高位池养殖过程凡纳滨对虾携带WSSV情况的动态变化

为了更好地预防对虾白斑综合征(WSS)的暴发,探讨该病毒病的流行规律,笔者针对养殖过程中对虾的携带WSSV情况展开调查。调查于2010年7月-2010年11月广东省汕尾市红海湾养殖场进行,从10口凡纳滨对虾高位养殖池中随机抽取6口进行跟踪采样。收集指标包括对虾生长状况、基本环境指标、浮游微藻种群结构和对虾病毒携带量等。本文重点报道利用实时定量PCR-TaqMan探针法检测6口精养池塘对虾体内WSSV的携带量变化情况,检测结果显示:①1-3号虾池苗种携带WSSV,其波动范围在1.3×103~1.7×104copy/g之间;②对虾在养殖过程中均带毒,鳃组织中的平均病毒携带量(2.3×109copy/g)多于肌肉组织中的平均病毒携带量(3.2×108copy/g),且变化趋势一致,但没有显著性差异(P>0.05);③在整个养殖过程中对虾WSSV携带量总体呈现波动上升的趋势,期间各池出现过数次高值。前期WSSV拷贝数的波动范围在1.3×103~3.0×107copy/g之间,后期上升到1.5×106~1.2×1011copy/g,使得某些池塘养殖对虾WSS暴发。调查结果说明:1)对虾携带WSSV可以进行养殖生长;2)WSSV在对虾体内的含量是变化的,且其变化存在着一定的规律性;3)这种变化规律主要体现在带毒量随着养殖时间的进行及外界水环境中某些主要因子的变化而变化,如:养殖时间越长,带毒量越高;养殖环境中某些关键环境因子的改变,如:温差较大,不良藻相转换,天气骤变等均可引起对虾体内病毒含量较大的波动。鉴此,作者提出,构建并维持良好的浮游微藻的群落结构,注意有害藻相改变时保持养殖水体环境稳定,对环境突变前后都做好应对对虾应激的措施等可以极大程度地减少WSS暴发的可能。本研究通过对WSSV的密切跟踪,旨在更好的反映其在养殖环境下的动态变化规律,以及受各种环境因子影响的情况,从而为预防对虾WSS提供依据和参考。     

铜绿微囊藻和小球藻对水环境pH的影响

以盐碱池塘优势微藻铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、小球藻(Chlorella pyrenoidosa)为研究对象,采用正交实验方法,研究不同温度(20℃,25℃,30℃)和光照强度(2000 lx,4000 lx,6000 lx)组合条件下两种微藻对水环境pH的影响。结果显示,处于对数生长期的铜绿微囊藻和小球藻均能使水环境pH上升。在本实验范围内,不同温度和光照强度组合条件下,铜绿微囊藻的生长均能使水环境pH显著上升至9.50以上,在温度25℃、光照强度2000 lx条件下,藻密度达最大值1.1×10~7 cells/m L,水环境pH也达到峰值10.83;小球藻生长亦能使水环境pH的上升,并随温度升高、光照强度增强而增大,在温度30℃、光照强度6000 lx条件下,藻密度达最大值8.1×10~6 cells/m L,水环境pH也达到峰值7.73。通过ANCOVA分析,水环境pH和藻细胞密度呈正相线性相关,铜绿微囊藻水环境pH和藻细胞密度相关系数R~2=0.904,小球藻水环境pH和藻细胞密度相关系数R~2=0.903。与小球藻相比,同等藻密度的铜绿微囊藻更易使水环境pH显著上升(P0.01),是池塘养殖水体pH偏高的主要原因之一,本研究旨在通过控制藻相方式进行水环境调控,从而防止池塘pH偏高提供了基础数据。     

