ISSR标记在坛紫菜不同色泽丝状体种质鉴定中的应用

ISSR标记在坛紫菜不同色泽丝状体种质鉴定中的应用=Application of ISSR markers in germplasm identification of different color’s Porphyra haitanensis filament strains［刊，中］/谢潮添（集美大学水产学院，厦门361021）,纪德华,陈昌生,徐燕,张元//水产学报，—2007，31(1).-105～111 用ISSR分子标记技术对4个不同色泽坛紫菜（Porphyra haitanensis）丝状体品系（分别为桔黄色，褐绿色，棕红色和紫色）及1个野生型对照丝状体品系（褐红色）进行了遗传分析，共筛选出11条引物，PCR反应得到了129个扩增位点，多态位点比率达88.4％，有效等位基因数为1.6369，期望杂合度为0.3609，Shannon多样性指数为0.5265；根据Nei方法计算了这5个坛紫菜丝状体品系间的遗传相似性系数和遗传距离，结果发现4个不同色泽丝状体间的平均遗传距离为0.5727，它们同野生型对照的平均遗传距离为0.6564，同时应用UPMGA法对它们进行了聚类分析。最后应用引物812扩增的4个多态性位点构建了这5个不同坛紫菜丝状体的DNA指纹图谱，使每一品系都具有独特的DNA指纹，并将其转化成了计算机可以识别的数码指纹，可以方便地应用于坛紫菜丝状体的种质鉴定中。结果表明ISSR分子标记技术可以作为坛紫菜丝状体种质鉴定的有效技术手段，提供快捷、准确的鉴定结果。图3表5参24 关键词：坛紫菜; ISSR标记; 遗传分析; 种质鉴定 E-mail: cschen@jmu.edu.cn     

野生坛紫菜种群遗传多样性的ISSR分析

采用简单序列重复区间(ISSR)分子标记技术对福建省的3个野生坛紫菜(Porphyrahaitanensis)种群共60个个体进行了遗传多样性分析.15条引物共扩增出222个位点,其中186个位点具有多态性,多态位点百分率为83.78%,在种群水平上,多态位点百分率为80.18%～81.53%,平均为80.93%.期望杂合度、Shannon信息指数在物种水平上分别为0.3304和0.4834;在种群水平上分别为0.3089和0.4551,表明坛紫菜种群内存在着较高的遗传多样性水平,且在三个种群间没有明显差异.依据Gst值,坛紫菜的遗传变异主要发生在种群内的个体间(占93.5%),只有6.5%的遗传变异发生在种群间,由此说明坛紫菜种群间的遗传分化水平很低,这与坛紫菜种群间充分的基因交流(Nm=7.1930)是相关的.基于遗传距离的UPGMA聚类结果表明坛紫菜60个个体并不按照其地理分布进行分群,而是随机分群的.文章最后还对坛紫菜种质资源保护的必要性进行了讨论.     

坛紫菜泛素连接酶PhCUL1基因克隆与功能验证

高温影响坛紫菜(Pyropia haitanensis)的产量和品质,是制约紫菜产业发展的主要因素。前期研究发现,高温胁迫下,坛紫菜泛素蛋白酶体系统相关基因显著上调表达,但其响应高温胁迫的分子功能还未知。本研究通过分子生物学、遗传学等技术手段对坛紫菜cullin E3连接酶基因(PhCUL1)的功能进行研究。利用PCR方法克隆了PhCUL1基因的全长,PhCUL1全长为2500 bp,开放阅读框(ORF)长度为2481 bp,该基因存在1个Cullin (407~618 aa)结构域和1个Cullin Nedd8 (754~821 aa)结构域,其中,Cullin Nedd8结构域为蛋白融合位点。进化树分析显示,PhCUL1在进化上与脐形紫菜(Porphyra umbilicalis)有较近的亲缘关系。qRT-PCR结果显示,PhCUL1基因被高温显著诱导。为进一步阐明PhCUL1的分子功能,将其转入莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)进行功能验证,过表达PhCUL1株系比野生型更能耐受高温胁迫。同时,在高温33℃下处理3 h和6 h内,转基因植株的PhCUL1基因呈上调表达。这初步说明PhCUL1基因在坛紫菜响应高温胁迫过程中发挥着重要作用,其具体调控机制有待进一步研究。本研究有助于阐明坛紫菜泛素蛋白酶体系统响应高温胁迫的分子机制,为指导耐高温新品种选育提供理论依据。     

