溶藻弧菌脂多糖对大菱鲆免疫保护试验

采用粗提脂多糖(LPS)对体重为110～150g的大菱鲆进行免疫保护实验。注射浓度为20mg/mL和40mg/mL的LPS溶液0.2mL,以及按5‰比例添加到饲料中进行投喂试验。免疫后用0.1mL浓度为1×109cfu/mL的溶藻胶弧菌分别进行5次感染实验。结果显示,第7天即可产生免疫保护作用,RPS可达75%,免疫保护作用可持续3个月。     

草鱼对鱼害粘球菌类脂多糖的免疫反应

LPS 浓度为2mg/ml 的免疫鱼死亡率最低,为5%;1mg/1ml的免疫鱼,死亡率为18%;3mg/ml 的免疫鱼死亡率为26%;而4mg/ml 的免疫鱼死亡率最高,达50%.     

秦皮与甲氧苄啶对仔猪黄痢病原菌的联合抑菌试验

利用秦皮与甲氧苄啶(TMP)联合用药进行仔猪黄痢病原菌的体外抑菌试验,探讨中西药结合的抗菌效果。结果表明,秦皮和TMP的对致病性大肠杆菌的最小抑菌浓度分别为0.65g/mL和1.25mg/mL;二者联合用药后,秦皮和TMP的最小抑菌浓度分别下降至0.325g/mL和0.625mg/mL,抗菌作用表现为相加作用,抑菌效果显著。     

二溴海因对白云山鱼的急性毒性试验

通过二溴海因对国家二级保护水生野生动物白云山鱼的急性毒性作用实验.观察了白云山鱼对不同浓度的二溴海因的毒性反应症状,当药物浓度为70mg/L,60 mg/L,50mg/L,40mg/L,30mg/L,20mg/L时,二溴海因对白云山鱼的半致死浓度12hTLM,24hTLM和48hTLM分别为44mg/L、36mg/L、35mg/L,安全浓度为10.5mg/L.该实验为白云山鱼鱼病预防、治疗、保护提供参考依据.该研究对保持观赏鱼的生物多样性、对白云山鱼物种的延续及生态环保等方面具有重要意义.     

壳聚糖对异育银鲫和中华绒螯蟹淋巴细胞部分特性的影响

通过体外及体内实验2种途径,探讨了壳聚糖对异育银鲫(Carassius auratus gibelio)和中华绒螯蟹(Eriocheirr sinensis)的血淋巴细胞部分特性的影响.体外实验通用3HrdR、14C-UR、3H-Val掺入法研究了不同剂量[0μg/mL(对照)、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL和100μg/mL]的壳聚糖对异育银鲫PHA和LPS刺激的淋巴细胞DNA、RNA和蛋白质增殖的影响.结果表明,随着蟹血淋巴中壳聚糖剂量的增加,检测到3H-TdR、14C-UR、3H-Val的放射强度逐渐增强,当壳聚糖终质量浓度达20μg/mL时,PHA和LPs刺激的DNA、RNA、蛋白质增殖作用达到最大值,而壳聚糖的终质量浓度达到100μg/mL时,放射强度低于不添加壳聚糖时,表明此时的壳聚糖剂量抑制了淋巴细胞DNA、RNA和蛋白质的增殖.同样,随着鲫血淋巴中壳聚糖剂量的增加,检测到3H-TdR、14C-UR、3H-Val的放射强度也逐渐增强,当壳聚糖终质量浓度达10μg/mL时,经PHA和LPS刺激的放射强度达峰值,其每分钟放射性计数(cpm)分别为11 133、8 882,8457、6 726,5964、4 286,而壳聚糖的终质量浓度达到100μg/mL时放射强度甚至低于不添加壳聚糖时,表明此时的壳聚糖剂量抑制了淋巴细胞DNA、RNA和蛋白质的增殖.同时,利用流式细胞仪技术,检测了以壳聚糖(100 mg/kg)投喂鲫和蟹不同时间(7～30d)后淋巴细胞的细胞周期(cells cycle)、增殖指数(PI)和凋亡指数(AI)的变化情况.结果表明,各采样时间蟹淋巴细胞的细胞周期、增殖指数(PI)和凋亡指数(AI)与对照组无显著差异(P>0.05);日粮中添加壳聚糖后对鲫淋巴细胞AI没有显著影响(P>0.05),但对PI则显著提高(P<0.05),对鲫淋巴细胞周期中的G2/M和S时相的比例显著或极显著提高.实验结果提示,壳聚糖可促进鲫和蟹淋巴细胞的增殖,从而增强其免疫机能,但不同水产动物对壳聚糖的免疫刺激作用敏感性不同.     

