曼氏无针乌贼Phb2基因的克隆和其在不同生长阶段的表达分析

Phb2是抗增殖蛋白(Prohibitin)的一个亚型。本研究利用RACE技术首次获得了曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)Phb2基因的全长序列,该序列全长为1283 bp,其中5′非编码区(5′-UTR)150 bp,3′非编码区(3′-UTR)236 bp,开放阅读框(ORF)897 bp,预测编码298个氨基酸。序列分析表明,曼氏无针乌贼Phb2基因编码的蛋白无信号肽,第20~42位氨基酸为跨膜结构,包含1个PHB家族的结构域。采用荧光定量PCR技术检测其在曼氏无针乌贼不同生长时期(幼体、产卵前、产卵中、产卵后濒死前)各组织中的表达情况,结果显示,Phb2在4个时期的各组织中均有表达,其中,幼体和濒死前表达量较低,产卵前和产卵中的表达量则相对较高,在各时期中脑、肝表达较多。视腺作为与生殖调控有关的内分泌器官,其Phb2基因表达具有时期差异性,在产卵后的表达量由产卵时期的高表达大幅下降,说明Phb2具有周期调节、控制细胞衰老和凋亡的多效性功能。本研究结果可为进一步了解抗增殖蛋白对曼氏无针乌贼的抗衰老作用提供参考。     

曼氏无针乌贼维甲酸X受体(RXR)cDNA的克隆与表达

维甲酸 X 受体(retinoid X receptor, RXR)属于配体激活的核受体家族。本研究采用 RT-qPCR 技术克隆了曼氏无针乌贼 RXR (SjRXR)基因的 CDS 区核酸序列, 推导出其氨基酸序列, 并对 RXR 基因 CDS 区核苷酸序列与蛋白质结构进行了生物信息学分析, 结果如下: SjRXR 的 CDS 区核苷酸序列全长 1239 bp, 编码 1 个由 412 个氨基酸组成的蛋白质; 序列分析表明, 曼氏无针乌贼 RXR 的 CDS 区基因编码的蛋白质不含有信号肽, 无跨膜结构, 推测 RXR 编码蛋白属于非分泌型、非跨膜蛋白; 对蛋白进行疏水性分析, 发现亲水性部分大于疏水性部分, 预测 RXR 编码蛋白为亲水性蛋白, 包含 1 个 HOLl 家族的结构域; 利用 MEGA 6.0 软件以 ML 法构建了系统进化树, 结果表明, 曼氏无针乌贼与双斑蛸亲缘关系最近, 同属于软体动物门头足纲, 最先聚为一支, 曼氏无针乌贼 RXR 基因的分子进化地位与其生物学分类地位大体保持一致。采用 RT-qPCR 技术分析了该基因在乌贼 4 个时期 11 个组织中的表达规律, 结果如下: sjRXR 基因在各组织中均有表达, 且在肝、胰、脑、视叶和视腺中表达量较高; sjRXR 基因表达在不同生长周期存在明显变化, 在肝、胰中呈一直上升趋势, 在脑、视叶、视腺中呈先上升后下降趋势。SjRXR 是曼氏无针乌贼神经发育、生殖调节和衰老凋亡的重要调控因子之一, 本研究结果可为进一步深入研究头足类动物 RXR 基因提供重要参考依据。     

金乌贼生长期DNA甲基化水平和模式

DNA甲基化在基因表达、细胞衰老、性状分化中发挥重要调控作用,为探讨生长期金乌贼(Sepia esculenta Hoyle)不同性别、不同组织DNA甲基化水平和模式的差异,本研究采用荧光标记的甲基化敏感扩增多态性(Fluorescence-labeled Methylation Sensitive Amplified Polymorphism,F-MSAP)技术,选取12对特异性引物,检测分析了雌、雄金乌贼肌肉、心脏、胰脏和性腺4种组织的基因组DNA甲基化。结果显示,生长期金乌贼基因组DNA总甲基化水平为23.97%~39.70%,在水产无脊椎动物中处于较高水平;金乌贼4种组织中,肌肉的总甲基化水平最高,这可能与金乌贼存在异速生长现象且在生长期运动器官优先发育有关;金乌贼甲基化水平和模式存在性别差异,雌性金乌贼肌肉组织DNA总甲基化水平显著低于雄性,心脏和胰脏组织DNA总甲基化水平却显著高于雄性;此外,雌性金乌贼肌肉组织全甲基化水平对总甲基化水平贡献最大,与之不同的是,雌性其他组织、雄性金乌贼各组织中半甲基化水平和全甲基化水平差异不大,说明金乌贼DNA甲基化的水平和模式具有性别和组织差异。上述结果可为深入研究金乌贼生长发育、组织分化和衰老死亡等生命过程的表观遗传学调控提供基础数据。     