WSSV＋斑节对虾的血清免疫相关酶对人工感染WSSV粗提液的反应

用含3×103拷贝·g^-1、6×1062拷贝·g^-1和2×10^2拷贝·g^-1的对虾白斑综合征病毒（white spot syndrome virus,WSSV）粗提液和PBS液（对照）注射感染病毒携带量约1×10^5拷贝·g^-1的斑节对虾（Penaeusmonodon）,分别于第15分钟、第30分钟、第1小时、第3小时、第6小时、第12小时、第24小时、第48小时、第72小时取样,研究了WSSV感染对斑节对虾血清内酸性磷酸酶（acidphosphatase,ACP）、碱性磷酸酶（alkalinephospha—tase,AKP）、酚氧化酶（phenoloxidase,PO）、过氧化物酶（peroxidase,POD）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性的影响。结果表明,在3种感染浓度下ACP、AKP、SOD活性总体呈现先上升后下降随后上升的趋势,其中SOD活性后期水平显著高于初期;PO、POD活性总体呈现先下降后上升随后下降最后上升的趋势,但PO后期活性水平与初期相当,而POD后期活性水平显著高于初期。各免疫相关酶的反应强度与WSSV的感染浓度存在一定关系,除ACP外其余4种酶的活性变化均以6×10^2拷贝·mL^-1浓度组最为敏感。PBS组5种免疫酶活性变化幅度均显著小于3种WSSV浓度感染组。     

感染白斑综合症病毒（WSSV）对虾相关免疫因子的研究

129尾中国对虾（Penaeus chinensis）分别捕自未暴发白斑综合症（WSSV病毒所致）虾池、WSSV暴发虾池以及曾暴发WSSV虾池。用斑点杂交和组织病理学方法确定各尾对虾的染毒（WSSV）程度。用96孔酶标板法测量相应个体血淋巴上清液的抗菌活力（Ua）、溶菌活力（U↓（L））、酚氧化     

溶藻细菌A3的溶藻特性

本研究以锥状斯氏藻(Scrippsiella trochoidea)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、四尾栅藻(Scenedesmus quadricauda)、条纹小环藻(Cyclotella striata)作为实验藻种,将浓度为107 CFU/ml的菌株A3分别加入到4种微藻的单种藻液、2种藻混合藻液、3种藻混合藻液中,每48 h观察藻细胞形态并统计藻细胞数量,实验周期为10d,以探究菌株A3对4种微藻的溶藻效果.结果显示,在单种藻实验中,加菌组锥状斯氏藻细胞于第1天失去运动活性,细胞拉长变形,第5天细胞壁破裂溶解,第10天细胞密度为7.07× 102 cells/ml,显著低于对照组的2.90× 104 cells/ml (P＜0.05);实验期间,加菌组蛋白核小球藻细胞形态保持完整,第10天藻细胞密度为2.58× 107 cells/ml,显著高于对照组的2.09× 107 cells/ml (P＜0.05);加菌组四尾栅藻细胞形态保持完整,与对照组藻细胞密度无显著差异(P＞0.05);加菌组条纹小环藻细胞于第8天溶解,第10天对照组与加菌组藻细胞密度分别为4.38× 105 cells/ml、1.78×105 cells/ml,加菌组藻细胞密度显著低于对照组(P＜0.05).混合藻实验中,菌株A3对各种微藻的溶藻效果与单种藻实验结果类似,菌株A3对锥状斯氏藻生长具有显著的溶藻作用,对蛋白核小球藻与四尾栅藻无溶藻作用,对条纹小环藻生长具有较弱的溶藻作用.研究表明,菌株A3具有溶藻选择性,对锥状斯氏藻具有显著的溶藻作用,而对其他3种藻无溶藻作用或溶藻作用相对较弱.     

溶藻细菌A3的溶藻特性

本研究以锥状斯氏藻(Scrippsiella trochoidea)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、四尾栅藻(Scenedesmus quadricauda)、条纹小环藻(Cyclotella striata)作为实验藻种,将浓度为107 CFU/ml的菌株A3分别加入到4种微藻的单种藻液、2种藻混合藻液、3种藻混合藻液中,每48 h观察藻细胞形态并统计藻细胞数量,实验周期为10 d,以探究菌株A3对4种微藻的溶藻效果。结果显示,在单种藻实验中,加菌组锥状斯氏藻细胞于第1天失去运动活性,细胞拉长变形,第5天细胞壁破裂溶解,第10天细胞密度为7.07×10~2 cells/ml,显著低于对照组的2.90×10~4 cells/ml(P0.05);实验期间,加菌组蛋白核小球藻细胞形态保持完整,第10天藻细胞密度为2.58×10~7 cells/ml,显著高于对照组的2.09×10~7 cells/ml(P0.05);加菌组四尾栅藻细胞形态保持完整,与对照组藻细胞密度无显著差异(P0.05);加菌组条纹小环藻细胞于第8天溶解,第10天对照组与加菌组藻细胞密度分别为4.38×105 cells/ml、1.78×10~5 cells/ml,加菌组藻细胞密度显著低于对照组(P0.05)。混合藻实验中,菌株A3对各种微藻的溶藻效果与单种藻实验结果类似,菌株A3对锥状斯氏藻生长具有显著的溶藻作用,对蛋白核小球藻与四尾栅藻无溶藻作用,对条纹小环藻生长具有较弱的溶藻作用。研究表明,菌株A3具有溶藻选择性,对锥状斯氏藻具有显著的溶藻作用,而对其他3种藻无溶藻作用或溶藻作用相对较弱。     