不同亚硝酸盐对斑马鱼胚胎发育的急性毒性效应

用质量浓度为0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.2 mg/mL、1.6 mg/mL和2.0 mg/mL的NaNO_2以及质量浓度为0.5mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL和3.0 mg/mL的KNO_2溶液分别处理受精后6 hpf (hours post fertilization)的斑马鱼Danio rerio胚胎,培养至96 hpf,每隔24 h在体视显微镜下观察记录胚胎死亡、孵化和发育异常状况,并测定胚胎自主活动次数、心率和体长,研究不同亚硝酸盐对斑马鱼胚胎发育的影响。结果表明:当亚硝酸盐质量浓度为0～0.5 mg/mL时,斑马鱼胚胎生长发育无明显异常;当亚硝酸盐质量浓度达到或超过1.0mg/mL时,开始出现毒害效应:胚胎自主活动、心跳、孵化率和体长下降,未孵出的胚胎发育异常,心包水肿、脊柱弯曲、头部发黑和死亡。NaNO_2和KNO_2的96 hpf-LC_(50)分别为1.30 mg/mL和1.44 mg/mL,96 hpf-EC_(50)分别为1.12mg/mL和1.50 mg/mL,96 hpf-IC_(50)分别为0.84 mg/mL和1.04 mg/mL。亚硝酸盐对斑马鱼胚胎发育有一定的抑制作用和致畸效应,且NaNO_2的毒害作用大于KNO_2。     

中草药治疗水霉病的配比研究

为探究3种中草药不同配比对水霉病的抑菌效果,选取大黄、苦参、五倍子3种中草药,接种培养水霉孢子,采用抑菌圈测定法检验抑菌效果。将三种中草药分别设置1.0、0.5、0.3 mg/mL(药物含量)三个浓度,并设置9组不同配比组合进行实验。结果显示,在孢子数浓度为8×10~7cuf/mL的情况下,苦参1.0 mg/mL+大黄0.3 mg/mL+五倍子0.3 mg/mL以1∶1∶1组合,抑菌圈直径为19.5 mm,对水霉菌抑制效果最好,同时复方组合对水霉菌的抑制效果均要好于单方中草药。     

五倍子对3种致病菌的体外抑菌和急性毒性试验

采用试管两倍稀释法测定五倍子水煎煮液对3种鱼类常见致病菌的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）,并进行了对鲤鱼的急性毒性试验.结果表明,五倍子煎煮液对温和气单胞菌、爱德华氏菌、柱状屈挠杆菌的最小抑菌浓度分别为6.250 mg/mL、3.125 mg/mL、0.781 mg/mL;最小杀菌浓度分别为12.500mg/mL、12.50.mg/mL、3.125 mg/mL.五倍子对鲤鱼的48 h半致死浓度为1.1015g/kg,安全浓度为0.1102g/kg.五倍子具有较好的杀菌防病效果.     

生孢噬纤维菌SM多糖的提取及对草鱼的毒性测定

采用乙醇沉淀法提取SM多糖,并用苯酚-硫酸法进行了多糖含量的测定,通过对草鱼的急性毒性实验,结果表明:生孢噬纤维菌胞外粗多糖对草鱼的毒性很低,当浓度为3.2mg/mL时,对草鱼的致死率只有10%,而当浓度等于或低于1.6mg/mL时对草鱼无毒性。     

家兔小肠上皮细胞LPS炎症细胞模型的构建

试验采用Ⅰ型胶原酶(collagenaseⅠ)消化法分离培养刚出生未哺乳仔兔原代IEC细胞,并进行纯化和鉴定,以及使用LPS诱导构建纯化后的F3代IEC炎症细胞模型。结果表明:采用胶原酶Ⅰ(0.2%)消化法可以成功分离培养原代IEC,经纯化和CK-18单克隆抗体鉴定纯度可达95%以上。终浓度1000ng/mL的LPS作用IEC培养体系24h,可使IL-1β、TNF-α的含量显著高于对照组(P0.01)。试验结论:1000ng/mL的LPS诱导家兔IEC细胞24h,可成功构建IEC炎症细胞模型,为研究肠道和IEC免疫调控机制,提供了合适的细胞模型。     

