栉孔扇贝几丁质酶基因的克隆及功能鉴定

为研究栉孔扇贝贝壳形成机理,首先应用质谱分析的方法,研究了几丁质酶在栉孔扇贝贝壳的蛋白质组中所占的比例。进一步利用RACE技术克隆获得栉孔扇贝几丁质酶的c DNA,全长共1587 bp,可编码439个氨基酸残基。氨基酸序列的功能结构域分析表明,该几丁质酶具有保守的几丁质酶特征结构域。组织表达分析表明,栉孔扇贝几丁质酶在外套膜组织中表达量最高,并且在外套膜边缘的表达量高于外套膜中心,推测其参与了贝壳的形成。应用实时定量PCR方法,检测贝壳损伤修复过程中基因表达水平,结果显示,几丁质酶基因表达水平呈现下调趋势,暗示其作为负调控因子参与贝壳修复过程。利用RNAi技术降低外套膜组织中几丁质酶基因的表达水平,同时应用扫描电子显微镜观察贝壳内表面的结构,发现贝壳矿物晶体片层的轮廓呈现不规则沉积。综合以上实验结果,推测几丁质酶通过水解几丁质来保证有机框架的有序性,从而对贝壳形状和外观起到调控作用。研究几丁质酶的基因组织表达规律及其生物学功能,将有助于揭示贝壳生物矿化的机制。     

厚壳贻贝Wnt4基因时空表达

为探究Wnt4基因在厚壳贻贝幼虫发育阶段和组织生长过程中的作用,通过RACE技术克隆了厚壳贻贝Wnt4基因c DNA全长序列,该序列全长3342 bp,开放阅读框为1074 bp,编码357个氨基酸。该序列与人、小鼠、海胆、栉孔扇贝和长牡蛎等物种的同源性分别为61%、61%、60%、71%和76%。通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析Wnt4基因在厚壳贻贝成体多个组织中(外套膜、闭壳肌、鳃、雌雄性腺、足和消化腺)均有表达,其中在外套膜中表达量最高,推测可能与贝壳形成有关;Wnt4基因在厚壳贻贝幼虫发育阶段高表达主要集中在壳顶期,并推测Wnt4基因可能参与了贝壳形态结构发生转变的过程以及某些器官的形成与发育。本研究为进一步开展双壳贝类Wnt基因家族的功能研究提供了理论依据。     

栉孔扇贝wnt4基因cDNA克隆及表达分析

由栉孔扇贝(Chlamys farreri)转录组数据库获得wnt4基因的一段表达序列标签(EST)序列,利用SMART-RACE技术克隆了wnt4基因cDNA全长序列,该序列长1 239 bp,其中开放阅读框为1 068 bp,可以编码355个氨基酸,推导的氨基酸序列含有WNT家族特有序列,且与沙蚕(Platynereis dumerilii)、海胆(Heliocidariserythrogramma)、人(Homo sapiens)等物种WNT4同源性都在60%以上。半定量RT-PCR结果显示,除肾脏外,wnt4基因在栉孔扇贝的精巢、卵巢、闭壳肌、肝胰腺、鳃、外套膜组织中均有表达,但表达量较低。定量RT-PCR结果表明:wnt4基因在成熟期的精卵巢中表达量最高,增殖期和休止期表达量次之,生长期表达量最低;整个生殖周期中精巢表达量高于卵巢。该基因在栉孔扇贝多个组织中的表达特性,暗示其参与了多样的生物学过程;在性腺中的表达特征表明其可能参与两性性腺的发育并在生殖细胞成熟过程中发挥作用。     

栉孔扇贝FTZ-F1基因的序列特征及表达分析

为研究栉孔扇贝(Chlamys farreri)FTZ-F1基因功能,对其序列特征和表达模式进行了分析。结果显示,该基因编码序列(coding sequences, CDS)长1 668bp,编码555个氨基酸,含DBD (DNA binding domain)保守区、FTZ-F1盒(FTZ-F1 box)、LBD(ligand binding domain)保守区,其保守区与其他物种较为一致。采用半定量PCR(RT-PCR)和荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测了FTZ-F1基因在栉孔扇贝中的表达,发现在雌性栉孔扇贝的闭壳肌、肾、鳃组织和雄性栉孔扇贝的精巢、肝胰腺、闭壳肌、肾中表达较强,在其他组织中表达较弱;在性腺发育周期中,FTZ-F1基因主要在成熟期精巢中表达,表达量显著高于其他时期性腺,表明FTZ-F1基因主要在成熟期精巢中发挥重要作用,推测可能与成熟期精巢睾酮含量升高相关。     

