCR反应结果,而低浓度的二甲基亚砜可提高扩增产物的清晰度,但与引物相关.     

鳡鱼ISSR-PCR反应体系的正交优化

利用正交试验设计的方法,对鳡鱼ISSR-PCR反应体系中的Mg2+浓度、引物浓度、dNTPs浓度、DNA模板浓度及Taq DNA聚合酶浓度进行优化分析。建立了最佳ISSR-PCR反应体系,即25μL反应体系中含Mg2+2mmol/L、引物0.4μmol/L、dNTPs 0.2mmol/L、模板DNA 100ng、Taq DNA聚合酶1.0U。并在此基础上对退火温度和循环次数进行梯度试验,得到最佳退火温度为52℃,最佳循环次数35次。     

中国对虾SRAP分子标记体系正交优化及在遗传多样性分析中的应用

利用正交设计L16(45)对影响中国对虾SRAP分子标记分析的5个因素(Taq酶,Mg2+,模板DNA,dNTP和引物浓度)在4个水平上进行了优化,筛选出各反应因素的最佳水平为:20μl反应体系中包含1.0UTaq酶,2.0mmol/L的Mg2+,40.0ng的模板DNA,0.125mmol/L的dNTP以及0.4μmol/L的引物,退火温度为53.5℃。研究表明,各因素的不同水平对扩增结果有显著影响,其中Mg2+影响最大,影响大小顺序依次为Mg2+,Taq酶,引物,dNTP和模板DNA。利用优化的SRAP分子标记体系对中国对虾"黄海1号"第12世代选育群体进行了遗传多样性分析,实验结果表明,此标记技术可作为中国对虾遗传分析的良好技术工具。遗传多样性分析共筛选出8对可以扩增出清晰稳定条带的引物组合,共获得171个位点,其中多态性位点154个,占90.08%;有效等位基因数为1.7741,期望杂合度均值为0.4219,Shannon多样性指数为0.6055。上述参数值均高于应用AFLP技术对前几代选育群体的遗传多样性分析结果。     

大麻哈鱼SRAP反应体系正交设计及优化

以大麻哈鱼基因组DNA为模板,利用相关序列多态性(SRAP)技术以及L25(56)正交试验和单因子试验方法,分析了不同浓度的TaqDNA聚合酶、引物、dNTPs、Mg2+、DNA模板对扩增结果的影响,最终确立的PCR最佳反应体系为15μl,该体系含有1×PCRbuffer,TaqDNA聚合酶0.75U,引物浓度0.3μmol/L,dNTPs浓度0.3mmol/L,Mg2+浓度2.5mmol/L,DNA模板100ng。利用此优化反应体系,获得了清晰、稳定、多态性高的DNA谱带。     

荷斯坦奶牛RAPD反应条件的优化

以中国荷斯坦奶牛为实验材料，研究了Mg^2＋浓度、dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA浓度、TaqDNA聚合酶，以厦退火温度对RAPD反应的影响，建立一套适合中国荷斯坦牛的最佳RAPD反应体系，反应总体积为20μL。Mg^2＋浓度为2．5μmol／L，TaqDNA聚合酶浓度为1U，引物浓度为2μmol／L，dNTPs浓度为400μmol／L．模板DNA浓度为100ng。PCR反应程序：94℃预变性2min→40循环（94℃变性1 min→36℃退火1min→72℃延伸lmin）→72℃延伸5min．     

肝胰腺细小病毒和斑节对虾杆状病毒的PCR复合检测

肝胰腺细小病毒和斑节对虾杆状病毒是常见的2种DNA对虾病毒,在虾类养殖业中经常会出现混合感染。因此,建立这2种病毒的复合检测方法显得尤为重要。根据基因库中肝胰腺细小病毒和斑节对虾杆状病毒的保守序列,设计了肝胰腺细小病毒和斑节对虾杆状病毒的特异性引物,对这2种病毒PCR复合检测的反应条件和试剂浓度进行优化,退火温度55℃,主要试剂Mg2+终浓度为3mmol/L,dNTP终浓度为0.4 mmol/L,引物终浓度为0.8μmol/L。进一步比较了在优化后的PCR反应体系下,检测单种病毒和同时检测这2种病毒的灵敏度差异。     

