中华鳖体表和体内菌群多样性分析

采用16S rDNA分析方法,分别提取中华鳖体表和体内细菌总DNA,以之为模板进行PCR扩增获得细菌16S rDNA基因片段,并构建16S rDNA克隆文库.从2个文库中分别随机选取100个重组克隆子,抽提重组质粒,用Hae Ⅲ和MspⅠ限制性内切酶进行酶切,获得酶切指纹图谱,从每种图谱随机挑选克隆子测序,获得其16S rDNA部分序列,构建了系统进化树.在中华鳖体表和体内细菌克隆文库中分别包含13种和10种RFLP谱型,分别挑选了70个和60个克隆子进行测序.结果表明,中华鳖体表和体内文库克隆子分别归为15类和11类OTU,体表和体内菌群多样性较强,优势细菌类群分别为拟杆菌和变形菌,并在文库中检测到了几株益生菌和条件致病菌.     

象山港南沙岛不同养殖模式沉积物微生物群落结构分析

通过构建16S rDNA克隆文库对象山港南沙岛不同养殖模式(贝类养殖、藻类养殖及网箱养殖)表层沉积物微生物多样性和群落结构特征进行了比较和分析,共获取136个OUT。其中,贝类养殖区、藻类养殖区和网箱养殖区OTU分别为58、48和57个。各站位OTU分布差异明显,表现出高度的多样性。基于16S rDNA序列的生物多样性和丰富度分析表明,网箱养殖区丰富度指数ACE为739,香浓指数H?为3.8,均为最高值,丰富度指数Chao为245,略低于于贝类养殖区。贝类养殖区丰富度指数Chao为303,在各养殖区中最高。藻类养殖区丰富度指数ACE为174、Chao为89,香浓指数H?为3.6,均为最低值。系统发育分析表明,南沙岛各养殖区的优势种群均为变形菌门(Proteobacteria),但是藻类养殖区微生物群落结构与其他养殖区域相比,16S rDNA克隆文库差异显著,其中根瘤菌属(Rhizobium)及其他光合细菌在藻类养殖区分布较多。网箱养殖区沉积物表层微生物群落中出现了与环境污染密切相关的菌群,如志贺氏菌属(Shigella)、埃希氏菌属(Escherichia)和ε-变形菌纲的微生物种群,揭示网箱养殖对底质沉积物环境的影响较大。     

应用RFLP和DGGE技术分析工厂化养殖凡纳滨对虾肠道微生物群落特征

本研究应用PCR-RFLP(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism)和PCR-DGGE(Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)技术,对工厂化养殖的凡纳滨对虾肠道菌群进行多样性分析。RFLP结果显示,8月样品中不同的克隆子为5个,其中以不可培养细菌(Unculturable bacteria)为主要优势菌,其次为鲁杰氏菌属菌种Ruegeria spp.和Rhodobacterales spp.。依据微生物多样性的覆盖率分析结果表明,所构建16S rDNA克隆文库的覆盖率为97.5%。10月样品中克隆子为8个,其中以不可培养细菌、芽孢杆菌属Bacillus spp.和弧菌属Vibrio spp.为主要优势菌属,其次为Photobacterium spp.和Neptunomonas spp.;所构建16S rDNA克隆文库的覆盖率为90.8%。应用DGGE分析8月和10月对虾肠道样品,菌群以不可培养细菌和弧菌属为主,其次为Streptomyces spp.、Ruegeria spp.、Enterococcus spp.和Photobacterium damselae。     

池塘养殖牙鲆肠道和环境菌群结构对益生菌制剂的响应

为研究益生菌制剂对池塘养殖牙鲆(Paralichthys olivaceus)肠道及环境菌群结构的调控效果,采用高通量测序技术和生物信息学分析手段构建牙鲆肠道、养殖水体、饵料和池塘底泥的16S rDNA基因测序文库,分析不同样品中菌群组成和多样性在益生菌制剂调控过程中的变化趋势.结果显示,添加益生菌制剂后,池塘底泥和牙...     

