一种鰑鱼诺卡氏菌酪氨酸蛋白磷酸酶基因的克隆及功能初步研究

這鱼诺卡氏菌是鱼类诺卡氏菌病的主要病原,可导致鱼类慢性系统性肉芽肿疾病。這鱼诺卡氏菌全基因组序列分析发现了一个酪氨酸蛋白磷酸酶(protein tyrosine phosphtase,PTP)基因,生物信息学分析显示该基因很可能编码一个靶向定位于宿主细胞线粒体的分泌蛋白。本实验对這鱼诺卡氏菌PTP进行了基因克隆、分泌蛋白鉴定、亚细胞定位、过表达和线粒体膜电位检测,结果显示,在這鱼诺卡氏菌胞外产物中质谱鉴定到了PTP肽段,证实其为分泌蛋白。亚细胞定位研究观察到PTP-GFP融合蛋白均匀地分布在FHM细胞中,与线粒体分布不重合,说明這鱼诺卡氏菌PTP蛋白并未靶向定位于线粒体。亚细胞定位和过表达研究都显示PTP蛋白在FHM细胞中表达后,细胞核出现固缩浓染、凋亡小体等明显的细胞凋亡特征。通过线粒体膜电位检测表明,在pcDNA-PTP转染后48 h,线粒体跨膜电位被明显破坏,说明這鱼诺卡氏菌PTP很可能是一种可诱导细胞凋亡的细菌蛋白。通过对這鱼诺卡氏菌PTP开展基因克隆和功能初步研究,为进一步揭示该基因的功能和深入了解這鱼诺卡氏菌的分子致病机理奠定了基础。     

一种(鱼师)鱼诺卡氏菌酪氨酸蛋白磷酸酶基因的克隆及功能初步研究

這鱼诺卡氏菌是鱼类诺卡氏菌病的主要病原,可导致鱼类慢性系统性肉芽肿疾病.這鱼诺卡氏菌全基因组序列分析发现了一个酪氨酸蛋白磷酸酶(protein tyrosine phosphtase,PTP)基因,生物信息学分析显示该基因很可能编码一个靶向定位于宿主细胞线粒体的分泌蛋白.本实验对這鱼诺卡氏菌PTP进行了基因克隆、分泌蛋白鉴定、亚细胞定位、过表达和线粒体膜电位检测,结果显示,在這鱼诺卡氏菌胞外产物中质谱鉴定到了PTP肽段,证实其为分泌蛋白.亚细胞定位研究观察到PTP-GFP融合蛋白均匀地分布在FHM细胞中,与线粒体分布不重合,说明這鱼诺卡氏菌PTP蛋白并未靶向定位于线粒体.亚细胞定位和过表达研究都显示PTP蛋白在FHM细胞中表达后,细胞核出现固缩浓染、凋亡小体等明显的细胞凋亡特征.通过线粒体膜电位检测表明,在pcDNA-PTP转染后48 h,线粒体跨膜电位被明显破坏,说明這鱼诺卡氏菌PTP很可能是一种可诱导细胞凋亡的细菌蛋白.通过对這鱼诺卡氏菌PTP开展基因克隆和功能初步研究,为进一步揭示该基因的功能和深入了解這鱼诺卡氏菌的分子致病机理奠定了基础.     

