海南三亚斑节对虾野生种群mtDNA 16S rRNA基因和控制区序列的多态性

采用聚合酶链式反应(PCR)技术对海南三亚野生斑节对虾(Penaeus monodon)20个个体的mtDNA 16S rRNA基因和控制区序列进行扩增,PCR产物经纯化后进行测序,得到16S rRNA基因的495 bp的核苷酸序列和控制区序列470 bp的核苷酸片段。用Clustal X软件对16S rRNA和控制区序列进行了比对,通过ARLEQUIN 2000软件对所得线粒体16S rRNA基因片段和控制区序列进行了比较分析。16S rRNA序列检测出17个多态位点,8种单倍型；控制区序列检测出100个多态位点,17种单倍型。该种群16S rRNA序列基因多样度(H)和碱基多样度(π)分别为0．700和0．0045；控制区序列的H和π分别为0．984和0．0480。研究结果表明：16S rRNA序列不适应斑节对虾的种群遗传多样性分析；控制区序列适应斑节对虾种群遗传多样性研究。     

中国沿岸几种鲍线粒体16S rRNA基因片段序列比较及鲍属系统发育

用PCR技术克隆耳鲍（Haliolis asinina）、羊鲍（H．ovina）和多变鲍（H．varia）的线粒体16S rRNA基因的片段，并将PCR产物直接进行测序，得到长度530bp左右的片段。将这些序列与杂色鲍（H．diversicolor diversicolor）、九孔鲍（H．diversicolor supertexte）、大鲍（H．gigantea）、盘鲍（H．discus discus）、皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai）等5种鲍的相应片段进行序列比较。结果表明，不同种鲍间16S rRNA基因的序列同源性较高，同源性范围为87．36％～90．77％，这说明鲍的这段基因片段在遗传过程中比较保守。序列的A＋T含量约为56．68％，G＋C含量约为43．32％。8种鲍序列的主要核苷酸变异位点集中在1-25bp、240-290bp和320～370bp3个区域。在序列的变异碱基巾，碱基的转换大大多于碱基的颠换，转换与颠换之比达到2．33：1，遗传距离的范围为0．002-0．128。用UPGMA法和NJ法绘制出8种鲍的系统发育树。结论认为，大鲍、皱纹盘鲍和盘鲍之间的遗传差异水平为亚种间的差异水平，台湾产的九孔鲍与大陆沿岸产的杂色鲍之间的差异仅仅是种群间的差异。     

3种青蟹线粒体12S rRNA基因序列分析

对采自泰国、马达加斯加和日本各地的青蟹属的3种青蟹Scylla serrata(Forskal)、S．oceanica(Dana)和S．tranquebarica(Fabricius)的线粒体12S rRNA基因片段序列进行了测定，分析研究了其种间遗传差异及系统发育关系。研究结果显示：S．serrata、S．oceanica及S．tranquebarica在12SrRNA基因片段上存在长度差异，3种青蟹的序列长度分别为422bp、426bp、425bp；种内个体间无序列差异或差异极小，种间序列差异远大于种内差异。以日本鲟和底栖短桨蟹为外群，采用距离法和最大简约法重新构建了3种青蟹的分子系统树，得到的三个明显的分枝分别对应于上述3种青蟹，S．oceanica与S．tranquebarica两种间的亲缘关系较近。研究结果支持3种青蟹为不同物种的观点，建议对其进行分别的渔业管理。     

2种东风螺线粒体基因序列多态性研究

对来自粤东和粤西的方斑东风螺(Babylonia areolata(Link))和台湾东风螺(Babylonia formosae(Sowerby))的线粒体16S rRNA和COⅠ基因片段的序列进行分析,并对其遗传变异进行了比较研究。得到的序列总长度分别为506 bp(16S rRNA)和640 bp(COⅠ)。2种东风螺序列的碱基组成均显示较高的A T比例(16S rRNA基因63.5%,COⅠ基因62.4%)。对位排序比较表明,16S rRNA基因片段变异较小,台湾东风螺和方斑东风螺各存在1个碱基变异位点;方斑东风螺COⅠ片段有12个碱基存在变异,包括3个简约信息位点和9个单一多态位点;台湾东风螺COⅠ片段有17个碱基存在变异,包括4个简约信息位点和13个单一多态位点。数据分析结果表明:2种东风螺线粒体的COⅠ基因比16SrRNA基因具有更高的多态性,COⅠ基因序列更适用于东风螺种群的遗传多样性分析。方斑东风螺的平均核苷酸差异和核苷酸多样度分别为2.68和0.004 2,台湾东风螺则分别为5.62和0.007 8,说明台湾东风螺的遗传多样性高于方斑东风螺。无论是方斑东风螺和台湾东风螺,粤东群体的平均核苷酸差异和核苷酸多样度都大于粤西群体,说明粤东群体的遗传多样性高于粤西群体。     