不同养殖年份鱼塘底泥细菌群落多样性及演替分析

为探究不同养殖年份的鱼塘底泥中细菌多样性及演替关系,通过构建16S rRN A基因文库,比较分析养殖1年和养殖4年池塘底泥样品细菌的群落构成,分别由养殖1年和养殖4年文库获得145和172个克隆子,香农—威纳多样性指数分别为2．37和2．22,辛普森优势度指数分别为9．36和7．58,覆盖度指数分别为100％和93．3％。 Prolixibacter （34／145）、荚硫菌属（17／145）、浮霉菌属（15／145）和脱硫微菌属（12／145）为养殖1年样品优势菌群,长绳菌属（41／172）、Prolixibacter （31／172）、黄色单胞菌属（22／172）、Cetobacterium （21／172）和噬纤维菌属（15／172）为养殖4年样品优势菌群。养殖1年和养殖4年文库细菌菌群结构在种分类水平上的相似度系数为0．6171。由此可知,养殖池塘底泥中蕴含着复杂的微生物群落体系,长期的积累促使该微生物群落发生了演替。     

中华绒螯蟹生态育苗池塘细菌群落分析

为探究江苏省射阳地区沿海滩涂中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)生态育苗池塘细菌群落结构,分别对养殖池塘水体(S7,S8,S9)和池塘底泥(N7,N8,N9)细菌群落16SrDNA的V3、V4、V5可变区进行扩增,检测合格的文库进行高通量测序;利用Qiime(v1.7)软件,对序列阈值97%相似性水平进行聚类分析;分别以门、纲、目、科和属的分类水平对样本进行α-多样性指数分析;以Chaol指数和Shannon指数评估菌种丰富度和多样性。结果表明,3个生态育苗池塘得到OTU分别为8 881、7 406、8 566个。S7微生物归属于16门、29纲、58目、97科、191属;S8为9门、18纲、38目、68科、132属;S9为17门、32纲、60目、111科、227属。N7为41门、103纲、198目、325科、572属;N8为42门、103纲、203目、318科、534属;N9为40门、99纲、196目、323科、578属。养殖水体优势菌群以变形菌门(Proteobacteria)为主,其次是拟杆菌门(Bacteroidetes);池塘底泥优势菌群以变形菌门为主,其次为拟杆菌门、绿弯菌门(Chloroflexi)和浮霉菌门(Planctomycetes)。养殖池塘底泥中细菌群落的丰富度和物种多样性明显高于养殖水体,水体中细菌群落的丰富度S9S7S8,物种的多样性S7S9S8。池塘底泥中细菌群落的丰富度N7N9N8,物种的多样性N7 N9N8。     

大连湾和辽东湾夏季海水细菌多样性16S rDNA分析

通过构建大连湾(DL17)和辽东湾(ZD-LDW017)2个站点夏季海水的细菌16s rDNA文库,利用16S rDNA序列比对法,对大连湾和辽东湾夏季海水细菌多样性进行了分析.试验结果表明,这2个海域的细菌主要为非培养细菌.每个海区分别随机选取了200个克隆进行酶切谱型分析和序列测定,共得到104个不同的DNA序列,其中大连湾51个序列,分别属于13种(属);辽东湾53个序列,分别属于13种(属).有6种菌为这2个海区所共有,这2个海区各自有不同的优势菌,且均未检测到致病菌,研究结果表明大连湾和辽东湾海水细菌具有丰富的多样性.     