鱼源植物乳杆菌表达IPNV VP2-VP3重组蛋白及其口服免疫程序

为比较鱼源乳酸菌表达系统口服疫苗在不同免疫程序下诱导鱼免疫应答水平的差异,确定鱼源乳酸菌表达系统口服免疫虹鳟幼鱼的免疫程序。本研究构建了重组表达IPNV VP2-VP3蛋白的鱼源植物乳杆菌L1212,将重组菌pPG612-VP2-VP3/L1212包裹颗粒饲料,口服免疫虹鳟幼鱼。免疫程序分为连续免疫组、免疫1 d后间隔1 d再免疫1 d组、连续免疫4 d后32 d加强免疫1次组和间隔免疫后32 d加强免疫1次组。免疫后进行尾动脉采血,间接ELISA方法检测各组血清抗体效价,免疫接种66 d后,腹腔注射IPNV,计算各组相对免疫保护率。确定颗粒饲料按照1 mL/g比例与108 CFU/mL重组菌pPG612-VP2-VP3/L1212和2.5%海藻酸钠混合,于20℃烘干制备口服疫苗。间隔免疫组血清抗体效价和攻毒保护率均显著高于其他组,并且免疫2次的间隔免疫组的血清抗体效价和攻毒保护率均显著高于免疫1次间隔免疫组。采用重组菌包被颗粒饲料饲喂虹鳟幼鱼,间隔免疫的免疫程序和免疫保护率优于连续免疫的免疫程序,对IPNV的入侵起到保护作用。     

Immunization of rainbow trout Oncorhynchus mykiss (Walbaum) with a crude lipopolysaccharide extract from Flavobacterium psychrophilum

Control methods for Flavobacterium psychrophilum are limited and oftentimes ineffective; hence, research efforts have focused on vaccine development. This study tested the hypothesis that a crude lipopolysaccharide (LPS) extract from F. psychrophilum will elicit a protective immune response in rainbow trout Oncorhynchus mykiss (Walbaum) against F. psychrophilum challenge. Rainbow trout (mean weight, 3 g) were immunized intraperitoneally with the following treatment and control preparations: 10 μg of crude LPS with or without Freund's complete adjuvant (FCA), 25 μg of crude LPS with or without FCA and saline with or without FCA. Immunization of fish with 10 or 25 μg of crude LPS/FCA resulted in significant antibody responses against F. psychrophilum using ELISA with a whole‐cell lysate as the coating antigen, but only minimal levels of protection were conferred following F. psychrophilum challenge at 14 weeks post immunization. Western blot analyses demonstrated that fish exhibited antibodies specific for low‐molecular mass proteins present in the crude LPS extract, but did not exhibit antibodies specific for F. psychrophilum LPS. The results indicate that higher immunization doses and/or the use of an alternative extraction method that yields larger LPS molecules (23–70 kDa) may be necessary to elicit specific antibody responses against F. psychrophilum LPS.     

中华鳖爱德华菌病病原菌的分离鉴定及致病因子研究

采用API 20E系列生化鉴定及16S rDNA和gyrB基因序列同源性分析方法,对从患病中华鳖(Trionyx sinen-sis)肝脏中分离到的一株细菌TL5m进行了鉴定,并通过人工感染试验,对该菌株进行了毒力检测;此外分别提取该TL5m株的主要致病因子外膜蛋白、脂多糖和胞外产物,对中华鳖进行毒力和免疫保护率试验。结果显示:菌株TL5m的API 20E鉴定编码为4544000,99.9%为迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda);其16SrDNA序列和gyrB基因序列(GenBank登录号分别:EF121756和GU563803)与迟钝爱德华氏菌的同源性最高(分别为94%和98%);菌株TL5m对中华鳖的半数致死量LD50为2.45×106 CFU/ind。药敏感结果显示菌株对磷霉素、菌必治、头孢孟多、头孢噻吩、壮观霉素高度敏感。外膜蛋白攻毒剂量60μg/ind和脂多糖攻毒剂量400μg/ind时,对中华鳖的致死率都为33.3%,胞外产物对中华鳖的LD50为31.73μg/ind;全菌灭活苗、胞外产物、外膜蛋白和脂多糖的免疫保护率分别为75%、62.5%、25%和87.5%。结果表明,发病中华鳖的病原菌为迟钝爱德华氏菌,其分泌的胞外产物对中华鳖具有较高毒力;提取的脂多糖对中华鳖遭受迟钝爱德华氏菌攻击具有较高免疫保护率。     

Immunological responses in Atlantic salmon, Salmo salar L., against purified serine protease and haemolysins from Aeromonas salmonicida