4种鳕鱼线粒体16SrRNA、COI和Cytb基因片段序列的比较研究

对狭鳕(Theragra chalcogramma)、太平洋鳕(Gadus macrocephalus)、蓝鳕(Micromesistius poutassou)和远东宽突鳕(Eleginus gracilis)4种不同属鳕鱼的线粒体16S rRNA、Cytochrome oxidase subunit I(COI)和细胞色素b(Cyt b)基因片段序列进行了测定,分析比较了不同鳕鱼种间的序列差异.通过PCR扩增和序列测定,得到4种鳕鱼线粒体3个基因片段的总长度分别为539 bp(16S rRNA)、601 bp(COI)和385 bp(Cyt b),其基因片段的A+T含量都较高.4种鳕鱼种内个体间序列变异较小,3个基因片段的核苷酸替代速率依次为Cyt b＞ COI ＞16S rRNA.Cyt b 基因片段序列的分析结果显示太平洋鳕和狭鳕间分歧时间约为219万年,发生于中新世(Mio-cene);宽突鳕与蓝鳕间分歧时间约为653万年,发生在上新世(Pliocene).根据遗传距离构建的NJ系统树表明,狭鳕与太平洋鳕的亲缘关系较近,与蓝鳕的亲缘关系较远.     

海南三亚斑节对虾野生种群mtDNA 16S rRNA基因和控制区序列的多态性

采用聚合酶链式反应(PCR)技术对海南三亚野生斑节对虾(Penaeus monodon)20个个体的mtDNA 16S rRNA基因和控制区序列进行扩增,PCR产物经纯化后进行测序,得到16S rRNA基因的495 bp的核苷酸序列和控制区序列470 bp的核苷酸片段.用Clustal X软件对16S rRNA和控制区序列进行了比对,通过ARLEQUIN 2000软件对所得线粒体16S rRNA基因片段和控制区序列进行了比较分析.16S rRNA序列检测出17个多态位点,8种单倍型;控制区序列检测出100个多态位点,17种单倍型.该种群16S rRNA序列基因多样度(H)和碱基多样度(π)分别为0.700和0.0045;控制区序列的H和π分别为0.984和0.0480.研究结果表明16S rRNA序列不适应斑节对虾的种群遗传多样性分析;控制区序列适应斑节对虾种群遗传多样性研究.     

卵形鲳!线粒体１６ＳｒＲＮＡ基因全长序列的克隆与分析

根据近源物种线粒体序列的同源比对，在16S rRNA基因上下游保守区域设计一对通用引物。PCR扩增获得特异的DNA片段，经克隆、测序和比对证实该片段包含了卵形鲳鲹线粒体16S rRNA全长序列1725bp。对5个个体分别测序后比对，发现卵形鲳鲹16S rRNA基因在钦州湾种群个体间存在至少7个变异位点，使5个个体分别具有5种不同的单倍型。将卵形鲳鲹和鲹科其它物种的16S rRNA序列进行比，根据比对结果构建的鲳鲹科各物种的系统进化树，支持鲹科下设四个亚科(鲹亚科，鰤亚科，鲳鲹亚科，鰆鲹亚科)的分类系统。综上所述，16S rRNA基因既可用于卵形鲳鲹种群遗传多样性分析，又适用于鲹科鱼类的系统进化分析。     