16S rDNA克隆文库技术在活性污泥系统微生物组成分析中的应用

采用构建16S rDNA克隆文库方法对活性污泥系统的细菌种群多样性进行研究。随机测定了71个克隆子序列(1 500bp),BLAST比对结果表明,活性污泥中微生物群落具有高度多样性,可分为6个主要类群,其中,拟杆菌(Bacteroides)类群和γ变形菌(γ-Proteobacteria)类群在文库中所占比例最大,分别为38.03%和32.39%;其次是β-Proteobacteria,占19.72%;Firmicutes,Candidate division TM7和α-Pro-teobacteria类群所占比例相对较小,分别为4.23%,4.23%和1.04%。序列分析结果表明,活性污泥中具有可强化生物脱氮除磷效果的食酸菌(Acidovorax),包括假单胞菌(Pseudomonas),红环菌(Rhodocyclus)等细菌。     

三峡大坝对香溪河底栖微生物群落结构和多样性的影响

为了研究三峡大坝修建后库区生态环境的变化,探究大坝修建对库区底泥细菌群落结构和多样性的影响,2013年夏季在香溪河回水区(河口、中游)与河流区(上游)依次选取6个采样点,通过构建16S r DNA基因克隆文库,分析底栖微生物群落结构和多样性的变化规律。结果表明,香溪河调查水域共检出细菌类群15门、87属。在门水平上,回水区和河流区的优势菌门均为变形菌门;在属水平上,回水区和河流区的优势菌属存在显著差异(P0.05),很可能是由于受长江回水和支流高岚河影响所致。芽孢杆菌属所占的比例,从回水区的河口处至中游处逐渐减少至河流区消失,结合芽孢杆菌属易生活在底泥深处的特性,很可能由于大坝的修建,香溪河的上游(即河流区)底泥冲刷至下游(即回水区)河段,被三峡大坝拦截而沉积下来,导致越靠近大坝处,芽孢杆菌属的含量越高。在底泥细菌群落多样性中,Simpson、Shannon和Margalef多样性指数空间分布总体上呈"中间高、两头低"的规律;3种多样性指数最高的采样点均出现在回水区,且回水区的多样性指数均高于河流区,很可能是因其还与旧州河、卜庄河以及周溪河这些支流的交汇,导致河流区底泥细菌群落多样性不稳定。三峡大坝对香溪河底栖微生物的群落结构和多样性产生了显著影响,而大坝修建导致库区回水区水深增加、流速降低、底层水温变化、泥沙沉积增加等因素是造成这种差异的可能原因。     

鱼菜共生模式中不同鱼类肠道微生物群落结构的比较

为研究鱼菜共生模式下不同鱼类肠道微生物的菌落结构,采用宏基因组学测序技术和生物信息学分析手段,构建了草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鲫(Carassius auratus)、鲢(Hypophthalmichthys molitrix)和鳙(Aristichthys nobilis)4种鲤科鱼类的肠道内含物等12个样品的16S rDNA测序克隆文库,分析了这4种鲤科鱼类肠道微生物的菌落组成和多样性。结果表明,鱼菜共生模式下不同鲤科鱼类肠道内含物微生物优势菌落的组成十分相似(P0.05,Kruskal-Wallis),优势微生物菌群均是鲸杆菌属(Cetobacterium)和梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、拟杆菌属(Bacteroides)和芽孢杆菌属(Bacillus)等,其中鲸杆菌属和梭状芽孢杆菌属含量最丰富,且主要在非优势菌属之间具有显著差异(P0.05,Kruskal-Wallis),研究结果还表明食性不是造成不同食性鲤科鱼类肠道微生物菌落差异的唯一决定性因素。     