虹鳟pmela基因的克隆及其在不同发育阶段和组织中的表达分析

前黑素小体蛋白a (premelanosome protein, pmela)基因是黑色素合成通路中的关键基因之一，对动物的体色有着重要影响。为探讨pmela基因在虹鳟(Oncorhynchus mykiss)体色变异中的作用，本研究利用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术对pmela基因cDNA全长进行克隆并运用生物信息学方法分析该基因的序列特征，同时采用qRT-PCR比较pmela在野生型虹鳟(虹鳟)、黄色突变型虹鳟(金鳟)和杂交F1代受精期至孵化后3个月不同发育时期及成鱼不同组织中的相对表达量。研究获得pmela基因cDNA全长序列3 476 bp，包含2 532 bp开放阅读框，编码843个氨基酸。序列分析发现，Pmela为疏水性蛋白且存在PKD功能结构域。同源性比对发现，虹鳟Pemla氨基酸序列与红鲑(Oncorhynchus nerka)的同源性高达97.75%；进化分析结果显示，虹鳟与红鲑的亲缘关系最近，与人类(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)的亲缘关系最远。qRT-PCR结果显示，pmela基因在虹鳟与金鳟胚胎及出膜后各时期均有表达，在受精期至16细胞期中的表达为虹鳟高于金鳟，出膜后该基因在金鳟背部皮肤中的表达均高于虹鳟，且在4细胞期、16细胞期、原肠期、神经期、体节期、心跳期、1 day post-hatching (1 dph)、3 dph、5 dph、7 dph、10 dph、1 month post-hatching (1 M)和2 M时期中，虹鳟与金鳟的表达存在显著差异。在各组织中，pmela基因在虹鳟与金鳟背部皮肤和眼睛中的表达显著高于其他组织。在杂交F1代中，pmela基因在不同发育时期和组织中的表达模式与双亲类似，且在大部分相同时期和组织中的表达与双亲存在显著差异。上述结果表明，pmela基因的表达量高低与虹鳟体色具有一定的相关性，且可能参与其体色的形成过程。本研究结果为进一步研究pmela基因在虹鳟体色变异中的作用提供基础资料。     

2种乌贼雌激素相关受体基因的克隆与表达特性分析

雌激素是重要的类固醇类激素,在软体动物中,雌激素一般不能与雌激素受体识别并结合,但却能通过调控一类孤儿核受体——雌激素相关受体(estrogen-related receptor,ERR)的表达而发挥其生殖调控的部分功能,但有关ERR在软体动物中的确切生物学特性及功能还知之甚少。本研究首次从2种海洋头足类:曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)和白斑乌贼(Sepia latimanus)中,克隆得到了ERR基因的全序列,并对其在乌贼不同组织及不同发育时期的表达特征进行研究。结果表明:乌贼中仅克隆得到了1种ERR基因亚型(ERRγ),在曼氏无针乌贼和白斑乌贼中的全长分别为1 513 bp和1 547 bp,两者分别编码339和351个氨基酸残基,这些氨基酸可形成A/B、C、D和E 4个典型的核受体结构域。进化树分析表明,乌贼的ERR基因C结构域和E结构域较其他软体动物相对高度保守,曼氏无针乌贼和白斑乌贼ERR基因与同为头足类的双斑蛸(Octopus bimaculoides)的ERR同源性最高,分别达到95%和85%。2种乌贼ERR基因在不同组织中表达谱相仿,在不同组织中广泛表达,但在脑、肝、卵巢等生殖相关器官中表达量最高。2种乌贼卵巢中的ERR基因表达量都随性成熟时间的推进而逐渐上调,而在繁殖期后显著下调(P0.05)。该结果表明乌贼的ERR基因可能在其生殖发育和性成熟过程中起着重要的调控作用。[中国渔业质量与标准,2019,9(2):16-23]     