鱼诺卡氏菌动力蛋白调节蛋白robl/LC7的亚细胞定位和功能初步研究

鱼类诺卡氏菌病是一种慢性系统性肉芽肿疾病,鱼诺卡氏菌是其主要病原。鱼诺卡氏菌全基因组生物信息学分析,发现了一个可能靶向定位于宿主细胞线粒体的分泌蛋白——动力蛋白调节蛋白robl/LC7。为了对鱼诺卡氏菌robl/LC7的亚细胞定位和功能进行初步研究,实验对鱼诺卡氏菌robl/LC7进行了基因克隆、真核表达重组质粒构建、分泌蛋白鉴定、亚细胞定位、过表达和凋亡检测。结果显示,成功克隆了鱼诺卡氏菌robl/LC7基因并构建了其真核表达质粒p EGFP-robl/LC7和pc DNA-robl/LC7;鱼诺卡氏菌分泌蛋白质谱鉴定证实robl/LC7为分泌蛋白;亚细胞定位研究显示robl/LC7-GFP融合蛋白呈全细胞分布,不与线粒体共定位;凋亡检测发现robl/LC7过表达能诱导FHM细胞凋亡。研究表明,鱼诺卡氏菌robl/LC7是一个不与线粒体共定位的分泌蛋白,其可能通过参与细胞凋亡调控,协助鱼诺卡氏菌在宿主体内生存和免疫逃避,并在鱼诺卡氏菌的致病过程中具有重要作用。     

鰤鱼诺卡氏菌培养条件及培养基的优化

对鰤鱼诺卡氏菌（Nocardia seriolea）ZJ0503的增菌培养基和生长条件进行优化。研究了温度、盐度、初始pH对鰤鱼诺卡氏菌生长的影响,并通过单因素试验对培养基的碳源、氮源和无机盐成分进行了筛选,采用正交实验法对培养基各主要成分的添加量进行了优化。结果表明,鰤鱼诺卡氏菌最适宜生长条件为温度25 ℃、盐度5、pH 6.5±0.2;经筛选,鰤鱼诺卡氏菌培养基中最佳碳源是葡萄糖,最佳氮源是酵母粉,促生长作用最强的2种无机盐是磷酸氢二钾（K2HPO4）和氯化钙（CaCl2）;确立了培养基优化配方为葡萄糖20 g·L-1,酵母粉15 g·L-1,K2HPO4 0.75 g·L-1,CaCl 20.2 g·L-1（单独灭菌）,氯化钠（NaCl2）5 g·L-1,pH 6.5±0.2。     

乌鳢致病诺卡氏菌的鉴定及其系统发育分析

2006年6月,浙江萧山养殖乌鳢(Ophiocephalus argus Cantor)暴发一种类似细菌性的结节病,从患典型症状乌鳢肝脏和肾脏中分离到纯度一致的菌株W060622.形态结构观察显示,菌株W060622革兰氏阳性,好氧,具有弱抗酸性,菌体呈长或短杆状,或细长分枝状.常规生理生化试验表明,该菌株具有诺卡氏菌属(Nocardia)的基本特性.对其16S rRNA基因进行PCR扩增、测序及系统发育分析,结果表明,该菌株与诺卡氏菌属的菌株亲缘关系最近,与鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolea JCM 3360T)的16S rRNA基因序列相似性达99.9%.据此鉴定菌株W060622为鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolea).     

蓝鳃太阳鱼诺卡氏菌的分离鉴定及药敏分析

为探明患结节病蓝鳃太阳鱼的病因,从蓝鳃太阳鱼(Lepomis macrochirus)脾脏结节处分离获得一病原菌SD1810。通过菌落形态、细菌生理生化鉴定和16S rRNA基因序列分析,确定所得菌株为鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)。人工回归感染试验结果显示,注射浓度为2.8×107 CFU/mL的菌液能使蓝鳃太阳鱼患病致死,发病症状与原感染鱼相似。从死亡太阳鱼体内可重新分离到与SD1810形态特征、生理生化指标相一致的病菌。对分离获得的鰤鱼诺卡氏菌进行药敏试验分析,结果表明,鰤鱼诺卡氏菌SD1810对红霉素、利福平、庆大霉素、氯霉素、阿米卡星、氟苯尼考等10种抗生素极其敏感,对头孢唑啉,诺氟沙星,青霉素、氨苄青霉素和阿莫西林等6种抗生素具有耐药性。     

乌鳢诺卡氏菌病致病菌的药物敏感性及野外用药疗效

<正>目前,人工养殖乌鳢已经在我国沿海地区逐渐成为淡水鱼主养品种之一。随着乌鳢养殖规模的扩大,病害的发生日益频繁,诺卡氏菌病(Nocardiosis)就是乌鳢养殖过程中的多发病。研究结果证实,鰤诺卡氏菌(Nacardia seriolea)是乌鳢诺卡氏菌病的致病菌。诺卡氏菌是一种革兰氏阳性丝状杆菌,广泛分布在土壤、活性污泥、水、动植物和人的组织中,以腐生为主,一些菌株是人和动物的机会致病菌。发     