长毛对虾海水养殖环境以及虾肠道微生物群落结构研究

为了研究长毛对虾养殖环境以及对虾肠道微生物种群结构的特征,实验分别采集养殖区进水口水体、养殖池底泥、养殖池水体以及长毛对虾肠道样品,采用构建16S rRNA基因克隆文库的方法对不同样品间的微生物群落组成进行了研究。结果表明,4组样品中共获得621条序列,操作分类单元(OTU)总数达212个,表明养殖环境微生物群落结构具有高度的多样性。从遗传进化树分析发现,进水口水体中细菌优势种群为蓝细菌(53.97%)、α-变形杆菌(13.76%)和γ-变形杆菌(10.58%);养殖池水体细菌优势种群为蓝细菌(33.55%)、γ-变形杆菌(14.84%)、厚壁菌(14.19%)、拟杆菌(12.26%)和α-变形杆菌(9.68%);养殖池底泥细菌优势种群大部分属于厚壁细菌(79.12%);对虾肠道细菌优势种群为厚壁细菌(75.79%)、梭杆菌(13.68%)和γ-变形杆菌(10.53%)。在目分类水平上,养殖池底泥、养殖池水体和对虾肠道中芽孢杆菌占有较高的比例,分别占克隆数的69.78%、13.55%和72.63%;进水口水体和养殖池水体中红细菌的比例较高,分别占克隆数的10.05%和9.68%。本研究分析了养殖环境以及对虾肠道微生物的群落结构,揭示微生物从水源到对虾肠道内的演替规律。总体上,本养殖系统微生物群落结构良好,但在养殖池水体和对虾肠道中也检测到黄杆菌类群和少量的弧菌。本研究有助于了解养殖环境对于对虾肠道微生物组成的影响,并为长毛对虾病害的预防提供参考。     

稻田养殖沙塘鳢对稻田水体及底泥微生物群落结构及多样性的影响

为了研究养殖沙塘鳢(Odontobutis obscurus)对稻田水体及底泥的微生物群落结构及多样性的影响,2015年于浙江海盐江南四阡现代农业公司进行了沙塘鳢的稻田养殖实验,利用DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)技术对养殖过程中的稻田水体及底泥中细菌的16S r DNA片段进行指纹图谱分析。DGGE条带测序分析结果显示:稻田水体及底泥共检测到包括α-变形菌亚门(Alphaproteobacteria)、β-变形菌亚门(Betaproteobacteria)、γ-变形菌亚门(Gammaproteobacteria)、δ-变形菌亚门(Deltaproteobacteria)、ε-变形菌亚门(Epsilonproteobacteria)、绿菌门(Chlorobi)、酸杆菌门(Acidobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、蓝藻门(Cyanobacteria)等细菌门类。多样性分析结果显示,养殖沙塘鳢的稻田底泥微生物DGGE条带数多于常规养殖稻田,养殖稻田的底泥Shannon多样性指数2.86,显著高于常规稻田的2.27,同时养殖稻田养殖沟底泥的Shannon多样性指数随养殖时间由2.56变化到2.16。PCA(Principal Component Analysis)及DGGE聚类分析结果显示,养殖稻田的水体及底泥微生物群落结构与常规稻田存在较大差异。结果表明,稻田养殖环境的微生态条件可能优于常规稻田。     

16S rDNA技术及在水产养殖细菌分析中的应用前景

随着分子生物技术的迅速发展，从分子水平对微生物的群落结构进行研究成为可能。16S rDNA技术广泛用于各种微生物的遗传特征和分子差异的研究。简要介绍了16S rDNA分析方法的基本步骤与序列测定方法在水生细菌方面的应用现状，以及前景展望。     

嘉陵江合川段秋季微生物多样性研究

为了解嘉陵江合川段秋季微生物多样性,通过16S rRNA基因扩增和测序分析了2017年9月嘉陵江合川段利泽、渠江口、涪江口、草街4个监测点水样和底泥微生物的多样性和种类结构。结果显示:河流上下游水体中微生物物种组成相似、有延续性,利泽和涪江口,渠江口和草街水体中微生物组成均呈现相似;底泥中微生物组成与小区域水文环境相关,涪江口和渠江口水文环境相似,底泥中微生物群落结构也呈现相似;缓流环境更适应微生物生存繁殖,处于监测尾端的草街水体和底泥中微生物数量最多;环境影响因子中总磷、总氮和pH对水体中微生物群落结构组成表现出较大影响;水体中变形菌门、放线菌门、拟杆菌门和蓝细菌门较为丰富,显示该水域有富营养化的趋势。     