日本无针乌贼胚胎期眼部发育相关基因的研究

为探究日本无针乌贼胚胎期眼部发育的相关调控机制,通过基因功能分析,从前期试验构建的日本无针乌贼胚胎发育期转录组数据库中筛选出与眼部发育密切相关的SIX Homeonox 3 (six3)、Eyes Absent (eya)、及Paired Box 6 (pax6)基因,采用荧光定量PCR分析3个基因在胚胎发育的3个时期——眼原基形成期(SJ1)、功能器官分化期(SJ2)、幼体孵化期(SJ3)8个阶段中相对表达量及变化趋势。试验结果显示,这3个基因在胚胎不同发育期均有不同程度的表达。其中,six3、eya基因从眼原基形成期到幼体孵化期表达量呈上升趋势,并随胚胎发育而显著增加;pax6基因相对表达量从眼原基形成期到功能器官分化期呈上升趋势,而从功能器官分化期到幼体孵化期呈逐渐下降趋势。试验结果表明,six3、eya、pax6基因在基因转录控制网络中发挥不同调节作用,对调控胚胎期眼部发育有重要意义。     

金乌贼(Sepia esculenta)早期发育阶段内壳形态学指标的主成分分析

为揭示金乌贼(Sepia esculenta)早期发育阶段内壳生长发育规律和形态学特征,本研究采集其红珠与黑珠期、心跳期、出膜期、初孵化幼体、5日龄、10日龄6个时期的金乌贼,分别测量其胴腹长(DML)、胴宽(MB)、体重(BW)、壳长(CL)、壳宽(CB),壳重(CW)、生长纹数(LN)7项指标,进行内壳形态学的主成分分析.结果显示,红珠与黑珠期、出膜期和10日龄时期各生长指标间均呈显著性正相关,心跳期、初孵化幼体期和5日龄时期部分生长指标间相关性不显著.主成分分析显示,红珠与黑珠期、心跳期的第1主成分为质量因子(体重和壳重),出膜期、初孵化幼体、5日龄、10日龄等4个时期的第1主成分为长度因子(胴腹长和壳长),这表明金乌贼不同时期内壳形态学各性状的生长速率存在一定差异,出膜前(红珠与黑珠期和心跳期)质量因子的增长优于长度因子的增长,而出膜后(出膜期至10日龄时期)长度因子的增长优于质量因子的增长.     

金乌贼(Sepia esculenta)早期发育阶段内壳形态学指标的主成分分析

为揭示金乌贼(Sepia esculenta)早期发育阶段内壳生长发育规律和形态学特征,本研究采集其红珠与黑珠期、心跳期、出膜期、初孵化幼体、5日龄、10日龄6个时期的金乌贼,分别测量其胴腹长(DML)、胴宽(MB)、体重(BW)、壳长(CL)、壳宽(CB),壳重(CW)、生长纹数(LN)7项指标,进行内壳形态学的主成分分析。结果显示,红珠与黑珠期、出膜期和10日龄时期各生长指标间均呈显著性正相关,心跳期、初孵化幼体期和5日龄时期部分生长指标间相关性不显著。主成分分析显示,红珠与黑珠期、心跳期的第1主成分为质量因子(体重和壳重),出膜期、初孵化幼体、5日龄、10日龄等4个时期的第1主成分为长度因子(胴腹长和壳长),这表明金乌贼不同时期内壳形态学各性状的生长速率存在一定差异,出膜前(红珠与黑珠期和心跳期)质量因子的增长优于长度因子的增长,而出膜后(出膜期至10日龄时期)长度因子的增长优于质量因子的增长。     