鱼类诺卡氏菌病的研究进展

诺卡氏菌广泛分布于自然界的水源中,是一种条件致病菌。引起鱼类诺卡氏菌病的细菌主要有星形诺卡氏菌(Nocardia asteroides)、鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)和杀鲑诺卡氏菌(Nocardia salmonicida)。鱼类诺卡氏菌病在每年的4-11月皆可发生,发病高峰主要集中在6-10月,在水温25~28℃时发病最为严重,死亡率最高。     

(鱼师)鱼诺卡氏菌研究进展

诺卡氏菌(Nocardia sp.)是一种革兰氏阳性丝状杆菌,具有抗盐、碱,耐干旱的特点,广泛分布于土壤、水体、空气、腐烂植物和动物粪便中[1-2].该菌为条件致病菌,其中某些种类为人畜共患[1].目前,已发现(鱼师)鱼诺卡氏菌(N.seriolae)、星状诺卡氏菌(N.asteroids)、杀鲑诺卡氏菌(N.salmonicida)和粗形诺卡氏菌(N.crassostreae)对鱼类具有致病性[1,3].鱼诺卡氏菌是鱼类诺卡氏菌病的主要病原,多数为腐生,少数营寄生[4].水产养殖动物一旦感染该菌,患病周期长、治愈率低、累积死亡率高,给我国的加州鲈(Microperus salmoides)、乌鳢(Channa argus)等特种水产养殖业造成了极大的经济损失[1,5].笔者综述了鱼诺卡氏菌的国内外研究概况,旨在为该病的有效防控提供参考.     

乌鳢诺卡氏病及其防治

一、病原与病因1.病原对乌鳢养殖影响最大、危害最严重的是乌鳢的诺卡氏病,据报道,引起乌鳢诺卡氏菌病的病原为%鱼诺卡氏菌(Nacardia seriolea)。     

鱼诺卡氏菌培养条件及培养基的优化

对鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolea)ZJ0503的增菌培养基和生长条件进行优化。研究了温度、盐度、初始pH对鱼诺卡氏菌生长的影响,并通过单因素试验对培养基的碳源、氮源和无机盐成分进行了筛选,采用正交试验法对培养基各主要成分的添加量进行了优化。结果表明,鱼诺卡氏菌最适宜生长条件为温度25℃、盐度5、pH 6.5±0.2;经筛选,鱼诺卡氏菌培养基中最佳碳源是葡萄糖,最佳氮源是酵母粉,促生长作用最强的2种无机盐是磷酸氢二钾(K2HPO4)和氯化钙(CaCl2);确立了培养基优化配方为葡萄糖20 g·L-1,酵母粉15 g·L-1,K2HPO40.75 g·L-1,CaCl20.2 g·L-1(单独灭菌),氯化钠(NaCl)5 g·L-1,pH 6.5±0.2。     

鱼类诺卡氏菌病的研究进展

概述水产养殖中鱼类诺卡氏菌病及其诊断方法、防治手段,为鱼类诺卡氏菌病的防治提供参考。检索、查阅近10年国内外有关鱼类诺卡氏菌病的相关文献,分别从主要症状、解剖、生物技术阐述鱼类诺卡氏菌病诊断方法和按化学药、生物药、中草药防治等方面的内容进行分类整理。鱼类诺卡氏菌病发生的最适水温是25~28℃,主要症状为病鱼体表出现损伤、溃烂、出血、腹部膨胀等现象;解剖病鱼腹腔有黄色液体,肝、肾脏、脾脏有大量白色结节;生物技术诊断主要用PCR(Polymerase Chain Reaction)法和环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术;免疫疫苗处于实验研发阶段;鱼类诺卡氏菌病的防治一般使用抗生素类药物,同时配合药物拌料投喂,连续用药3~6天,治愈率在20%~60%之间。由于对鱼类诺卡氏菌病没有确切的诊断方法和不合理使用化学类药物致耐药菌增加,使防治鱼类诺卡氏菌病变得更加困难,而中草药在防治鱼类诺卡氏菌病方面具有良好的应用前景,有望成为新的研究热点。     