应用DGGE分析三疣梭子蟹养殖塘底泥细菌的多样

将传统的菌落菌体形态分类方法与分子生物学方法相结合研究了三疣梭子蟹养殖塘底泥中一个细菌类群的多样性。首先采用平板稀释法对三疣梭子蟹养殖塘底泥中的细菌进行分离与纯化，根据各菌株的菌落形态特征初步将118株分离物分为8个类群，其中最大的一个类群的菌落基本特征为圆形、边缘整齐、表面凸起、菌落有光泽，对该类群的细菌多样性分析表明，通过芽孢染色可将产芽孢菌和不产芽孢菌区分开，不产芽孢菌根据其菌体形态又分为3个亚群，其中卵圆形细菌是最大的一个亚群，共有16株。应用PCR-DGGE方法对该类群进行菌株的遗传多样性分析。结果表明，卵圆形类群16株细菌中就有11株不同系统发育型的细菌。最后，将这11株细菌进行了16S rDNA部分序列（约750 bp）的测定，并做系统发育学分析，结果显示，这些细菌的系统发育学地位相距很远，分属于γ-Proteobacteria、α-Proteobacteria和 Firmicutes等类群。试验结果表明，以菌落特征的差异来挑选不同的菌株作为分析细菌多样性的第一个筛选步骤，会大大低估可培养异养细菌的多样性。     

草鱼养殖模式对气单胞菌属细菌群落影响分析

为研究草鱼池塘精养、山塘养殖以及鱼菜共生养殖3种养殖模式下气单胞属细菌群落特征差异,2017年5—7月(养殖投喂旺盛期)用采水器在池塘两端和中部采集表层15 cm处水样,混合均匀后,装入灭菌塑料瓶中,低温保存;在池塘两端和中部用采泥器采集表层底泥,现场各无菌称取5 g底泥,置于装有135 mL的无菌生理盐水的塑料瓶中,振荡混匀,低温保存。水样和底泥样4 h内带回实验室,利用RS平板分离法分离水体和底泥样本中的细菌,通过16S rDNA测序方法鉴定、分析分离细菌。试验结果表明,共分离细菌54株,为10属22种,其中气单胞菌属23株,假单胞菌属8株,柠檬酸杆菌属6株,肠杆菌属7株,泛菌属、沙雷氏菌属各3株,果胶杆菌属、沙门氏菌属、克吕沃尔菌属、勒克氏菌属细菌各1株。按细菌种类分,维氏气单胞菌数量最多,为12株,嗜水气单胞菌次之,为10株,烟粉肠杆菌6株,弗氏柠檬酸杆菌5株,其他细菌1～2株不等。不同养殖模式下细菌种类和数量分析表明,鱼菜共生养殖系统细菌种类和数量最多,达到12种21株,潜在致病菌占比较少,草鱼精养殖池塘细菌种类最少,为5种13株,致病菌占比较高。细菌环境分布特征表明,维氏气单胞菌多分布在水体,嗜水气单胞菌多分布于底泥中。     

鲵鱼消化道细菌群落结构及多样性初步研究

采用常规分离纯化与构建16S rDNA克隆文库相结合的方法对（鲵）鱼（Miichthys miiuy）消化道细菌多样性进行了初步研究.结果表明,（鲵）鱼消化道各部位可培养细菌的菌落数量从大到小依次为前肠＞幽门胃＞中肠＞后肠＞前胃＞后胃＞口咽腔,其中肠道部位菌落数量最多.分离细菌菌株主要为杆状细菌和革兰氏阴性菌,对其中的50株典型菌株进行分子鉴定,发现它们主要属于变形菌门的γ-变形菌纲（占52.7％）和β-变形菌纲（占36.8％）,以及厚壁菌门的芽孢杆菌纲（占10.5％）;不可培养细菌16S rDNA文库克隆子主要属于γ-变形菌纲、α-变形菌纲和脱铁杆菌纲,部分序列与已报道的物种相似性较低,说明消化道中可能存在新的有待开发的肠道菌株.     