养殖金乌贼卵子发生和卵巢发育的组织学观察

为了深入了解金乌贼(Sepia esculenta Hoyle)的生殖生理特性,本研究采用解剖学方法及组织切片技术,观察和描述了金乌贼卵巢形态和卵子各个时相结构特征及其变化规律。研究结果表明,金乌贼卵子发生过程的主要特征表现为,卵子成熟之前滤泡细胞一直存在且伴随着其结构变化,滤泡细胞解体与卵黄物质出现同步发生,卵黄物质从无到有再到大量积累直至充满整个卵母细胞,细胞核则随着滤泡细胞内折逐渐发生偏移直至最后消失。研究还发现金乌贼卵巢内卵子发生不同步且形态差异显著,未成熟的卵子粘连在卵巢基质上,依次环布于卵巢基质周围,越靠近中心,卵母细胞发育程度越低;成熟后的卵子游离在卵巢腔中,经过输卵管排出体外。根据卵巢内卵子的大小和形态、滤泡细胞形态及卵黄形成情况,将金乌贼卵子发生分为增殖期(卵原细胞期)、小生长期(无滤泡期,单层滤泡期,双层滤泡期)、大生长期(滤泡内折期,卵黄形成早期,卵黄形成晚期)、成熟期、退化吸收期共5个时期9个时相。卵巢发育分期则是以卵子时相为基础,根据卵巢的外观形态、性腺系数以及切面上优势卵子的时相,把卵巢分为Ⅰ~Ⅵ共6个时期。金乌贼卵巢发育和卵子发生的动态观察与描述,对丰富头足类繁殖生物学理论及提升人工繁殖技术都具有重要意义。     

金乌贼和曼氏无针乌贼胚胎发育及其盐度耐受能力的比较研究

采集金乌贼(Sepia esculenta)及曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)受精卵,观察了金乌贼胚胎发育过程,比较分析了2种乌贼受精卵和仔乌的形态特征;分别研究了金乌贼受精卵在盐度20,25,30(对照)、33,36及曼氏无针乌贼受精卵在盐度15,20,25,30(对照)、36条件下的孵化率,分析了2种乌贼受精卵在192 h盐度突变过程中卵液渗透压和受精卵Na~+/K~+-ATPase活力的变化,比较了其在相同盐度20,25,30,36条件下的孵化率及耐受盐度突变的生理适应过程.结果表明,金乌贼胚胎发育第7天器官开始分化,第14天器官开始形成,盐度30、水温22～24℃时,其孵化时间为20～21 d;盐度30处理组,2种乌贼受精卵的孵化率均显著高于其他盐度处理组(P<0.01);在192 h盐度突变过程中,2种乌贼受精卵卵液渗透压随环境盐度的变化而变化,金乌贼受精卵卵液渗透压与环境渗透压相等,而曼氏无针乌贼受精卵卵液渗透压比环境渗透压平均高出60 mOsm/kg,2种乌贼受精卵均未检测到Na~+/K~+-ATPase活性.比较发现,虽然2种乌贼受精卵调节渗透压能力均较弱,但曼氏无针乌贼受精卵比金乌贼能更好地适应盐度变化.本研究旨在探明两种乌贼受精卵对盐度的适应性,为开展规模化人工繁育与资源增殖提供基础依据.     

金乌贼腕式研究

对金乌贼(Sepia esculenta Hoyle)的腕式及其在分类学中的应用进行了探讨。研究结果表明：金乌贼不同时期的不同个体出现了不同的腕式。Duncan多重比较分析表明，腕式依个体、大小、左右和性别不同而有差异。当一个种雌性及雄性样本左、右腕的腕式都一致时，可以认为是该种的腕式。否则，需指出性别、大小、左右等前提。建议在金乌贼研究中慎重使用腕式。     

