日本七鳃鳗毒素肽rLj-RGD3突变体rLj-115基因的克隆与表达

rLj-RGD3是一种含有3个RGD模体的七鳃鳗毒素蛋白,具有抗血栓和抗肿瘤功能。为研究3个RGD模体与其蛋白功能的关系,rLj-RGD3系列突变体的获得成为关键。rLj-115是第Ⅰ及第Ⅱ位RGD缺失、第Ⅲ位RGD保留的突变体,本研究针对其进行了基因克隆、蛋白表达及纯化。由于rLj-RGD3基因具有大量重复序列,突变体基因无法通过定点突变方法获得,故对该突变体基因进行人工合成及PCR扩增、NdeⅠ和HindⅢ双酶切,并构建于pET23b质粒。DNA测序结果显示,该重组质粒所构建序列正确。进一步对阳性重组子进行转化、诱导表达和亲和层析纯化,得到了纯化的rLj-115蛋白。rLj-115作用于人脐静脉内皮细胞ECV304的MTT试验结果表明,该合成基因表达的蛋白具有活性,可以用于后续研究。     

foxl3重组质粒过表达与17ɑ-甲基睾酮投喂对斜带石斑鱼性腺发育的影响

通过foxl3重组质粒过表达与MT投喂对比,探究一种新型的调控斜带石斑鱼性腺发育的方法。以foxl3重组质粒注射以及MT投喂3月龄的石斑鱼幼鱼,观察性腺发育状态,利用荧光定量PCR检测分析性腺分化相关基因的表达。结果显示：质粒注射初期性腺注射组卵巢较对照组小,体细胞较多,存在向雄性方向发育的趋势（存在睾丸间质细胞）,且质粒注射初期的雄性相关基因—amh,激素生成相关基因—cyp11b、11β-hsd2,精子发生相关基因—rec8和sycp3的相对表达量显著高于对照组。MT投喂组后期的性腺组织处于明显的兼性发育期,而对照组仍处于O2期卵母细胞期;MT投喂组,amh、cyp11b、11β-hsd2、rec8和sycp3基因相对表达量趋势与质粒注射一致,但投喂组与对照组之间的差异较质粒注射更显著。在本实验条件下,MT投喂调控性腺雄性化的效果较foxl3质粒注射的效果明显。以上结果表明,foxl3重组质粒过表达对斜带石斑鱼幼鱼性腺发育具有明确的雄性化调控作用,且这种调控可能具有剂量依存效应。     

凡纳滨对虾信号转导及转录激活因子（Lv-STAT）基因的克隆及表达特征分析

信号传导及转录激活因子（STAT）是生物体内重要信号通路JAK/STAT的关键组分,在机体免疫、生长、发育等方面起到重要作用。本研究从凡纳滨对虾血细胞中克隆获得了STAT基因的全长cDNA序列（Lv-STAT, GenBank accession number: KC779541）,其 ORF区全长2373 bp,编码790 aa,预测的分子量为和等电点分别为90.68 kDa和5.91。利用SMART在线软件分析表明：该基因编码的蛋白主要结构域由STAT_int、STAT-α、STAT-β和SH2 domain四部分组成,但不具有信号肽结构。将Lv-STAT与来源于其它物种的STAT进行氨基酸多序列比对后发现,该基因家族中的关键位点在Lv-STAT中同样保守。系统发生分析结果显示Lv-STAT 与斑节对虾、中国明对虾的STAT亲缘关系最近。在组织表达模式分析基础上进一步研究了该基因应答WSSV感染的表达变化特征,发现在感染后早期（0.5 hpi、1 hpi和3 hpi）,该基因在血细胞和肝胰腺中均呈显著上调表达趋势,上述研究表明该基因在一定程度上参与了南美白对虾体内由WSSV引发的先天免疫应答过程。     

鲤春病毒血症病毒糖蛋白基因的克隆及其在毕赤酵母中的初步表达

根据SVCV糖蛋白基因序列设计引物,在5’引物和3’引物中分别引入酶切位点。以病毒核酸为模板用RT-PCR方法扩增该段糖蛋白基因,将所得的基因片段(517和521)克隆至穿梭载体pGAPZαA/B之GAP启动子下游位点,构建含α信号肽的重组表达载体。获得的重组质粒pGAPZαA-517和pGAPZαB-521经线性化后,电击法转化毕赤酵母SMD1168菌株,构建分泌型表达SVCV糖蛋白的重组酵母菌株。酵母菌落PCR法检测表明,已成功构建分泌表达SVCV糖蛋白的酵母基因工程菌株,斑点印迹法进一步分析表明有目的蛋白的成功表达。     