鲤浮肿病病毒环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立

本研究针对鲤浮肿病病毒(carp edema virus, CEV)基因组核蛋白编码基因P4a的序列,设计2对特异性引物,以克隆构建的重组质粒为标准模板,通过优化反应体系中引物浓度组合、Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、反应温度和扩增时间等参数,建立了CEV环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法。结果表明,CEV-LAMP方法的最佳反应温度为62℃,引物浓度组合为引物F3/B3 0.2μmol/L,引物FIP/BIP 1.2μmol/L, Betaine0.7 mol/L, Mg~(2+) 8.0 mmol/L, dNTPs 1.2 mmol/L,反应时间60 min。反应产物经凝胶电泳呈现梯型条带,添加SYBR Green I荧光染料后,呈现明显的绿色阳性反应。CEV-LAMP法灵敏度高,最低检测限为10 copies/μL,较常规PCR法灵敏度高100倍; CEV-LAMP法特异性强,与锦鲤疱疹病毒(KHV)、鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)、鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)及鲤春病毒血症病毒(SVCV)无交叉反应。CEV-LAMP应用于患病鲤样本检测结果准确,简便快速,可为鲤浮肿病的现场诊断与防控提供技术支撑。     

基于正交试验设计优化三疣梭子蟹SRAP-PCR反应体系

相关序列扩增多态性（sequence related amplified polymorphism,SRAP）是一种多态性高的新型分子标记,其扩增结果稳定,容易操作和引物通用性高,在遗传多样性分析、种质鉴定和遗传图谱构建等方面的广泛应用逐渐从植物转移到水产动物中。为了建立三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）SRAP技术体系,文章利用正交设计L16（45）对三疣梭子蟹SRAP-PCR反应体系的5因素[TaqDNA聚合酶、镁离子（Mg2＋）、模板、三磷酸脱氧核苷（dNTPs）和引物]在4个水平上进行优化试验,结果得出各因素水平变化对PCR反应的影响从大到小依次为模板（纯度1.75~1.90,质量浓度10~70ng.μL-1）,Mg2＋（1.60~2.00mmol.L-1）,dNTPs（0.10~0.40mmol.L-1）,TaqDNA聚合酶（0.50~2.00U）和引物（0.10~0.40μmol.L-1）;筛选出各反应因素的最佳水平,建立三疣梭子蟹SRAP-PCR反应的最佳体系（25μL）为TaqDNA聚合酶0.50U,Mg2＋2.20mmol.L-1,模板DNA10ng,dNTPs0.20mmol.L-1,引物0.20μmol.L-1。这一优化体系可望在三疣梭子蟹遗传多样性和性别连锁标记等研究中应用。     

罗非鱼TRAP分子标记反应体系优化设计方案的比较

靶位区域扩增多态性（target region amplification polymorphism,TRAP）是一种新型功能性分子标记,比较了L16（4^5）正交试验和单因素方法优化罗非鱼（Oreochromis spp．）TRAP反应体系。2种分析方法结果中dNTPs浓度、随机引物浓度、DNA浓度相同而镁离子（Mg2＋）浓度和TaqDNA聚合酶浓度不同,不同因素间存在一定的交互作用。正交设计方法比单因素法更简单、科学、合理。该试验获得罗非鱼15txLTRAP最优反应体系为DNA模板浓度为60ng、Mg2＋浓度为1．5mmol·L^-1、dNTPs浓度为0．3mmol·L^-1、TaqDNA聚合酶0．5U、随机引物浓度为7pmol·L^-1和固定引物浓度为10pmol·L^-1。该反应体系在4个罗非鱼群体中验证,表现出良好的稳定性和重复性,该反应体系的建立为TRAP标记应用于罗非鱼遗传多样性评价、种质鉴定、分子标记辅助育种等研究提供了新的手段。     

对虾6种病毒多重PCR检测方法的建立

本研究针对养殖对虾6种病毒,包括白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、肝胰腺细小病毒(HPV)、桃拉综合征病毒(TSV)、对虾杆状病毒(BP)和传染性肌肉坏死病毒(IMNV),选择各自的基因分别设计特异性引物和探针,首先进行了单一病毒的PCR验证,在此基础上建立了同时特异性检测6种对虾病毒的多重PCR检测体系。对反应条件进行优化并进行特异性和灵敏度的验证。50μl反应体系,Mg2+的最佳浓度为5mmol/L,ExTaq酶最佳用量为3.75U,反应程序中最佳退火温度为55.5℃。6种病毒之间以及与对虾基因组都存在很好的特异性。最终经试验验证,该系统的检测灵敏度对WSSV可达104拷贝,IHHNV可达102拷贝,HPV可达104拷贝,TSV可达103拷贝,BP可达105拷贝,IMNV可达105拷贝。虽然该多重PCR方法灵敏度不如单一的PCR检测高,但是通过实际样品检测验证了该方法省时、消耗较少,又不失准确性,在实际应用中具有可靠性和应用价值。     