Foxl2基因在栉孔扇贝发育过程中的表达图式

Foxl2基因在哺乳动物中是雌性相关基因,参与卵巢发育和功能维持。本研究利用荧光定量PCR和原位杂交技术,对栉孔扇贝(Chlamys farreri)foxl2(Cf-foxl2)在发育过程中的表达图式进行了分析。研究发现Cf-foxl2在受精卵中呈低水平表达,随着发育进行表达量增高,D形幼虫期表达量最高,之后表达量迅速下降。原位杂交结果显示Cf-foxl2表达量在担轮幼虫之前在体内均匀分布;强阳性信号在担轮幼虫口凹附近呈对称分布;至D形幼虫期强阳性信号主要集中在内脏团和外套膜边缘处;之后信号消失,直到性别分化后在卵巢中再次出现。本实验结果暗示Cf-foxl2与卵巢发育相关,鉴于该基因在发育早期的持续性表达特征,暗示其可能参与栉孔扇贝的早期发育过程。     

华贵栉孔扇贝有了新品系亩产增值最高可达九千

华贵栉孔扇贝是我国南方重要的海水养殖贝类。由汕大海洋生物研究所郑怀平教授率领的课题组经过4年多的实验创新和实践推广,系统地研究了华贵栉孔扇贝新品系培育的理论与技术,并培育出贝壳、外套膜、闭壳肌色泽金黄的华贵栉孔扇贝新品系,其类胡萝卜素含量是普通扇贝的10.80至28.95倍,抗氧化能力为普通扇贝的1.34至3.53倍。目前,"华贵栉孔扇贝新品系培育技术研究及应用"成果通过省级科技鉴定,新品系培育的关键技术已申请3项国家发明专利(1项已授权),累计推     

栉孔扇贝17β-HSD4基因的克隆和表达分析

为了研究17β-hsd4基因在无脊椎动物生殖过程中的作用,实验从栉孔扇贝转录组数据库中获得一个表达序列标签,采用cDNA末端快速扩增技术克隆得到1条全长为2 417 bp的cDNA序列,其开放阅读框为2 223 bp,编码740个氨基酸,推测的氨基酸序列含有17β-HSDs特有的4个保守区和17β3-HSD4的3个酶结构域,且与人等脊椎动物的序列相似性均在58％以上.半定量RT-PCR显示,该基因在栉孔扇贝精巢、卵巢、肌肉、外套膜、鳃、肝胰腺和肾脏等各组织中均有表达,其中在肝胰腺和肾脏中表达量明显高于其他组织.对不同发育时期性腺中该基因表达的qRT-PCR检测发现,其在精卵巢发育周期的表达模式不同,且在生长期和成熟期的精巢中表达量显著性高于同时期的卵巢.由此推测,栉孔扇贝多种组织中均可以合成17β-HSD4,在精巢的发育和成熟的作用明显高于卵巢.     

感染“褐色沉积症”虾夷扇贝的外套膜转录组测序及差异表达基因分析

为分析“褐色沉积症”形成分子机制,探究筏式养殖虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)贝壳内侧褐色沉积症状形成原因,采用Illumina高通量测序平台对感染“褐色沉积症”虾夷扇贝和健康虾夷扇贝外套膜组织进行转录组测序分析。结果显示,患病和健康扇贝外套膜分别获得43862251和41806737条clean reads。经参考基因组比对分析,患病和健康扇贝外套膜表达基因数量分别为17835个和16816个,差异表达基因208个,其中上调基因170个,下调基因38个。选取6个差异表达基因进行荧光定量PCR (q RT-PCR)验证,结果证明转录组测序分析可靠。GO功能富集发现差异基因主要富集在几丁质代谢、含氨基葡萄糖化合物代谢、几丁质结合和氨基糖代谢等与几丁质合成代谢相关的通路;KEGG通路富集分析发现差异基因主要参与内质网蛋白质合成、内吞作用、剪接体和谷胱甘肽代谢等途径;对差异表达倍数显著的前40个基因分析发现,编码类咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(caffeoyl-Co A O-methyltransferase-like,CCOAOMT-L)、类1-氨基环丙烷-1羧酸...     