翘嘴鳜学习记忆相关基因c-fos对食欲基因的调控

学习记忆在动物获得新的觅食技巧和食物偏好方面扮演着重要的角色。为评估学习记忆对翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)摄食调控的影响, 构建翘嘴鳜学习记忆相关基因 c-fos 及 zif268 荧光过表达载体, 并以 pcDNA3.1-EGFP 载体质粒中的绿色荧光蛋白基因为报道基因进行电转实验, 优化电压、脉冲时间、质粒浓度和电击次数等电转条件, 确立最佳条件。利用电击的方式转染翘嘴鳜脑细胞, 检测食欲基因 mch、agrp、pomc、npy 表达变化。结果显示, 成功构建了学习记忆过表达载体 pcDNA3.1-c-fos-EGFP、pcDNA3.1-zif268-EGFP。翘嘴鳜脑细胞电转染的最适条件: 细胞密度 1×106 /mL、电压 240 V、脉冲时间 5 ms、质粒 6 μg、电击 1 次、转染 48 h, 可见大部分荧光蛋白表达, 转染率较高, 表明 pcDNA3.1-EGFP 在体外成功转染翘嘴鳜脑细胞。过表达 c-fos 基因后, 食欲相关基因 pomc 和 npy mRNA 水平均显著上升。而过表达 zif268 基因后, 并未发现食欲基因有差异表达。以上结果说明, 翘嘴鳜学习记忆相关基因 c-fos 的表达影响了食欲相关基因 pomc 和 npy 的表达。     

草鱼呼肠孤病毒衣壳蛋白靶向灭活转基因P0的构建

为探索草鱼出血病防治新技术,实验采用衣壳蛋白靶向灭活(capsid-targeted viral inactivation,CTVI)策略,利用Tgf2转座子元件,构建了带爪蟾EF1α或鲤热休克蛋白70两种不同启动子的CTVI转基因质粒p Tgf2-EF1α-VP3-SN或p Tgf2-Hsp70-VP3-SN。该2种质粒均包含GCRV衣壳蛋白VP3与金黄色葡萄球菌核酸酶(Staphylococcus aureus nuclease,SN)融合表达阅读框。通过将2种CTVI转基因质粒与体外合成的Tgf2转座酶5'加帽mRNA共同显微注射入草鱼1~2细胞期受精卵,获得了带2种不同启动子的CTVI转基因草鱼群体。PCR和测序结果显示,2种转基因阳性草鱼基因组中均含有外源GCRV衣壳蛋白VP3与SN基因片段,阳性率分别为40.2%和37.0%,表明Tgf2转座子已成功介导CTVI融合表达基因整合到草鱼基因组中。本实验共获得了120尾P0CTVI转基因个体,为将来构建抗出血病草鱼新品系奠定了基础材料。     

VP35蛋白对Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒增殖的影响

Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)基因片段S11编码外衣壳蛋白VP35。为深入探究VP35蛋白在病毒增殖中发挥的作用，实验扩增了S11基因并插入载体pCMV-3×flag中，构建pCMV-3×flag-S11真核表达质粒，转染草鱼肾细胞(CIK)后感染Ⅱ型GCRV，收集感染后的上清液与细胞。首先利用实时荧光定量PCR中相对定量的方法检测细胞样品中Ⅱ型GCRV-S6基因的mRNA。结果显示，过表达VP35在病毒mRNA水平促进Ⅱ型GCRV的增殖；然后扩增S6基因并插入到载体pET-32a(+)中，构建重组原核表达质粒，纯化Ⅱ型GCRV-VP4蛋白并制备多克隆抗体，用Western blot检测收集的细胞样品中的VP4蛋白，结果表明过表达VP35在病毒蛋白水平促进Ⅱ型GCRV的增殖；最后使用pET-32a-S6质粒作为阳性标准质粒并制作标准曲线，建立Ⅱ型GCRV病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法，利用该方法检测细胞上清液中的病毒颗粒，结果表明过表达VP35增加Ⅱ型GCRV病毒拷贝数。本研究从3个维度证明过表达VP35蛋白促进Ⅱ型GCRV增殖，有助于深入解析VP35蛋白功能，也为进一步探究Ⅱ型GC...     