坛紫菜体细胞的连续克隆培养和悬滴培养

随着用于分离海藻体细胞和原生质体工具酶的增多,近几年来,海藻单离细胞和原生质体的培养取得了较大进展,特别是对一些经济海藻如海带、紫菜的原生质体培养,国内外均进行了大量研究。严兴洪等把坛紫菜叶状体体细胞的复杂发育分化趋势初步归结成八类,并且建立了坛紫菜叶状体体细胞的分化模型。阐明坛紫菜叶状体体细胞的发育分化规律,不仅能为利用坛紫菜体细胞直接快速采苗,改进传统采苗工艺的新技术提供科学的理论依据,而且对于开展坛紫菜体细胞与其它紫菜间的细胞融合的正确选材以及细胞融合以后的杂种筛选等研究均具较大意义。为此,我们对坛紫菜叶状体体细胞进行了连续数代克隆培养。单个细胞培养在高等植物中已获成功,但在海藻细胞培养中还未见报道,探讨单个细胞培养途径,对开展海藻细胞工程研究具重要价值。结果报告如下:     

坛紫菜遗传连锁图谱的构建

以野生型坛紫菜纯系(♀)和红色型坛紫菜纯系(♂)作为杂交亲本,结合四分子分析法及单个体细胞克隆的丝状体途径,创建了由157个株系组成的坛紫菜DH作图群体,并用经过筛选的24对SRAP引物和16对SSR引物对父母本及作图群体各株系进行双标记分析,获得了224个多态性标记,其中157个标记符合孟德尔分离规律。根据标记间的连锁规律,首次构建了坛紫菜的分子遗传连锁图谱,所构建的遗传图谱由包含124个标记(含SRAP标记104个,SSR标记20个)的5个连锁群组成,总长度为879.2cM,平均标记间隔为7.09cM,各个连锁群长度为134.2～213.6cM,包含标记18～31个。最后采用3种不同方法计算得到坛紫菜的估计基因组长度平均为955.3cM,由此得到坛紫菜遗传连锁图谱的基因组覆盖率为92.0%。     

条斑紫菜品系评价方法的探讨

总结并分析了“国家级紫菜种质库”中有关紫菜种质材料的原始数据和资料,调查研究了条斑紫菜不同品系的形态结构等生物学特性及环境适应性表现;通过对条斑紫菜不同品系经济性状的定量测评、丝状体生长发育特征的测评、品系产品生化成分的分析评价以及分子标记技术在条斑紫菜种质评价分析中的应用等研究,初步得到了条斑紫菜品系的评价方法;筛选...     

南海野生坛紫菜选育研究

以南海粤东海域的野生坛紫菜为选育材料,采用选择育种的方法并进行海区栽培验证,培育出产量高、耐高温和质量优的优良品系。第1茬采收时紫菜藻体平均长度比对照组（传统栽培坛紫菜品种）增加了73．9％,产量和单位产量分别提高了25％和19．0％。3～5cm叶状体在29℃水温条件下培养6天后才出现烂斑,海区栽培没有出现因高温造成的烂苗现象。第1茬坛紫菜16种氨基酸总量比对照组高36．5％。本研究成果不仅为粤东及周边地区的坛紫菜栽培生产提供一个具有实用性的优良品系,而且也为今后坛紫菜良种选育提供了更广泛的研究材料。     

4种紫菜叶状体的ISSR分子标记分析

4种紫菜样品分别为采自青岛海区的野生条斑紫菜（Porphyra yezoensis）、华北半叶紫菜（P.katadai var.hemiphylla）、少精紫菜（P.oligospermatangia）和浙江象山海区人工栽培的坛紫菜（P.haitanensis）.取其10～15 cm叶状体为材料,采用ISSR（Inter-simple sequence repeats）分子标记进行分析.从100个ISSR引物中筛选出22个引物,扩增出清晰、可重复的条带共计247条,其中多态性条带比例达95.5%.根据扩增结果进行的聚类分析显示,条斑紫菜和少精紫菜的亲缘关系最为接近,在聚类图中二者首先聚在一起,接着与坛紫菜相聚,最后与华北半叶紫菜汇聚.本研究还讨论了紫菜属海藻的遗传多样性以及种间的特异性ISSR分子标记.本研究目的在于为紫菜遗传变异、亲缘关系以及分类研究、探索新的分析手段.[中国水产科学,2006,13（3）：371-377]     

坛紫菜“闽丰2号”