栉孔扇贝Cf-dmrt4-like基因的克隆、序列特征及表达分析

DMRT家族是一类转录因子,在性别决定与分化、器官形成等早期胚胎发育中起重要的作用。本研究采用简并PCR扩增和cDNA末端快速扩增技术(RACE),从栉孔扇贝(Chlamys farreri)精巢中克隆得到1个全长为2312bp的dmrtcDNA序列,其开放阅读框(Open reading frame,ORF)1110bp,编码369个氨基酸,具有dmrt基因家族共有的DM保守结构域。同源比对和系统进化分析结果显示,其为Cf-dmrt4-like基因。半定量RT-PCR结果显示,该基因从受精卵至匍匐幼虫各发育时期均有表达,卵裂期表达量较高;在雄性成体的鳃和精巢以及雌性成体的外套膜、鳃、肾和闭壳肌中表达,但卵巢中未见表达。qRT-PCR检测不同发育时期的精卵巢,以成熟期精巢表达量最高。由此推测,栉孔扇贝Cf-dmrt4-like基因参与个体的早期发育,并在两性成体中发挥着不同的作用。     

海洋酸化对栉孔扇贝钙化、呼吸以及能量代谢的影响

通过Alkalinity anomaly technique测定了栉孔扇贝Chlamys farreri在不同酸度条件下的钙化率和呼吸率,发现栉孔扇贝的钙化和呼吸活动受酸化影响显著,均随着酸化的加剧出现了明显下降。当pH降低到7.9时,栉孔扇贝的钙化率将会下降33%左右;当pH降到7.3左右时,栉孔扇贝的钙化率将趋近于0,栉孔扇贝无法产生贝壳,而此时栉孔扇贝碳呼吸率(RC)与耗氧率(RO)也分别下降了14%和11%。随着酸化的加剧,栉孔扇贝的能量代谢方式也会发生改变。这些变化都可能影响到栉孔扇贝的生存。     

基因安全的思考

本文慨述了基因工程的进展、应用及对人类社会的重大意义。同时也带来一系列问题和威胁———基因安全。目前这方面的问题日益突出,迫切要求我们关注和保护基因安全。     

黄鳝载脂蛋白A1的基因结构及表达谱分析

根据克隆的黄鳝载脂蛋白A1基因的部分序列,进行5′RACE扩增和内含子的克隆并采用荧光定量PCR分析该基因的表达谱。结果表明,该基因cDNA全长1207bp,5′UTR区域长32bp,编码1个262aa的多肽;在长1391bp的gDNA上,只发现了1个长184bp的内含子。荧光定量PCR对该基因在不同组织和病原细菌嗜水气单胞菌感染后的表达情况分析表明,该基因转录本在肝脏中表达量最高,在胃、肾脏、小肠、脑、皮肤和血液中表达量中等,而在心脏、脾脏和肌肉中表达量很低;病原细菌感染会显著影响该基因在小肠、肝脏和脾脏中的表达水平。以上结果显示黄鳝的载脂蛋白Apo-A1基因可能参与了鱼体的天然免疫反应。     

Gene Knockdown: A Powerful Tool for Gene Function Study in Fish

So far, there are a number of fish genome projects, including experimental and economically important fish that provide available DNA sequence information. However, the function of a gene cannot be deduced only by its DNA sequence. Therefore, a technique with which to investigate the function of the fish gene is needed. Gene knockdown (GKD), or antisense technology, is now being used as a powerful technique to study gene functions in living organisms. GKD effects result from the introduction of an antisense molecule into living cells. The antisense agents bind to target messenger RNA, thus inactivating the target gene expression. The appropriately spatial inhibitory effects on protein production from corresponding gene resulted in the phenotypic change. Therefore, the function of the gene can be understood. To date, there are a number of antisense molecules that can affect efficient GKD in fish. These include antisense oligonucleotides, small interfering RNA, and ribozyme. These antisense molecules cause specific gene inhibitor effects with different mechanisms. The various antisense mechanism types facilitate a number of GKD applications with various approaches in animals. In this review, we demonstrate the characteristics of each antisense molecule, its mechanism, and its application, especially for gene functional analysis in fish.     