鳙内源性转谷氨酰胺酶特性的研究

文章研究了温度、pH、二硫苏糖醇（DTT）以及不同的金属离子和抑制剂对鳙（Hypophthalmichthys nobilis）鱼肉中内源性转谷氨酰胺酶（transglutaminase,TGase）活性的影响。结果表明,鳙内源性TGase的最适温度在37～45℃之间,最适pH为6.5～7.5,适量的钙离子（Ca^2＋）（0～2.2 mmol·L^-1）可以激发酶活性,低浓度（0～0.2mmol·L^-1）的DTT可以提高酶活性,但高浓度的钠离子（Na^＋）和钾离子（K^＋）会降低酶活性,镁离子（Mg^2＋）、铜离子（Cu^2＋）、锌离子（Zn^2＋）、钡离子（Ba^2＋）、铁离子（Fe^3＋）、亚铁离子（Fe^2＋）、铅离子（Pb^2＋）和乙二胺四乙酸（EDTA）也会抑制酶的活性。     

鲢抗菌肽 Hepcidin 的基因克隆和表达及抑菌活性分析

利用同源克隆的方法从鲢（Hypophthalmichthys molitrix）的肝脏中克隆出抗菌肽 Hepcidin cDNA（GenBank 登入号 KF312213）后,通过 pET32a（＋）构建含抗菌肽 Hepcidin 的重组质粒的 pET-Hep/ Rosetta 菌株,在37℃、28℃和16℃下分别用0.5 mmol·L -1和1.0 mmol·L -1 IPTG 诱导表达,产物用 Ni SepharoseTM 亲和层析柱纯化并进行体外抑菌试验。鲢 Hepcidin cDNA 总长度755 bp,ORF 为282 bp,5′UTR 为108 bp,3′UTR 为365 bp,编码93氨基酸,信号肽24个氨基酸,前域42个氨基酸和成熟肽27个氨基酸。pET-Hep/ Rosetta 在28℃和16℃主要是可溶性表达,37℃主要是包涵体表达。纯化的产物经15％ SDS-PAGE 电泳验证为目的产物。目的产物、pET32/Rosetta 产物以及氟苯尼考的体外抑菌试验表明,目的表达产物对无乳链球菌（ Streptococcus agalactiae）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）等具有很好的抑菌效果。     

同步检测7种鱼类病毒的扩增子拯救多重PCR(Arm-PCR)方法的建立和应用

淋巴囊肿病毒(LCDV)、肿大细胞病毒属虹彩病毒(Mega)、赤点石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、传染性胰脏坏死病毒(IPNV)、病毒性出血败血症病毒(VHSV)和传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV)是养殖鱼类主要的病毒性病原,危害巨大。为实现这7种病原的高通量、同步检测,本研究在分析这7种病毒基因序列的基础上,设计了9组扩增子拯救多重PCR(Arm-PCR)引物,并对扩增体系中的Taq酶、Mg2+、dNTP、Primer Mix浓度及退火温度等参数进行调整和优化,结合基因芯片检测技术,建立了同步检测7种鱼类病毒的Arm-PCR方法。优化后的Arm-PCR方法第一步PCR体系为：Taq酶(2.5 U/μl)1.0μl,10×PCR Buffer(含20 mmol/L的Mg2+)5μl,dNTP(各2.5 mmol/L)5μl,10×Primer Mix(各2μmol/L)9μl,模板1μl,ddH2O补足至50μl,退火温度为56℃。研究结果显示,该方法可以在1支反应管内对上述7种病毒的9个致病基因同步进行扩增和检测,检测灵敏度分别为101 copies/μl (RGNNV、VHSV、ISAV-NS、ISAV-MA)、102 copies/μl (LCDV、Mega、IHNV、IPNV)和103 copies/μl (大菱鲆红体病虹彩病毒,TRBIV)。该方法特异性强,与半滑舌鳎、石斑鱼、大菱鲆和牙鲆基因组DNA不产生交叉反应。本研究建立的可同步检测7种鱼类病毒的Arm-PCR方法具有高通量、高灵敏度、高准确性的优势,能有效提高工作效率,在鱼类病毒的筛查和流行病学调查领域有广泛的应用前景。     

奥尔森帕金虫环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立及应用

奥尔森帕金虫是重要的贝类病原性寄生虫之一,为建立快速、灵敏、准确和使用简便的检测方法,实验根据奥尔森帕金虫5.8S rDNA中的内转录间隔区(internal transcribedspacer,ITS)序列,建立了环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并对反应温度、反应体系中Mg2+浓度和反应时间进行了优化。该方法的检测灵敏度约为30拷贝质粒DNA,并且特异性较强,与海水帕金虫、包纳米虫、波豆虫及急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)等病原均无交叉反应。使用LAMP法对两批菲律宾蛤仔样品进行检测,结果表明,LAMP检测与传统PCR检测相比,灵敏度更高,检测结果更准确。实验所建立的奥尔森帕金虫LAMP检测方法简单、快速、灵敏且特异性强,可以在沿海贝类养殖厂及条件简陋的实验室使用。