长江、辽河、瓯江三水系中华绒螯蟹mt12SrDNA片断序列的比较

本实验根据马蹄铁鲎mtDNA 12SrRNA基因序列进行了中华绒螯蟹mtDNA 12SrRNA基因的引物设计，并对长江、辽河、瓯江三水系各5个个体共15个个体进行了PCR扩增及其序列测定。结果表明，12SrRNA基因序列在长江种群、辽河种群、瓯江种群间几乎没有差异，仅在3号瓯江蟹415bp处发现有一碱基颠换，去掉两端引物共测定得到415bp的碱基序列，其中A、T、G、C含量分别为145bp(34．9％)，165bp(39．8％)，45bp(10．8％)和60bp(14．5％)。     

3种白鲑线粒体细胞色素b和16S rRNA基因片段序列分析

对黑龙江水域的乌苏里白鲑(Coregonus ussuriensis)和由俄罗斯引种的贝加尔凹目白鲑(C.autumnalis migrato-rius)和高白鲑(C.peled)的线粒体细胞色素b(Cytb)和16S rRNA基因片段进行了扩增和序列测定,分析比较了3种白鲑间的序列差异。在402 bp的Cytb基因片段中,3个乌苏里白鲑个体中出现了2种单倍型,种内个体间有2个碱基的差异,而贝加尔凹目白鲑和高白鲑的个体各出现1种单倍型;在577 bp的16S rRNA基因片段中,3个乌苏里白鲑个体出现了2种单倍型,种内个体间存在1个碱基的差异,而贝加尔凹目白鲑和高白鲑2个种的序列完全相同。研究结果表明,Cytb基因适用于白鲑的分子系统发育研究。基于Cytb基因片段序列,利用Kimura-2模型构建的NJ树表明:乌苏里白鲑与贝加尔凹目白鲑亲缘关系较近;乌苏里白鲑与贝加尔凹目白鲑和高白鲑的分歧时间分别约为62.5万年和152万年,在更新世。[中国水产科学,2007,14(1):8-14]     

驼背鲈线粒体细胞色素b基因的序列分析

采用PCR—DNA测序技术，对驼背鲈线粒体DNA细胞色素b（Cytb）基因全序列进行分析。获得长度为1141bp的Cytb基因片段，序列碱基组成平均是T为29．1％，C为32．3％，A为23．2％，G为14．0％，A＋T的碱基百分比总体上略大于C＋G，平均值分别是52．3％和46．3％。与其它鱼类相同基因片段碱基序列含量相似。在由核苷酸推导的氨基酸中，亮氨酸（Leu）所占的比例最高，为16．03％。     

三个不同品系中华鳖形态差异分析

通过测量中华鳖(Pelodiscus sinensis)淮河品系(3龄)、黄河品系(8月龄)和日本品系(8月龄)的10项形态参数,对不同品系和性别的形态差异进行分析。主成分分析表明,3个品系4个主成分的累计贡献率为80.5%,其中第1主成分是中华鳖的体型因子,贡献率最大,3个品系的形态差异主要体现在体型上。通过逐步判别法建立了3个品系的判别函数,淮河、黄河和日本品系的判别准确率分别为91.7%、75.0%和73.8%,淮河鳖的形态与其他品系的中华鳖存在较大的差异。3个品系中不同性别的判别分析显示,淮河品系中华鳖雌雄判别准确率也较高,综合判别率为88.3%,判别效果最好,建立的判别函数可初步用于不同品系不同性别中华鳖的鉴定。中华鳖形态特征的差异分析为今后中华鳖种质资源鉴定和新品种(系)的选育提供了参考依据。     

中华绒螯蟹与日本绒螯蟹线粒体DNA12SrRNA序列的比较

参考果蝇和蚤状Ｚａｏ的线粒体ＤＮＡ １２Ｓ ｒＲＮＡ序列进行了中华绒螯蟹与日本绒螯蟹的线粒体ＤＮＡ１２ＳｒＲＮＡ基因片段的引物设计、ＰＣＲ扩增及序列测定。两种的碱基序列长度相同，为４５７ｂｐ，其Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ含量相似，分别为１５９ｂｐ（３４．７９％）、１７７ｂｐ（３８．７３％）、５１ｂｐ（１１．１６％）、７０ｂｐ（１５．３２％）和１５９ｂｐ（３４．７９％）、１７８ｂｐ（３８．９５％）５０ｂｐ（１０．９４％）、７０ｂｐ（１５．３２％）。中华绒螯蟹与日本绒螯蟹间有５处碱基序列差异，在９８ｂｐ、１５１ｂｐ、３１７ｂｐ和４１７ｂｐ碱基处为碱基转移，在２９４ｂｐ碱基处为碱基颠换。     