Abstract. A method for purification of the 70-KDa extracellular serine protease of Aeromonas salmonicida by hydrophobic chromatography and ion exchange is described. The purified protease, adsorbed onto mineral particles, was used for immunization of salmon. Other groups of salmon were immunized with particles coated with purified glycerophospholipid:cholesterol acyltransferase (GCAT) or with the acyltransferase complexed with LPS (GCAT-LPS). Humoral immune responses assayed after 6 weeks by ELISA, showed relatively good responses against GCAT-LPS, while titres of antisera against the purified protease and GCAT were scarcely above those of control sera. However, the antibody responses to each toxin were shown by Western blotting to be specific and qualitatively similar to responses seen in rabbits. The toxin preparations were also used (in combination with whole bacteria) for vaccination of salmon. On challenge 3 months later, only GCAT-LPS elicited significant immunological protection. However, a more convincing protection was seen when total extracellular product was present in the vaccine.     

30种中草药对鲟鱼源海豚链球菌的体外抑菌作用

为研究黄连等30种中草药对鲟鱼源海豚链球菌的抑菌、杀菌作用,通过水煎煮法对30种中草药进行提取,采用牛津杯打孔法,在观察鲟鱼源海豚链球菌对30种中草药敏感性的基础上,进一步采用二倍稀释法测定中草药对鲟鱼源海豚链球菌的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度。试验结果表明,鲟鱼源海豚链球菌对黄连、黄芩、连翘、丁香高度敏感,其中黄连的体外抑菌效果最佳,抑菌圈直径为(28.35±0.65) mm;对秦皮、山楂、女贞子、苦楝皮、石榴皮等均中度敏感;对丹参、猪苓、苍术、茯苓、贯众和生首乌低度敏感。黄连、黄芩、连翘、丁香、秦皮对鲟鱼源海豚链球菌的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度分别为1.95 mg/mL和3.90 mg/mL、1.95 mg/mL和15.62 mg/mL、3.90 mg/mL和7.81 mg/mL、3.90 mg/mL和15.62 mg/mL、7.81 mg/mL和7.81 mg/mL,其余中草药对病原菌的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度均高于15.62 mg/mL和31.25 mg/mL。综上可知,黄连、黄芩、连翘、丁香、秦皮对鲟鱼源海豚链球菌具有较好的防治效果。     

尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体口服疫苗的研制及其免疫效果

链球菌病是威胁我国罗非鱼养殖产业健康发展的重要病害之一。为研制出免疫效果好、操作简便的罗非鱼链球菌病疫苗,本研究构建重组表达无乳链球菌Sip蛋白的穿梭质粒pNZ8124-Sip,通过酶切和测序验证后电转化乳酸乳球菌NZ9000,获得能够诱导重组表达无乳链球菌Sip蛋白的乳酸菌活菌载体疫苗。采用SPS-PAGE电泳摸索最佳诱导浓度和诱导时间以获得最大表达量,通过镍柱纯化目的蛋白并进行Western blot检测;利用不同浓度的重组乳酸菌活载体疫苗灌胃口服免疫尼罗罗非鱼,采用间接ELISA法测定免疫后血清抗体水平变化,通过人工腹腔注射感染无乳链球菌获得相对免疫保护率。研究结果显示,构建的重组乳酸乳球菌可通过nisin诱导表达大小为48 ku特异性蛋白,与目的蛋白大小一致;PAGE电泳显示,重组蛋白主要以可溶蛋白和包涵体2种形式存在,其中胞内可溶性蛋白浓度达7.65 mg/mL;诱导表达的最佳条件为100 ng/mL nisin诱导6 h;Western blot检测结果显示,诱导蛋白可与鼠抗His标签抗体特异性结合。口服免疫结果显示,中浓度组(2.24×10~(10) CFU/mL)和低浓度组(2.24×10~9 CFU/mL)免疫2次能够显著提高尼罗罗非鱼的血清抗体水平和抗无乳链球菌感染能力,中浓度免疫组的相对免疫保护率最高为41.0%。本研究可为罗非鱼链球菌病口服疫苗的研究奠定基础,具有广阔的应用前景。     

细菌脂多糖处理对斑马鱼免疫球蛋白亚型表达水平的影响

以20μg/mL的细菌脂多糖溶液对斑马鱼进行浸泡处理24h,用实时荧光定量PCR技术分析斑马鱼IgM、IgD和IgZ基因表达水平的变化。对照组斑马鱼中IgD和IgZ的表达水平相当,且均低于IgM,说明IgM可能具有更重要的生物学作用。细菌脂多糖处理后,斑马鱼3种Ig亚型的表达水平均表现出先升后降趋势,而且均在12h达到最高值。然而,IgM和IgZ的升高幅度显著高于IgD,而且IgM和IgZ在处理24h后表达水平仍然显著高于对照组,说明IgM和IgZ在鱼类病原防御中具有更重要的免疫作用。另外,IgM对细菌脂多糖处理的应答速度比IgZ更快,说明体液免疫系统能够更快地对细菌脂多糖处理作出有效应答,而黏膜免疫系统则反应较慢。     