灭活鰤鱼诺卡氏菌对乌醴非特异性免疫指标的影响

应用浓度为108CFU/ml的0.4%甲醛灭活鰤鱼诺卡氏菌Nocardia seriolea,经超声波破碎后对乌鳢进行腹腔注射,剂量为0.5 ml/尾,对照组同法等量注射灭菌生理盐水。分别于实验第0、3、6、9、12、15、18、21天抽取乌鳢血液,测定其血细胞数、血清总蛋白含量及血清碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶、溶菌酶活性。结果显示,注射灭活鱼师鱼诺卡氏菌后,乌鳢血细胞数呈先升高后降低的变化趋势,在实验第12天时注射组血细胞数显著高于对照组;血清总蛋白含量在实验第9天后均高于对照组;血清碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶和溶菌酶等活性在实验时间内均发生了显著的变化。研究结果表明,灭活菌苗的刺激能引起乌醴血细胞的增殖以及血清中各非特异性免疫指标的变化,从而提高机体自身的免疫保护力。     

一例大口黑鲈混合感染锚头蚤和诺卡氏菌病的诊治

2022年7月天津地区出现一鲈鱼养殖场大口黑鲈(Micropterus salmoides)死亡的情况，死亡率在10%左右。为查明大口黑鲈的死亡原因，对濒死大口黑鲈进行临床解剖、寄生虫检测、细菌分离鉴定和虹彩病毒检测，最后诊断为锚头蚤和鰤鱼诺卡氏菌混合感染。对鱼体使用聚维酮碘进行消毒，氟苯尼考拌喂10 d后大口黑鲈基本恢复正常。     

鱼诺卡氏菌研究进展

正诺卡氏菌(Nocardiasp.)是一种革兰氏阳性丝状杆菌,具有抗盐、碱,耐干旱的特点,广泛分布于土壤、水体、空气、腐烂植物和动物粪便中[1-2]。该菌为条件致病菌,其中某些种类为人畜共患[1]。目前,已发现鱼诺卡氏菌(N.seriolae)、星状诺卡     

诺卡氏菌mce1A基因的克隆及重组表达

诺卡氏菌(Nocardia seriolae)是近年来海淡水养殖鱼类频发慢性传染病的病原菌。该研究通过引物扩增得到全长1 254 bp、编码417个氨基酸的诺卡氏菌毒力因子mce1A基因的全序列。该基因编码蛋白质的分子量约为43.98 k D,理论等电点5.14,含有161个疏水性氨基酸,疏水性平均值为0.044,为疏水性蛋白,具有α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲3种结构。经预测,Mce1A有MCE、DUF3407区域、OM_asym_Mla D、Mtu_fam_mce、Mla D 5个结构域,彼此交叠,含有公共区域。根据Mce1A氨基酸构建的系统进化树可以发现诺卡氏菌和新星诺卡氏菌的亲缘关系最近。构建p ET32a-mce1A重组质粒并转化至大肠埃希菌BL21中,得到的重组蛋白的相对分子量约63 k D。温度、IPTG浓度对重组蛋白表达量没有影响。该研究为进一步研究Mce1A的致病机制奠定了基础。     

(鱼师)鱼诺卡氏菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中(鱼师)鱼诺卡氏菌16S-23S rRNA基因序列设计并合成一对特异性引物,经反应体系优化后建立了检测(鱼师)鱼诺卡氏菌的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法.结果显示,该方法线性关系良好,标准曲线的相关系数为0.998;溶解曲线分析显示产物为单一的特异峰;检测灵敏度可达10-6 μg/μL的DNA含量,与嗜水气单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、麦氏弧菌不发生交叉反应,具有良好的特异性.应用建立的方法在(鱼师)鱼诺卡氏菌病爆发时期,对16份鱼体组织、养殖水体、饲料等样品进行了检测,结果7份为阳性,与细菌分离、培养检查结果100％相符.既能检测发病鱼,又能检出未发病且已感染的病鱼,对病害的早期防控体现应用价值.结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量等优点,可用于鱼类致病(鱼师)鱼诺卡氏菌的快速检测.     