精养草鱼池塘底泥微生物群落结构分析

2018年4—11月,在南昌市南昌县蒋巷镇相同养殖模式的3口草鱼精养池塘中每月用彼得森采泥器采集表层底泥样品(约200 g),用MiSeq测序技术测定、分析底泥微生物群落结构。从样品中得到有效序列为47 743～65 233条,可归为14 027～21 098个运算分类单元。分析结果表明,样品中的微生物可归为54～60个门,各月主要优势门均为变形菌门,其他优势门类各月不同;各月微生物群落结构差异不显著,但10月样品主要种与其他月存在差异;5月和11月物种数丰富度达高峰,5月多样性达高峰;各月核心种主要是厌氧菌地杆菌和厌氧粘细菌,兼性厌氧菌Desulfatiglans、Candidatus competibacter、脱氯单胞菌和Crenothrix等主要在无氧或低溶解氧条件下还原有机物和硫化物的菌种;除10月外,各月核心种种类差别不大,但各月核心种丰度不同。综上,草鱼池塘底泥微生物群落结构相对稳定,存在缓慢的演替;改善底部溶解氧状态是修护草鱼养殖池塘环境最主要的措施。     

草鱼肠道约氏不动杆菌的分离鉴定及药敏特性研究

研究草鱼肠道不动杆菌,为鱼类肠道细菌的分离鉴定与微生态机制研究积累资料。从草鱼肠道中分离纯化获得1株细菌,编号为SW-2,采用细菌形态观察、生理生化特性分析、16S rDNA克隆测序及系统发育树构建等进行研究。结果表明SW-2菌株为革兰氏阴性短杆菌,对葡萄糖、甘露糖、木糖、枸椽酸盐利用等均为阴性;PCR方法扩增SW-2菌株16S rDNA并亚克隆至pMD18-T载体,测序获得序列长度为1 503 bp,与约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)序列相似性最高为99.7%;进一步构建系统发育树显示与A.johnsonii亲缘关系最近,自然聚类为一支,从而确定为约氏不动杆菌(A.johnsonii);药敏试验结果显示SW-2菌株对庆大霉素、羧苄青霉素、阿莫西林、氨苄西林、卡那霉素等药物敏感。人工回归感染草鱼7 d后未出现发病死亡现象,但是否为条件致病菌有待进一步研究。     

基于16SrDNA分析的浒苔外生细菌多样性研究

为研究浙江近海浒苔Ulva spp.(Enteromorpha spp.)外生细菌多样性,采用传统的形态学和16S rDNA测序分析的方法,从舟山朱家尖、宁海国华电厂和奉化南沙3个地区分离到可培养的浒苔外生细菌及其周围海水细菌65株。根据细菌菌落特征和革兰氏染色结果等将分离到的细菌分为26种表型。16S rDNA序列测序比对发现:菌株与不动杆菌属(Acinetobacter)、交替单胞菌属(Alteromonas)、弧菌属(Vibrio)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、赤细菌属(Erythrobacter)、微球菌属(Micrococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、深海杆菌属(Idiomarina)、Phaeobacter、Roseivirgaj和Silicibacter等23个属相应菌株具有较高同源性。对不同地区浒苔外生细菌进行了Shannon-Wiener多样性指数分析。研究表明:(1)宁海国华电厂的浒苔外生细菌多样性最丰富,多样性指数为93.98%;(2)浒苔外生细菌与其生活地区密切相关,其群落组成具有地域差异,其优势类群也不尽相同,但均归属于变形菌门。