正一、品种概况(一)培育背景坛紫菜属于红藻门,红藻纲,红毛菜目,红毛菜科,紫菜属,是我国特有的暖温带性种类。上世纪60年代,我国藻类学者突破了坛紫菜全人工育苗和栽培技术后,坛紫菜的人工栽培迅速发展,目前已成为福建、浙江南部和广东北部沿海海水养殖的主要对象,其产量约占到全国紫菜总产量的70%左右。近年来,坛紫菜在江苏沿海的栽培也得到了逐步发展。     

连云港地区坛紫菜育苗技术总结

正坛紫菜是浙江、福建沿海的主要栽培种;条斑紫菜是长江以北地区的主要栽培种,坛紫菜适应较高的温度,生长快,产量高,近年已在连云港等北方地区栽培获得成功,仅连云港地区坛紫菜2015、2016和2017年度的栽培面积分别达到90万m2、540万m2和576万m2。为适应坛紫菜在北方地区迅速推广的需要,作者从2014年开始在北方地区进行坛紫菜育苗试验,经过几年的试验研究,坛紫     

坛紫菜转录因子NhbZIP1克隆和功能验证

高温是制约坛紫菜(Neoporphyra haitanensis)产业发展的主要因素之一,阐明坛紫菜高温胁迫应答机理对耐高温品种选育至关重要。人们已分离多个坛紫菜抗逆相关基因,但尚不清楚这些基因的表达调控机制。本研究通过分子生物学和生物信息学技术分离了坛紫菜转录因子NhbZIP1基因。该基因开放阅读框长825 bp,编码274个氨基酸。从开放阅读框推导的氨基酸序列有5个低复杂度区域和1个BRLZ结构。其中,BRLZ是bZIP家族的保守结构域,含有一个α卷曲螺旋结构(121~171 aa)。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测发现,NhbZIP1受高温胁迫显著诱导。为进一步阐明NhbZIP1的功能,将其转入莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中。结果显示,高温胁迫下转基因藻株生物量始终高于野生型,且随处理时间增加差异越来越显著。转基因藻株中热激蛋白家族和抗氧化系统相关基因的表达量显著高于野生型。研究表明,NhbZIP1激活下游抗逆基因表达,在坛紫菜应答高温胁迫中发挥重要作用。研究结果有助于阐明bZIP调控坛紫菜响应高温胁迫的分子机制,为耐高温新品种选育提供了基础信息。     

坛紫菜制品成份分析及其在生产上的意义：紫菜育苗养殖技术研究组

通过连续三年进行坛紫菜１８种氨在酸含量的系统分析和一个生产不同月份叶状体的粗蛋白、粗脂肪、纤维素、灰份、水份等分析，了坛紫营养成份与种采来源，收获方式、季节变化、加工方法等十分有关。此项研究为生产坛紫菜优质产品，提高经济效益，推动紫菜养殖发展提供气依据。     

紫菜遗传育种研究进展

对中国紫菜(Pyropia/Porphyra)种质资源进行了详细的介绍,从育种技术、育种目标和育种成果3个方面综述了紫菜育种领域的研究进展。育种技术以选择育种、杂交育种和诱变育种为主,分子遗传育种在探索之中。育种目标在优质、高产的基础上,结合气候变化、不同海区环境,培育耐高温、耐低盐等抗逆性强的品种。目前,中国已培育出紫菜新品种6个,其中坛紫菜4个,条斑紫菜2个。最后,作者提出中国紫菜产业发展面临的一些问题,期望良种选育与产业发展相结合,为科研工作者进一步开展紫菜育种研究提供参考。     

坛紫菜固定桩悬浮式养殖技术

坛紫菜固定桩悬浮式养殖技术是在潮间带筏架养殖和浅海浮流式养殖基础上发展起来的一种先进养殖方法,其养殖技术的推广应用将坛紫菜养殖由传统单一的潮间带养殖模式向浅海养殖跨出突破性的一步,开创了坛紫菜养殖新领地,极大地拓展了养殖空间,使闽东地区坛紫菜养殖得到迅猛发展。     