中华鳖2个培育品系的16S rRNA基因多态性比较分析

以中华鳖(Pelodiscus sinensis)日本品系、清溪乌鳖两个国家水产新品种为研究对象, 并以中华鳖黄河群体和台湾群体为对照, 克隆测序获得了其16S rRNA基因全长序列1 606 bp, 并对群体遗传多样性进行比较分析。结果表明, 在4群体共80个个体中, 共检测到53个变异位点, 包括9个群体特异性位点, 其中清溪乌鳖3个, 中华鳖日本品系和黄河种群各1个, 台湾群体4个; 共发现16种单倍型, 其中清溪乌鳖8个、中华鳖日本品系2个、中华鳖黄河群体和台湾群体各3个, 群体间无共享单倍型。中华鳖不同群体的16S rRNA基因多样性从高到低依次为清溪乌鳖(0.821)、中华鳖台湾群体(0.484)、中华鳖黄河群体(0.195)、中华鳖日本品系(0.100)。中华鳖日本品系和黄河群体、清溪乌鳖和台湾群体的遗传距离相对较近, 分别为0.001和0.005。不同群体的单倍型各自聚为一支, 表明中华鳖群体分化较为明显, 不同群体的特异性位点可作为种质鉴别的依据。单倍型进化树显示, 中华鳖日本品系和黄河群体以很高的置信度聚为一支, 推测中华鳖日本品系起源于中国黄河流域。

     

中华绒螯蟹线粒体DNA l2S rRNA基因片段的序列研究

首次进行了中华绒螯蟹（ Ｅｒｉｏｃｈｅｉｒ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）线粒体 ＤＮＡ １２ＳｒＲＮＡ的序列分析。参考果蝇、蚤状溞序列对中华绒螯蟹线粒体ＤＮＡ １２ＳｒＲＮＡ基因片段做了引物设计、ＰＣＲ扩增及序列测定，结果得到 ４５７ ｂｐ的碱基序列，其Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ含量分别为 １５９ｂｐ（３４．７９％）、１７７ｂｐ（３８．７３％）、５１ｂｐ（１１．１６％）、７０ｂｐ（ １５． ３２％），与果蝇、蚤状溞的相同基因片段的序列含量基本相似。     

中华鳖StAR基因的克隆、表达及多克隆抗体制备

摘要 为探索StAR基因在中华鳖（Pelodiscus sinensis）性腺发育过程中的作用，利用RACE技术克隆获得中华鳖StAR基因全长cDNA，采用Real-time PCR分析其在不同组织及胚胎不同发育时期的表达情况，并制备多克隆抗体，采用western blot检测StAR在不同组织的表达，通过免疫组化对其在细胞中的表达进行定位，同时检测芳香化酶抑制剂来曲唑处理雄性中华鳖后StAR在精巢中的表达情况。结果显示：该基因全长2377bp，开放阅读框903bp，编码300个氨基酸。氨基酸序列比对及系统进化分析表明，中华鳖StAR与龟类亲缘关系最近。荧光定量PCR结果表明，StAR基因在精巢中表达量最高，显著高于其他组织；StAR基因于中华鳖胚胎发育16期已有表达，20期表达量最高，提示StAR可能参与中华鳖早期性腺分化;来曲唑处理的中华鳖精巢中，StAR表达量显著降低。本研究利用原核表达系统构建中华鳖StAR基因原核重组表达载体，经蛋白纯化后免疫小鼠，获得中华鳖StAR多克隆抗体。Western blot检测结果显示StAR在不同组织的表达量与荧光定量结果基本一致。免疫组化结果显示，StAR蛋白在卵巢间质细胞、精巢的间质细胞，精原细胞及胞质中表达。研究表明，StAR基因可能参与中华鳖性腺发育过程。     

Sequence variability in the mitochondrial DNA control region of five Sebastes species