广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌3种毒力基因检测及tlh基因的蛋白表达

采用PCR技术检测分离自广西钦州、北海和防城港3市凡纳滨对虾样品中的67株副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)3种毒力基因tdh、trh和tlh的携带情况,并将tlh基因进行原核表达,SDS-PAGE和Western blotting鉴定分析。结果显示,67株副溶血弧菌均未扩增出tdh和trh基因,而tlh基因检出率为100.0%,所检副溶血弧菌的毒力基因型为tdh~-trh~-tlh~+。成功构建了原核表达质粒pET-28a-tlh,将其转化至大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞后,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳检测得到大小约为53 kDa的产物,与预测值相符。经Western blotting鉴定,该重组表达产物能与抗6×His标签的单克隆抗体发生特异性反应。     

黄颡鱼细胞因子信号传导抑制因子SOCS1的原核表达及多克隆抗体制备

细胞因子信号传导抑制因子(suppressor of cytokine signaling, SOCS)是一类由细胞产生的胞内蛋白,能够反馈性阻断细胞因子信号传导过程的负性调控因子。为深入研究黄颡鱼细胞因子信号传导的发生过程和机制,实验从黄颡鱼cDNA中克隆获得561 bp的黄颡鱼SOCS1(PfSOCS1)基因编码序列,成功构建了重组质粒pET32a(+)-PfSOCS1,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,在不同温度、IPTG浓度、诱导时间等条件下进行表达,确定最佳表达条件。本实验采用包涵体纯化的方法得到纯度较高的重组SOCS1蛋白;以重组PfSOCS1蛋白免疫Balb/C小鼠,制备多克隆抗体。通过Western blot鉴定了PfSOCS1抗血清可以特异性识别重组PfSOCS1蛋白。蛋白水平的组织分布显示,黄颡鱼SOCS1蛋白在肝脏中表达水平较高。     

不同动物饵料对YY超雄黄颡鱼性腺发育的影响

通过比较近10年YY超雄黄颡鱼的生产和养殖记录,发现仅近几年投喂过水蚯蚓的YY超雄黄颡鱼性腺出现问题。实验设定4组不同饵料(丰年虫、浮游动物、红虫和水蚯蚓)连续投喂YY黄颡鱼鱼苗20 d(11～30日龄),选择60日龄统计各组YY超雄黄颡鱼的存活率、体长和体质量。水蚯蚓组YY超雄黄颡鱼的体长和体质量显著高于其他3组,丰年虫组YY超雄黄颡鱼存活率显著低于其他3组。解剖观察60日龄和1年龄YY黄颡鱼的性腺结构并统计1年龄YY超雄鱼的受精率,结果显示,水蚯蚓组YY超雄黄颡鱼的性腺有75%为兼性性腺(精巢和卵巢均存在),25%为无精小叶的精巢,且1年龄的YY黄颡鱼受精率仅为36.70%±4.05%,并显著低于其他3组,而其他3组性腺发育和受精率均正常。为研究水蚯蚓引起YY黄颡鱼雌性化具体原因,实验测量4种不同动物饵料的雌二醇含量,发现雌二醇含量均较低,推测YY超雄黄颡鱼雌性化的原因可能是水蚯蚓富集的环境内分泌干扰物(EDCS)导致。研究表明,在YY超雄黄颡鱼大规格苗种培育过程中,早期应投喂浮游动物或红虫,不宜投喂水蚯蚓。     

饲料中添加酵母培养物对黄颡鱼生长性能、非特异性免疫和肠道健康的影响

为研究饲料中添加酵母培养物对黄颡鱼生长性能、非特异性免疫和肠道健康的影响，在基础饲料中分别添加0、1%和2%的酵母培养物YC1(粗蛋白含量为50%)、1%和2%的酵母培养物YC2(粗蛋白含量为55%)，配制5种等氮等脂 (42%粗蛋白和8%粗脂肪) 的实验饲料，分别命名为C、YC1-1、YC1-2、YC2-1和YC2-2。选择初始体质量为 (4.87±0.00) g 的黄颡鱼375尾，随机分为5组 (每组3个重复，每个重复25尾)，进行为期8周的养殖实验。结果显示，YC2-1和YC2-2处理组黄颡鱼的增重率 (WG) 显著高于对照组，YC2-2处理组的特定生长率 (SGR) 显著高于对照组；YC2-1和YC2-2处理组黄颡鱼肌肉的蛋白沉积率 (PPV) 显著高于对照组，蛋白质效率 (PER) 随着酵母培养物添加水平的上升呈先上升后下降的趋势，YC2-1处理组的PER最高；YC2-1和YC2-2处理组的饲料系数 (FCR) 显著低于对照组，YC2-2处理组的FCR显著低于YC2-1处理组；YC2-1和YC2-2处理组肝脏溶菌酶 (LSZ) 和超氧化物歧化酶 (SOD) 活性均显著高于对照组；YC2-1处理组的肠道皱襞高度显著高于YC1-1处理组，皱襞宽度和上皮细胞高度显著高于YC2-2处理组。嗜水气单胞菌攻毒实验中，酵母培养物组的平均累积死亡率 (CMR) 均低于对照组，YC2-1处理组的CMR显著低于对照组。研究表明，在本实验条件下，饲料中添加酵母培养物YC2能有效改善黄颡鱼机体非特异性免疫功能、提高抗氧化能力、维持肠道健康以及提高黄颡鱼抗嗜水气单胞菌感染的能力。     