对虾白斑综合症病毒暴发流行与传播途径、气候和水体理化因子的关系及其控制措施

白斑综合症病毒（whitespotsyndromevirus,WSSV）,又称白斑杆状病毒（whitespotbaculovirus）、皮下与造血组织坏死杆状病毒（hepodermalandhematopoieticnecrusisbaculovirus）、日本对虾棒状病毒（Rodshapevirusofpenaeusjaponicus）、白斑综合症杆状病毒（whitespotsyndromebaculovirus）、系统性外胚层和中胚层杆状病毒（systemicectodermalandmesodermalbaculovires）等。WSSV为全球养殖对虾危害性最大的病毒,每年因WSSV全球养殖对虾产量减少一半,损失几百亿元人民币。近年,随着对WSSV认识的逐渐深入,对虾养殖技术有所提…     

宁夏地区不同模式养殖池塘夏季浮游微藻群落特征

为研究宁夏地区夏季不同模式养殖池塘的浮游微藻群落结构特征,采集了当地棚塘接力养殖(PT)、稻渔种养(DY)、土池养殖(TC) 3种模式的池塘水体样品,分析了其浮游微藻群落组成及其与水质因子的相关性。结果显示,共检出浮游微藻5门27属,总数量为1.52×104~2.39×108 ind./L,生物量为0.16~97.78 mg/L,数量多样性为0.03~3.31,生物量多样性为0.29~3.58。不同模式池塘的浮游微藻群落结构差异显著。PT模式池塘的微藻群落无明显共性特征,蓝藻(Cyanophyta)、绿藻(Chlorophyta)和硅藻(Bacillariophyta)占优势情况均有出现,如拟鱼腥藻(Anabaenopsis sp.)、鱼腥藻(Anabaena sp.)、颤藻(Oscillatoria sp.)、盘星藻(Pediastrum sp.)、卵囊藻(Oocystis sp.)、小环藻(Cyclotella sp.)等;TC模式池塘的微藻优势属单一,分别以盘星藻、小球藻(Chlorella sp.)和微囊藻(Microcystis sp.)占优势;DY模式池塘的微藻多样性丰富,以小球藻、栅藻(Scenedesmus sp.)、盘星藻、卵囊藻、刚毛藻(Cladophora sp.)等绿藻和小环藻、菱形藻(Nitzschia sp.)等硅藻为优势藻。蓝藻生物量与水体中硝酸盐氮(NO3–-N)、亚硝酸盐氮(NO2–-N)、化学需氧量(COD)浓度呈显著正相关(P<0.05)。研究表明,宁夏地区夏季温度高、光照时间长,池塘水体中C、N营养高,易形成以微囊藻、拟鱼腥藻等有害蓝藻优势种群;调控池塘水质时应将其作为关键控制点之一,防控有害藻华暴发而导致减产降效的不良状况发生。     

抗“腐皮综合症”刺参体腔液指标变化的初步研究

对用“腐皮综合症”致病菌灿烂弧菌（Vibrio splendidus）感染刺参的7个体腔液指标进行了测定。结果显示：1）抗病刺参和易感刺参体腔液吸光值和颗粒细胞浓度在第10天差异显著（P〈0．05）。2）抗病刺参和易感刺参总细胞浓度和透明细胞一淋巴样细胞浓度在第5天差异显著（P〈0．05）。3）抗病刺参体腔液碱性磷酸酶活力在试验各天均保持较高水平，且在第10天与易感刺参有显著差异（P〈0．05）；易感刺参体腔液酸性磷酸酶活力在第5天明显高于抗病刺参（P〈0．05），之后各天迅速降低，并显著低于抗病刺参（P〈0．05）。4）抗病刺参和对照组刺参超氧化物歧化酶活力各天始终无显著蒡异（P〉0．05）．抗病刺参和易感刺参在第10天蒡异昂著（P〈0．05）．     