坛紫菜rbcS及rbcL-rbcS基因间隔区的序列分析

Rubisco是光合作用和光呼吸的关键酶,目前已成为高等植物中研究最深入的酶之一,而在低等藻类中关于该酶的相关研究却很少。以来自浙江和福建的6个坛紫菜(Porphyra haitanensis)无性系为研究对象,以江苏条斑紫菜(P.yezoensis)为参照,克隆了其Rubisco小亚基(rbcS)及大小亚基基因间隔区共516 bp的序列。序列分析结果表明,其中4个坛紫菜系(Hza、Hzf、Hpt、Hzz)的基因序列完全相同(以其作为标准),坛紫菜Hzb和Hzc与其均只有1个碱基差异,而条斑紫菜Yn55与其差别碱基为46个。将本实验的7条紫菜序列与GenBank数据库收录的17条紫菜Rubisco序列一起做系统分析,结果表明坛紫菜和条斑紫菜都分别归到了各自的类群中。以上结果说明,紫菜rbcS和rbcL-rbcS基因间隔区序列的同源性较高,可用于种以上水平的系统分析。     

坛紫菜养殖技术之一坛紫菜固定柱悬浮式养殖技术

坛紫菜固定桩悬浮式养殖技术是在潮间带筏架养殖和浅海浮流式养殖基础上发展起来的一种先进养殖方法,其养殖技术的推广应用将坛紫菜养殖由传统单一的潮间带养殖模式向浅海养殖跨出突破性的一步,开创了坛紫菜养殖新领地,极大地拓展了养殖空间,使闽东地区坛紫菜养殖得到迅猛发展.     

微卫星标记在坛紫菜丝状体品系DNA指纹构建中的应用

用从条斑紫菜EST数据库中筛选合成的微卫星引物对8个坛紫菜丝状体品系进行微卫星DNA指纹扩增。5个微卫星引物共扩增出32条带,其中3对引物所扩增出的5个条带(AU192094—127、AU187410—335、AU187410—190、AU194267—203和AU194267—328)被用来构建8个坛紫菜丝状体品系的DNA指纹。在这个图谱中,每个丝状体品系都有独一的指纹模式,彼此很容易被区分开。所获得的DNA指纹图谱,可用来进行孟德尔分离研究,及为坛紫菜纯系鉴定提供分子基础。     

高温下芽孢杆菌对坛紫菜生长及生理的影响

坛紫菜是我国东海区栽培的重要经济海藻,其生长适温为20°C,极限高温为29°C。高温和病原菌均会导致坛紫菜生长受抑、藻体病烂。为研究高温下藻际微生物对坛紫菜生长的影响,本文以坛紫菜叶状体和藻际芽孢杆菌(实验证明该菌株在20°C下为紫菜的益生菌)为材料,检测了在28°C下藻际芽孢杆菌对坛紫菜相对生长率(RGR),抗氧化酶(SOD、POD)活性,可溶性蛋白、游离脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)和藻胆蛋白含量等生理指标的影响。结果显示,28°C下,在实验初始阶段,菌藻共培养组坛紫菜比纯培养对照组有较高的RGR,但随着培养时间的延长,两组的RGR无显著性差异;4 d后两组坛紫菜均出现腐烂,菌藻共培养组的藻体腐烂程度更为剧烈;培养24 h后,菌藻共培养组的SOD、POD活性和MDA水平均显著高于对照组,而渗透调节物质可溶性蛋白和Pro显著低于对照组;共培养组中,坛紫菜的藻胆蛋白含量均显著高于对照组。该研究表明,28°C下,虽然在短期内藻际芽孢杆菌会促进坛紫菜的生长,但随着培养时间的延长反而不利于坛紫菜的生长,且加剧活性氧和渗透压胁迫,表明该菌的生态功能因环境变化而发生了改变。     

坛紫菜冷藏网换网生产的初步研究

坛紫菜是文化大革命中发展起来的海水养殖新品种，它生长快、产量高，颇受社、队养殖场的欢迎。但目前坛紫菜的养殖是一次采苗(秋季壳孢子采苗)一次养成，收剪4～5次后，叶状体即变宽、变厚，质地粗糙，无光泽，鲜味差，产品质量低劣。为了使坛紫菜的养殖达到优质、高产、稳产，我们同普陀县虾峙公社南岙大队紫菜场协作，在舟山水产食品厂的协助下，进行了坛紫菜冷藏网换网生产(见图1)的初步研究。     

实现条斑紫菜有机化生产的途径和对策

我国有条斑紫菜和坛紫菜两种,坛紫菜主要集中在闽、浙两省,而条斑紫菜主要集中在江苏,鲁、辽有少量.条斑紫菜是一种经济海藻,也是海水藻类中的主要养殖品种,以其藻体薄嫩、品质优良、味道鲜美、价格高而受到国内外消费者的青睐,日本数百年前就已被作为贡品和保健食品使用.