急性氨氮胁迫对黄颡鱼组织抗氧化酶活性及HSP70和HSP90基因mRNA表达水平的影响

为了探讨急性氨氮胁迫对黄颡鱼组织中抗氧化酶活性及HSP70和HSP90基因mRNA表达水平的影响,实验随机挑选了360尾黄颡鱼[初体质量(17.25±0.05)g],分别暴露于含有0(对照)、5.70(低浓度组)、28.50(中浓度组)和57.00(高浓度组)mg/L总氨氮浓度的水体中,进行96 h的急性胁迫实验。实验开始后,分别于0、12、24、48和96 h取样。结果显示,氨氮胁迫发生后,低、中浓度组实验鱼肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)活性呈先升高后降低趋势,而高浓度组则持续降低;低、中、高浓度组实验鱼肝脏中丙二醛(MDA)含量在胁迫开始后显著升高;3 h时,高浓度组实验鱼肝脏中SOD活性达到最低,而MDA含量最高;24 h后,高浓度组实验鱼肝脏中过氧化氢酶(CAT)活性显著升高;低、中、高浓度组实验鱼肝脏中HSP70基因的mRNA表达量呈先降低后升高趋势,而鳃中HSP70基因表达量持续升高,但脑中HSP70基因在0 h后显著降低;氨氮胁迫3 h时,低、中、高浓度组实验鱼肝脏和脑中HSP70基因表达量显著低于对照组,而在鳃中正好相反;相比HSP70基因,高氨氮浓度组实验鱼肝脏和鳃中HSP90基因的mRNA表达量在24 h时达到最高。研究表明,不同浓度的氨氮胁迫会对黄颡鱼抗氧化酶活性造成不同程度的抑制,原因与丙二醛的积累量有关;相比HSP90基因,黄颡鱼HSP70基因的表达量在氨氮胁迫发生后迅速上调,这种生理调控机制提示HSP70在应对急性氨氮胁迫时发挥着更重要的作用。     

天然叶黄素对黄颡鱼生长性能和皮肤着色的影响

研究了天然叶黄素(源自万寿菊,含量为4.64％)的添加水平对黄颡鱼生长和皮肤着色效果的影响.在黄颡鱼基础饲料中,分别添加0％、0.15％、0.30％、0.60％、8.00％的受试物,在不影响饲料营养水平的基础上设计最高剂量组为可能摄入剂量组的10倍以上,经挤压熟化工艺加工后,实际检测叶黄素含量为未检出(检出限=0.5 mg/kg)、24.2、54.2、118.0、1 700.0mg/kg,依次命名为C、L24.2、L54.2、L118、L1700.饲养90 d后发现,添加天然叶黄素的4个剂量组的特定生长率和饲料效率、L24.2组的蛋白沉积率、L54.2组和L118组及L1700组的能量沉积率均显著高于对照组(P＜0.05).体侧和腹部皮肤的黄度(b*)和饱和度(C*)随饲料中天然叶黄素含量的增加而逐步升高,L118组可达到饱和,并与L1700组之间没有显著差异(P＞0.05),L118组和最高剂量组皮肤中黄色素过度沉积,并向肌肉中转移.皮肤中叶黄素的蓄积系数呈现先升高后下降的趋势,最高为76.25 mg/kg饲料.结果表明,24.2～1700mg/kg的天然叶黄素显著提高了初始体质量21 9的黄颡鱼的生长性能.天然叶黄素作为黄颡鱼皮肤着色剂的最适剂量为76.25 mg/kg饲料.     