Beneficial effects of Bacillus subtilis on water quality,growth, immune responses,endotoxemia and protection against lipopolysaccharide‐induced damages in Oreochromis niloticus under biofloc technology system

The present research explored the effects of Bacillus subtilis on water quality, growth, immune responses, endotoxemia and protection against lipopolysaccharide (LPS) damages in Nile tilapia Oreochromis niloticus under biofloc system. B. subtilis was added at 0, 1, 2, 3 and 4 grams (1.19 × 10⁸ CFU/g) per kg of basal diet, named T1 (control), T2, T3, T4 and T5, respectively, and fed to fish (14.82 ± 0.42 g) for 50 days. The concentrations of TAN, NO₂ and NO₃ were significantly reduced, and fish fed probiotics displayed significantly better growth performances versus the control, concomitantly with significantly enhanced activities of digestive enzymes. They also showed significantly declined serum glucose and cholesterol vice versa significantly improved immune responses (total protein, albumin, globulin, lysozyme, alternative complement, protease, immunoglobulins, alkaline phosphatase and respiratory burst), antioxidant capacity (superoxide dismutase, total antioxidant capacity, malondialdehyde) and skin mucus parameters (total protein, lysozyme, alternative complement, protease, immunoglobulins). Meanwhile, significantly lower endotoxin (LPS) concentrations were detected in the intestines and serum of fish fed probiotics. LPS challenge induced profound oxidative stress and impaired immune responses. Interestingly, probiotic alleviated LPS‐induced damages and restored mentioned parameters. In conclusion, B. subtilis effectively enhanced fish production, immunity and protection against LPS‐induced damages in tilapia under biofloc system.     

恶喹酸与诺氟沙星对异育银鲫体内嗜水气单胞菌的抑菌效果比较

在水温(25±2)℃下,给体质量150~200g的异育银鲫分别口灌3种剂量(20、30、40mg/kg)的诺氟沙星和恶喹酸,结合这两种药物对嗜水气单胞菌AH10的体外药效学研究和对异育银鲫单次口灌不同剂量的诺氟沙星、恶喹酸的体内药代动力学,研究诺氟沙星、恶喹酸对异育银鲫体内嗜水气单胞菌AH10的抑菌效果。试验结果表明,恶喹酸和诺氟沙星对嗜水气单胞菌AH10的最小抑菌质量浓度分别为1μg/mL和0.5μg/mL。口灌上述3种剂量恶喹酸、诺氟沙星后,异育银鲫血浆中恶喹酸的最大药物质量浓度分别为4.1μg/mL、6.0μg/mL和8.89μg/mL;诺氟沙星的最大药物质量浓度分别为11.5μg/mL、15.1μg/mL和18.9μg/mL;恶喹酸的最大药物质量浓度/最小抑菌质量浓度分别为4.1、6.0和8.89;诺氟沙星的最大药物质量浓度/最小抑菌质量浓度分别为23、30.2和37.8;恶喹酸0~24h内药—时曲线下面积/最小抑菌质量浓度分别为21.6214、33.1449、39.1846;诺氟沙星0~24h内药—时曲线下面积/最小抑菌质量浓度分别为274.75、451.55、578.35。综合0~24h内药—时曲线下面积/最小抑菌质量浓度、最大药物质量浓度/最小抑菌质量浓度这两个指标可知,诺氟沙星对异育银鲫体内的嗜水气单胞菌AH10抑制效果强于恶喹酸。     

地塞米松对ND免疫鸡主要免疫器官及抗体滴度的影响

将75只1日龄非免疫健康罗曼蛋鸡随机均分为地塞米松高剂量组(12.5mg/mL)、低剂量组(6.25mg/mL)和阴性对照组,同时进行了鸡新城疫免疫接种;分别于免疫后7、14、21、28、35d随机取5只心脏采血后分离血清,检测鸡新城疫HI抗体效价,同时摘取脾脏、胸腺和法氏囊并称重,计算免疫器官指数。结果表明,试验组的ND抗体效价与免疫器官指数显著低于对照组(P<0.05),而且高剂量组低于低剂量组。