ABSTRACT: Sequence variability of the control region of mitochondrial DNA in five Sebastes species ( S. thompsoni , S. joyneri , S. inermis , S. schlegeli and S. owstoni ) was investigated. Of 324 nucleotide sites in the control region of S. thompsoni , 56 sites (17.3%) varied, and all 20 individuals had different haplotypes. The other four species had between five and 17 sites (1.5–5.9%), which was fewer than that observed in S. thompsoni . The nucleotide diversity of S. thompsoni was highest (3.45%) among the five species, and that of S. schlegeli was the lowest (0.19%). The results demonstrated that sequence variability exists in the control region of the five Sebastes fishes investigated, and that sequence data in the control region may be suitable for stock structure analysis. Also, the extent of genetic variablitiy in the control region differed among these species. In particular, the mitochondrial DNA control region in S. thompsoni was characterized by high sequence variability, which may indicate a large effective population size.     

细鳞斜颌鲴三个群体线粒体COⅡ基因的遗传变异

应用线粒体COⅡ基因序列分析了细鳞斜颌鲴(Plagiognathops microlepis)三个群体(梁子湖群体、龙窝湖群体和淮河群体)的遗传变异关系.结果显示:测序得到细鳞斜颌鲷线粒体COⅡ基因大小为681 bp,A+T含量(56％左右)明显高于G+C含量.三个群体18个个体共测出5种单倍型,42个核苷酸变异位点,...     

循环水养殖系统中高毒力嗜水气单胞菌的鉴定与药敏试验

为探究中华鳖（Pelodiscus sinensis）循环水养殖过程中出现体表穿孔和溃疡的病因，对患病中华鳖的肝、脾、肺和肾等部位取样并进行病原菌分离及革兰氏染色，利用16S rRNA测序和生化鉴定相结合进行细菌鉴定，通过毒力基因PCR检测和人工回感试验评估细菌的致病性，以纸片扩散法评估几种抗生素的抑菌效果，利用琼脂打孔法评估中药提取物的抑菌效果。结果显示，从病鳖的脏器中分离到一株优势菌AH0421，该菌为革兰氏阴性菌，菌体呈短杆状；菌株AH0421 与嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）模式菌株ATCC 7966 的16S rRNA 序列相似性高达99.66%。菌株AH0421 能利用葡萄糖、蔗糖和麦芽糖，具有O/129 耐受性，其携带act、aerA、aha、ahh、ahp、ahpA、alt、ast、hlyA、lip、ompA毒力基因。回感试验出现与自然发病相似病症，菌株AH0421半致死浓度(LC50)为1.7×106CFU/mL。中药五味子提取物、诺氟沙星、多西环素、恩诺沙星、新霉素以及头孢克肟、头孢曲松等头孢类抗生素对该菌有较强的抑制作用。研究表明，五味子和多数头孢类抗生素可作为治疗菌株AH0421感染的参考药物。     

Molecular cloning and characterization of the cathepsin L gene in Pelodiscus sinensis and its expression in response to bacterial challenge

Cathepsin L is one of the most important lysosomal cysteine proteases for the initiation of protein degradation, and it is involved in the immune response in many vertebrates. However, its function in the innate immune system of turtles remains poorly understood. Here, we cloned the cathepsin L gene from the Chinese soft‐shelled turtle Pelodiscus sinensis. We then examined the mRNA expression in different tissues and at different time points after infection by Aeromonas hydrophila or Vibrio parahemolyticus. The full‐length cDNA sequence cloned from P. sinensis was 1,805 bp with a 1,071 bp open reading frame, which encodes a 40.39 kDa polypeptide of 356 amino acids. The deduced protein sequence contained an active triad of Cys, His and Asn, and conserved ERWNIN and GNFD motifs. Homology analysis showed that the deduced amino acid sequence shared 77%–96% identity with other known species. Sequence alignment, phylogenetic analysis and structural comparisons revealed that cathepsin L is a member of the cathepsin family. Real‐time PCR analyses showed that turtle cathepsin L mRNA is ubiquitously expressed in various tissues, and the expression level is higher in the liver than in other tissues. The expression level in the liver peaks 24 hr after A. hydrophila infection and at two times (12 and 72 hr) after V. parahemolyticus infection. These results suggest that the cathepsin L gene of P. sinensis is likely involved in the process of the antibacterial response to A. hydrophila and V. parahemolyticus. This study is of great importance for future work exploring the molecular mechanism of antibacterial immune responses in P. sinensis.