金乌贼新型产卵附着基的实验研究

2015年6—7月和2016年6—7月在青岛金沙滩水产有限公司室内产卵池中开展了不同材料、不同颜色、不同水深金乌贼(Sepia esculenta)产卵附着基附卵效果对比实验,以及柽柳附卵器对附卵效果的影响实验。实验用产卵附着基为0.33 m×0.33 m×0.33 m的十字形可折叠钢丝框架,上覆黑白2种聚乙烯网衣材料;每个产卵池中金乌贼亲体数量约35只,雌雄比约为1∶1,胴长(139.2±1.1)mm,体重(435.9±8.5)g。同时选用等比例放大的1.0 m×1.0 m×1.0 m钢筋框架与不同颜色网衣制作的十字形可折叠附着基,于2015年6—7月在青岛斋堂岛附近海域(35?36?6?N,119?54?8?E)和杨家洼湾前附近海域(35?36'6?N,119?50'50?E),以及2016年6—7月在青岛薛家岛近海(35?57?24?N,120?16?22?E)和杨家洼湾前附近海域(35?35?45?N,119?50?38?E)开展了海区附卵验证实验。结果表明:室内同一水体环境中柽柳附卵效果最佳,其次是十字形附着基,海参框附卵效果最差;白色十字形附着基的附卵效果显著优于黑色(P0.05);柽柳附卵器对附卵效果有积极影响,加装柽柳附卵器的十字形附着基附卵效果明显提高;产卵池底层摆放的十字形附着基的附卵效果显著优于表层悬挂的十字形附着基(P0.01)。海区附卵验证结果表明:2015年和2016年海区投放的十字形附着基附卵效果良好,最高附卵率分别为82.14%和56.72%;海区投放的黑色和白色十字形附着基的附卵效果差异不显著(P0.05);海底悬挂的十字形附着基的附卵效果显著优于近底层悬挂的十字形附着基(P0.05)。综合分析认为,在金乌贼产卵繁殖季节,选择其重要产卵场和主要增殖放流海区水深15~20 m的缓流区,底层设置十字形可折叠产卵附着基,可有效进行资源增殖与产卵场修复。     

中华绒螯蟹RXR基因全长cDNA克隆及表达分析

维甲类X受体(retinoid X receptor,RXR),属于核受体超家族(nuclear receptor super family)成员,是一种重要的调控因子,对甲壳动物生长发育和繁殖具有十分重要的作用。本研究根据陆地蟹 RXR基因保守区序列设计上下游引物,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)以及cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)RXR基因并进行各组织间的表达分析。序列分析表明中华绒螯蟹RXR cDNA全长1517bp,编码433个氨基酸。经BLASTn和BLASTx分析表明,中华绒螯蟹RXR氨基酸序列与陆地蟹RXR基因的氨基酸序列相似性最高,为96%。系统进化树分析显示,中华绒螯蟹RXR的氨基酸序列与陆地蟹RXR聚为一支。荧光定量PCR结果显示,RXR在所有检测的组织中均有表达,且在中华绒螯蟹Y器官中表达量最高,肝胰腺、鳃和肌肉中有少量表达,心脏、胃、肠、胸神经节和脑神经节中微量表达。在中华绒螯蟹不同蜕皮时期中,Y器官中RXR表达量在D期最高,与AB期、C期呈显著性差异（P＜0.05）;肌肉中RXR在AB期表达量最高,与其他蜕皮时期呈显著性差异（P＜0.05）;肝胰腺和鳃中RXR在AB期表达量最高,E期表达量最低,但各蜕皮时期表达量之间差异不显著。     

金乌贼同工酶分析

采用水平淀粉凝胶电泳技术对金乌贼（Sepia esculenta）同工酶的组织特异性及其山东日照近海群体的遗传结构进行研究。对金乌贼眼、鳃、肌肉、口球、肝脏、鳃心6种组织的19种同工酶进行分析，检测出PGDH、GPI、MPI、IDHP、SOD、ME、AAT、DIA、MDH、LDH、G3PDH、PGM共12种同工酶在几种组织中有较稳定而清晰的表达。结果表明，金乌贼同工酶的表达有明显的组织特异性。选择金乌贼3种组织（眼、口球、鳃心）进行同工酶分析，共记录了18个基因座位，其中3个基因座位LDH-2^＊、G3PDH-1^＊、PGM^＊呈多态，其多态座位比例为0．1667（P0．99）和0．0556（P0.95），平均观测杂合度和预期杂合度分别为0．0159和0．0143，平均有效等位基因数为1．0201，表明日照近海金乌贼群体的遗传多样性较低。     