黄颡鱼不同组织矿物元素的分布及含量

为了探究鱼类不同组织中矿物元素的含量，实验以养殖黄颡鱼为对象，采用电感耦合等离子体质谱法测定了黄颡鱼18个组织(心脏、肝脏、脑、脾脏、肾脏、肌肉、脂肪、前肠、中后肠、眼睛、鳃、尾鳍、鱼鳔、骨骼、胃、皮肤、血液、全鱼)中7种矿物元素(Ca、Mg、Zn、Fe、Cu、Mn和Se)的含量与分布。结果显示，Ca在骨骼、鳃、尾鳍和肌肉中占比较高，在尾鳍和骨骼中含量最高，在脂肪组织中含量最低；Mg在骨骼和肌肉中占比较高，在骨骼和尾鳍中含量最高，在眼睛中含量最低；Zn在骨骼、肌肉、皮肤和眼睛中占比较高，在眼睛中含量最高，在脂肪组织中含量最低；Fe在骨骼、血液和肌肉中占比较高，在血液中含量最高，在脂肪组织中含量最低；Cu在骨骼、肌肉和肝脏中占比较高，在肾脏和肝脏中含量较高，而在脂肪和眼睛中含量最低；Mn在骨骼和肌肉中占比较高，在骨骼和尾鳍中含量较高，在眼睛和脂肪中含量较低；Se在肌肉、骨骼、皮肤和肝脏中占比较高，在脾脏、肝脏、肾脏和前肠中含量较高，在肌肉和脂肪中含量较低。研究表明，黄颡鱼体内含有丰富的矿物元素(Ca、Mg、Zn、Fe、Cu、Mn、Se)，而且在不同组织中具有不同的分布特征。研究采用ICP...     

转座子mini-Tn10介导的运动突变对溶藻弧菌毒力的影响

采用转座子mini-Tn10/Km构建了致病性溶藻弧菌的突变库,采用半固体双层平板初筛到73株运动缺陷突变株,初筛的突变株纯化及重复筛选后获得运动性缺陷表型稳定的突变株ND-01MM,Southern鉴定确定其为单位点插入。野生型菌株ND-01和运动缺陷突变株ND-01MM对致病性溶藻弧菌的天然宿主大黄鱼粘液的趋化、粘附以及在大黄鱼吞噬细胞内存活能力等生理功能的比较研究发现,溶藻弧菌运动缺陷后趋化及粘附能力均极显著下降(P<0.01),但在吞噬细胞内的存活能力则与野生型菌株差异不显著(P>0.05)。采用腹腔注射和浸泡两种方式感染大黄鱼,结果发现运动缺陷对浸泡感染的影响较为明显,但对腹腔注射的感染方式影响不大。     

黄颡鱼早期发育阶段受精卵和鱼体脂肪酸组成变化

研究了黄颡鱼受精卵孵化期间和仔鱼发育阶段脂肪含量和脂肪酸的组成变化规律.采用常规化学分析方法和气相色谱法对黄颡鱼从鱼卵受精开始至仔鱼孵化后未投饵的7 d内的脂肪含量和脂肪酸组成进行测定.结果表明,受精卵在整个孵化期间脂肪含量有下降趋势.受精卵中不饱和脂肪酸含量大于饱和脂肪酸含量.受精卵在整个孵化期间各种脂肪酸含量无明显变化.仔鱼孵化后,鱼体总脂肪含量急剧下降,总脂含量从0日龄的4.57%降低到7日龄的0.75%.仔鱼在饥饿期间鱼体脂肪酸组成发生明显变化,单不饱和脂肪酸含量下降最为明显,尤其是C18:1.仔鱼在饥饿期间,脂肪酸按n-9>n-6>n-3顺序被先后利用,黄颡鱼仔鱼发育阶段主要以单不饱和脂肪酸作为能量代谢基质,而C20:4n6(AA)和C22:6n3(DHA)优先于C20:5n3(EPA)被保存下来.     

Water quality,nutrient budgets and growth performance in yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco Richardson) and lotus (Nelumbo nucifera Gaertn) co‐culture systems

An experiment was conducted to determine the growth efficiency of lotus (Nelumbo nucifera Gaertn) on nutrient capture in farming systems of yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco Richardson). Three treatments, a control treatment of N. nucifera alone (T1), a treatment of N. nucifera‐P. fulvidraco co‐culture (T2) and a treatment of P. fulvidraco alone (T3), were conducted in triplicate. Except pH, conductivity and chemical oxygen demand (COD_Mn), most of the water quality parameters were significantly lowered by N. nucifera cultivation. Total nitrogen and phosphorus concentrations in the T2 system were 62.2% and 71.6% higher than those in the T1 system respectively; and 31.8% and 59.2% lower than those in the T3 system respectively. The nitrogen and phosphorus release rates were 41.2% and 36.8% in the T2 system, respectively, and 95.6% and 99.1% in the T3 system respectively. 7.31%–21.4% of nitrogen and 3.35%–15.9% of phosphorus were unaccounted. N. nucifera can effectively remove nutrients from water and sediments and may promote the outflow of nutrients. No significant difference in fish or N. nucifera growth performance was observed among the systems. This study indicates that the co‐culture of N. nucifera with P. fulvidraco is an optimal culture system that can increase food production and reduce waste discharge.