WSSV蛋白酶性质的研究

从感染白斑综合症病毒(Whitespotsyndromevirus,WSSV)的对虾中提取和纯化WSSV,对其蛋白酶活力进行分析。结果表明,WSSV蛋白酶具广泛的pH稳定性,当pH达7.5时,蛋白酶活性最大;pH高于10 0时,酶活力很低,其蛋白酶偏碱性。丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)对酶活性有抑制作用。Ca2 、Mn2 、Fe2 和Cu2 可降低WSSV蛋白酶活性,但Mg2 有轻微的激活作用。胰蛋白酶抑制剂在浓度为12.5～25.0mg/L时,对WSSV蛋白酶活性无影响。Leupeptin使蛋白酶活性降低12.29%。Chymostatin在质量浓度为12.5～25.0mg/L时,对WSSV蛋白酶活性有强烈的抑制作用,表明WSSV蛋白酶类属胰凝乳蛋白酶。蛋白质修饰剂对WSSV蛋白酶活性影响的研究结果表明,组氨酸残基为WSSV蛋白酶活性基团,而巯基为非必需基团,说明WSSV蛋白酶为非巯基依赖型的蛋白酶。     

藻—溞系统对凡纳滨对虾养殖水体调控效果的研究

取5000 mL灭菌后的凡纳滨对虾养殖尾水于5000 mL高压灭菌的烧杯中,分为10组,分别为蛋白核小球藻组(C1)、蛋白核小球藻+大型溞组(C2)、衣藻组(C3)、衣藻+大型溞组(C4)、隐藻组(C5)、隐藻+大型溞组(C6)、蛋白核小球藻+衣藻组(C7)、蛋白核小球藻+衣藻+大型溞组(C8)、衣藻+隐藻组(C9)、衣藻+隐藻+大型溞组(C10),每个处理组设3个平行。各藻种原始藻液25 mL,接种初始密度为1×10^( 8) 个/mL,大型溞密度为1个/L。试验烧杯置于25 ℃、3000lx和14L∶10D光暗比的培养箱内常规培养。每间隔3 d的10:00测定溶液的pH、溶解氧、总氮、氨氮、硝态氮、亚硝态氮、总磷和叶绿素a等水质指标,研究不同藻—溞组合系统对凡纳滨对虾养殖水体净化效果及其生长的影响。试验结果显示,各处理组藻类及大型溞均可正常生长,且藻—溞组合系统具有较好的水质净化调控效果,尤其是蛋白核小球藻+衣藻+大型溞组,至试验结束时其硝态氮、亚硝态氮和氨氮的去除率分别为82%、77%和99%;混合藻生长速度要低于单一藻培养,其中蛋白核小球藻组和衣藻组微藻的相对生长速率最高,分别为27.7%和26.9%;且蛋白核小球藻最有利于大型溞的生长繁殖,至试验结束时由5个增至88个,其次是衣藻,增至80个,而隐藻最差,仅增至59个。培养初期,大型溞的扰动作用能够促进藻类的生长,随着大型溞数量的增多,大型溞的牧食压力能够阻止藻密度过密,从而能够长久维持有益藻相的稳定。在本试验研究条件下,接种蛋白核小球藻、衣藻以及大型溞最适于养殖水环境调控,维持藻相稳定。     

对虾白斑综合征病毒(WSSV)高分子量结构蛋白的分离

采用蔗糖密度梯度离心从患病对虾组织中提取WSSV,应用SDS-PAGE对WSSV结构蛋白进行了分析。采用12％分离胶,将WSSV样品煮沸5min,应用SDS-PAGE分离了WSSV的中低分子量结构蛋白,并将该结果与其他学者已发表的结果进行了比较。首次通过延长样品煮沸时间,采用8％分离胶,应用SDS-PAGE分离到了WSSV100kD以上的13条高分子量结构蛋白,计算出了每条蛋白带的分子量及其在总蛋白中的百分含量。其中WSSV高分子量结构蛋白的分离丰富了WSSV的研究范围,对今后深入的研究工作具有重要意义。     

Experimental infection of European crustaceans with white spot syndrome virus (WSSV)