鲤lipea基因表达的时空特征及与脂肪沉积相关性分析

本文旨在克隆鲤(Cyprinus carpio)激素敏感性脂肪酶a (hormone-sensitive lipase a, lipea)基因,探究其时空表达特征及其与脂肪沉积的关系,以期为鲤脂肪沉积分子调控机制研究奠定理论基础。本实验采用RACE技术克隆获得鲤lipea基因,其cDNA全长为3379 bp,包括230 bp的5′非翻译区(5′-UTR)、1067 bp的3′非翻译区(3′-UTR)和编码693个氨基酸的开放阅读框。多序列比对显示,鲤lipea与斑马鱼(Danio rerio)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)和虹鳟(Oncorhynchusmykiss)的氨基酸序列相似性分别为88.17%、64.94%和63.35%,不同物种间序列差异主要集中在C-端的多肽序列上。蛋白质结构分析显示该蛋白含有3个功能域分别具有脂肪酶活性、乙酰基水解酶活性和水解酶活性。应用实时荧光定量PCR技术分析了lipea基因在鲤各组织、不同发育时期以及脂肪含量极端差异个体的肌肉和脂肪组织中mRNA表达量的变化。结果显示, lipea在各组织中均有表达,腹腔脂肪中相对表达量最高,其次是腹部肌肉,血液中最少。随着胚胎的发育, lipea的表达水平呈现下降趋势, 8细胞期表达量最高,其次是囊胚晚期,开口期最少。lipea表达量与背部肌肉脂肪含量呈正相关,但差异不显著(P0.05),与腹腔脂肪量呈负相关,且差异极显著性(P0.01),推测lipea基因对鲤腹腔脂肪沉积可能具有抑制作用。本实验结果可为进一步解析鲤lipea基因的功能和基因调控脂肪沉积分子机制研究提供参考。     

东海区经济乌贼类资源量评估

本文根据2000年和2001年在东海进行的底拖网调查资料，利用扫海面积法评估东海区经济乌贼类的资源量，并估算可捕资源量。结果表明，近年以金乌贼和神户乌贼等经济乌贼为主捕对象的年潜在资源量稳定在一定的水平上，与20世纪90年代中期的水平相当；当前的实际捕捞产量已接近最大持续产量，进一步开发利用的潜力不大。     

Changes in the expression of pituitary gonadotropin subunits during reproductive cycle of multiple spawning female chub mackerel Scomber japonicus

The endocrine regulation of reproduction in a multiple spawning fish with an asynchronous-type ovary remains largely unknown. The objectives of this study were to monitor changes in the mRNA expression of three gonadotropin (GtH) subunits (GPα, FSHβ, and LHβ) during the reproductive cycle of the female chub mackerel Scomber japonicus. Cloning and subsequent sequence analysis revealed that the cDNAs of chub mackerel GPα, FSHβ, and LHβ were 658, 535, and 599 nucleotides in length and encoded 117, 115, and 147 amino acids, respectively. We applied a quantitative real-time PCR assay to quantify the mRNA expression levels of these GtH subunits. During the seasonal reproductive cycle, FSHβ mRNA levels remained high during the vitellogenic stages, while GPα and LHβ mRNA levels peaked at the end of vitellogenesis. The expression of all three GtH subunits decreased during the post-spawning period. These results suggest that follicle-stimulating hormone (FSH) is involved in vitellogenesis, while luteinizing hormone (LH) functions during final oocyte maturation (FOM). Both GPα and FSHβ mRNA levels remained high during the FOM stages of the spawning cycle and increased further just after spawning. Thus, FSH synthesis may be strongly activated just after spawning to accelerate vitellogenesis in preparation for the next spawning. Alternatively, LHβ mRNA levels declined during hydration and then increased after ovulation. This study demonstrates that chub mackerel are a good model for investigating GtH functions in multiple spawning fish.