饲料浮萍水平对大正三色锦鲤TYR及MC1R基因表达的影响

为探究饲料中不同浮萍添加水平对大正三色锦鲤酪氨酸酶TYR以及黑素皮质素受体MC1R基因表达的影响,配制浮萍添加水平分别为0%、3%、6%、9%、13%、14%6种等蛋白(38.6%)饲料饲养大正三色锦鲤(42.19±1.32)g 8周,分别记为Diet 1(0/13)、Diet 2(3/10)、Diet 3(6/7)、Diet 4(9/4)、Diet 5(13/1)、Diet 6(14/0)。每种饲料设3个重复,每个重复饲喂10尾鱼。试验结果表明:(1)TYR基因在大正三色锦鲤的心脏、肝脏、眼睛、黑色皮肤、脑中均有表达,并且在脑、皮肤、眼睛中表达量相对较高;(2)各组织中TYR mRNA表达量随浮萍添加水平的升高均有一定波动,在皮肤与眼睛中,以Diet 6(14/0)组显著高于其他各组(P0.05),在脑中,以Diet 3(6/7)组显著高于除Diet 6的其他各组(P0.05);(3)皮肤与眼睛中MC1R mRNA表达量以Diet 6(14/0)组显著高于其他各组(P0.05),而在脑中各组差异均不显著(P0.05)。综上所述,在本试验条件下,饲料不同浮萍添加水平促进大正三色锦鲤TYR以及MC1R基因表达,有利于鱼体黑色素沉积,因此选择Diet 6(14/0)组饲料投喂大正三色锦鲤最适。     

转基因鱼研究及商品化展望

目前,转基因技术是农业和医药行业的研究热门。自1985年,世界上第一批转基因鱼诞生后,鱼类基因转移技术很快应用到培育高产、优质和抗逆的经济鱼类新品种,并在解决分子生物学、发育生物学和基因转移等方面的难题中发挥着重要作用。近几年,“全鱼”生长激素（GH）基因的克隆与应用,使快速生长转GH基因鱼的研究取得了突破性进展,但仍需要解决转移基因的定位整合、稳定表达和遗传,以及转基因鱼释放的生态和食品安全性等问题。     

半定量RT-PCR在基因表达方面的应用

RT-PCR是一种常用的具有很高灵敏度和特异性的基因表达检测方法。它有定量RT-PCR和半定量RT-PCR法。半定量RT-PCR法因其对试验条件的要求不高,费用低、普通实验室容易做到而被经常使用。本文从半定量RT-PCR的原理、技术、操作步骤及注意事进行了综述。     

绵羊Callipyge基因研究进展

Callipyge基因以极性超显性的方式遗传。它的表达直接影响肌肉的数量,钙蛋白酶抑制蛋白的活性。本文综述了Callipyge基因的遗传方式、遗传效应及其作用机理的研究进展,并进一步探讨了Callipyge绵羊的肉质改良技术。     

Gene structure of carp Cyprinus carpio cathepsin B

ABSTRACT:   The 2474 nucleotides of carp cathepsin B gene (corresponding to the part of open reading frame and 3'non-coding region of cDNA) have been determined by polymerase chain reaction cloning, which was organized into nine exons and eight introns. The boundary sequences of the exon-intron junctions conformed to the GT/AG consensus rule. One polyadenylation signal sequece of AATAAA was found in the 3'non-coding region. The sizes of the determined introns were approximately 100-200 bp in length (varied from 71 bp-239 bp), which were significantly shorter than those of mouse cathepsin B gene.     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)Sox基因家族生物信息学分析

Sox(SRY-related HMG-box)基因家族是在动物体内发现的一类编码转录因子的基因家族,广泛参与了动物生长发育、理化反应,特别是性别决定和分化等过程.本研究采用生物信息学方法,利用Sox基因高度保守的HMG-box区序列作为种子序列,检索半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)基因组注释的蛋白数据库,共鉴定分离出23个Sox基因.并在全基因组水平对半滑舌鳎Sox基因家族进行了保守结构域序列、进化、基因结构、染色体定位及基因表达模式的系统分析.结果显示,通过保守结构域分析发现了半滑舌鳎Sox基因家族除CseSox32外,皆存在一段9个氨基酸残基(RPMNAFMVW)的高度保守基序;结合保守结构域及进化分析,所有半滑舌鳎Sox基因被分为B1、B2、C、D、E、F和K共7个亚族,且不同的亚族在进化上存在种间趋同性和种内特异性;基因结构分析将半滑舌鳎Sox基因分为两大类,即单外显子类和多外显子类;而染色体定位分析则显示,Sox基因在染色体上散乱分布,不存在集簇现象;不同类型性腺及幼鱼变态前后的Sox基因家族表达谱显示,半滑舌鳎Sox基因具有不同的组织表达模式,表明其在性别分化、性腺发育及早期幼鱼发育过程中可能发挥了重要作用.本研究对于今后半滑舌鳎Sox基因家族深入的功能验证及分子作用机制研究具有重要的意义,也为日益丰富的水产基因组资源的挖掘利用提供了参考.