Eight European marine and freshwater crustaceans were experimentally infected with diluted shrimp haemolymph infected with white spot syndrome virus (WSSV). Clinical signs of infection and mortalities of the animals were routinely recorded. Diagnosis was by direct transmission electron microscopy (TEM), DNA hybridization (dot-blot and in situ hybridization) using WSSV probes and by PCR using WSSV specific primers. High mortality rates were noted between 7 to 21 days post-infection for Liocarcinus depurator , Liocarcinus puber , Cancer pagurus , Astacus leptodactylus , Orconectes limosus , Palaemon adspersus and Scyllarus arctus . Mortality reached 100%, 1 week post-infection in P. adspersus . When infection was successful, direct TEM observation of haemolymph revealed characteristic viral particles of WSSV, some observed as complete virions (enveloped), others as nucleocapsids associated with envelope debris. WSSV probes showed strong positive reactions in dot-blots and by in situ hybridization in sections and specific virus DNA fragments were amplified successfully with WSSV primers. White spot syndrome virus was pathogenic for the majority of the crustaceans tested. This underlines the epizootic potential of this virus in European crustaceans.     

Development of monoclonal antibodies against VP28 of WSSV and its application to detect WSSV using immunocomb

White spot disease (WSD) is an important viral disease of penaeid shrimp caused by white spot syndrome virus (WSSV). WSSV isolated from WSD outbreaks in commercial shrimp (Penaeus monodon) farms in India were propagated in the laboratory in healthy shrimp. The virus was purified from the infected tissues by sucrose gradient centrifugation. The VP28 was electroeluted from SDS-PAGE gels and was used to immunize Balb/c mice to produce hybridomas secreting monoclonal antibodies (MAb) against WSSV. A total of five hybridoma clones secreting MAbs to VP28 were produced. The MAbs were of the isotypes IgG1, IgG2b and IgM. The MAbs reacted with VP28 of WSSV and not with any other viral or shrimp protein in western blot. The MAbs were used to develop dot immunoblot assay using an immunocomb to detect WSSV from field samples. The test developed had an analytical sensitivity of 625 pg and a diagnostic sensitivity of 100% compared to single step polymerase chain reaction (PCR). The test can be used as an alternate for first step PCR to detect WSSV from field samples.     

氨氮胁迫下白斑综合征病毒对凡纳滨对虾的致病性

为了评价养殖水环境中氨氮(NH_4-N)对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的危害性,开展了NH_4-N胁迫对凡纳滨对虾感染白斑综合征病毒(WSSV)后的死亡率、WSSV增殖速率和对虾主要免疫相关酶活性影响的实验。在NH_4-N胁迫质量浓度为15.6 mg·L-1,分别注射2×105和2×106个WSSV粒子,结果显示,NH_4-N胁迫下注射2×105个WSSV粒子的凡纳滨对虾第144小时死亡率达到53.3%,显著高于无胁迫组(40.0%)。对虾鳃组织WSSV荧光定量PCR检测结果显示,NH_4-N胁迫下凡纳滨对虾鳃组织内WSSV的增殖加快。此外,免疫相关酶活性结果显示,NH_4-N浓度突变会促使对虾血清中酚氧化酶(PO)、酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)活性短暂升高后持续降低。由此可见,NH_4-N胁迫会加快WSSV在患病凡纳滨对虾体内的增殖,导致更高死亡率,这可能是因为胁迫造成了对虾免疫相关酶活性降低和抗病原感染能力下降。     

中国对虾雄性生殖系统感染WSSV在其垂直传播中的作用

通过人工感染实验,对中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)雄性亲虾进行投喂感染。在确定其携带WSSV粒子后,将被WSSV感染的精荚人工移植到健康的雌虾纳精囊内。在无其他病源的情况下,促其产卵繁殖,统计各组子代的受精率、孵化率及无节幼体至溞状幼体的变态率贸?式PCR技术对亲虾及子代进行WSSV检测。结果表明,受WSSV感染的精荚能够把病毒传播给健康雌虾,雌虾能产出携带WSSV的卵子,培育出带毒幼体。各组子代的受精率、孵化率及变态率的统计结果表明,感染组和对照组在受精率上没有明显区别,受WSSV感染的精卵细胞可以正常结合。对照组受精卵的孵化率明显高于感染组,差异显著(P=0.045<0.05)。对照组无节幼体的变态率也高于感染组。说明WSSV的入侵对受精卵及幼体的发育有影响,WSSV感染导致部分受精卵及幼体不能正常发育或死亡。     

Rotifer cellular membranes bind to white spot syndrome virus (WSSV)

Cell membranes from the rotifer, Brachionus urceus, were obtained by centrifugation and found to specifically bind white spot syndrome virus (WSSV) in vitro. This finding suggests that there is likely a WSSV receptor on the rotifer cell membrane and provides evidence that rotifers may be a host for WSSV.