牙鲆NOD2基因的表达分析及在抗迟缓爱德华氏菌感染过程中的功能

本研究利用实验室已建牙鲆(Paralichthys olivaceus)转录组数据库预测得到牙鲆NOD2基因(PoNOD2),并利用PCR技术进行序列验证。同时,设计迟缓爱德华氏菌注射感染牙鲆成鱼和体外免疫刺激牙鲆鳃细胞系实验,探究PoNOD2基因在抗菌免疫反应中的作用。PoNOD2基因的开放阅读框长度为2964 bp,编码988个氨基酸。PoNOD2蛋白有3种保守结构域,包括C-末端LRR,中心NACHT和N-末端CARD结构域。实时荧光定量PCR结果显示,在所检测牙鲆组织中,迟缓爱德华氏菌的侵染能显著上调PoNOD2的表达。体外免疫刺激牙鲆鳃细胞系实验显示,在PGN、PolyⅠ:C和迟缓爱德华氏菌刺激下,PoNOD2表达上调。亚细胞定位显示,PoNOD2蛋白定位于牙鲆鳃细胞的细胞质中。在迟缓爱德华氏菌侵染牙鲆鳃细胞过程中,PoNOD2基因的过表达能够抑制细菌生长,并引起IL-1β、IL-6和IL-8等炎性细胞因子的表达上调。结果表明,PoNOD2在抑制迟缓爱德华氏菌生长以及调节牙鲆对病原菌的免疫应答中发挥重要作用。     

诺卡氏套餐使用心得——治疗加州鲈、乌鳢、大黄鱼烂身、内脏白点病

<正>一、诺卡氏套餐的介绍"诺卡氏套餐"是我公司开发的专业治疗诺卡氏菌病的内服药产品,该病主要表现为加州鲈、乌鳢、大黄鱼烂身、内脏白点。1.诺卡氏菌病的主要表现症状诺卡氏菌病主要表现症状为:①病鱼在池塘表面慢游,患病个体反应迟钝,游泳不活泼,离群独游,食欲下降;②病鱼烂身;③部分鱼鳃上有白色结节;④肝、脾、肾常有白色或淡黄色结节;⑤肝脏上常有弥散状出血;⑥部分发病鱼眼球突出等。     

鰤诺卡氏菌灭活疫苗对大口黑鲈非特异性免疫指标的影响

本研究采用福尔马林灭活的鰤鱼诺卡氏菌全细胞灭活疫苗作为免疫原,通过腹腔注射免疫健康大口黑鲈(Micropterus salmoides),分别于免疫后的第1、7、14、21、28和35天采集血液样品,对其外周血液的血细胞数量、吞噬细胞的吞噬活性、溶菌酶活力、酸性磷酸酶活力以及超氧化物歧化酶活力等非特异性指标进行测定。结果表明：免疫组血细胞数量显著增加,红细胞和白细胞数量均于第7天达峰值,分别为(4.49±0.23)x10⁶个/ mm³和3.88±0.24)x10³个/ mm³；免疫组吞噬指数和吞噬百分比均在第7天达到最高值,分别为2.65和29.85％。血清中溶菌酶活力和酸性磷酸酶活力均于免疫后第7 天达到峰值, 极显著高于对照组(P<0.01),而超氧化物歧化酶活力于免疫后第14天达到峰值, 极显著高于对照组(P<0.01)。攻毒感染试验表明受免鲈鱼的相对免疫保护率为61.54％。由此可见,鰤鱼诺卡氏菌灭活疫苗能够显著诱导大口黑鲈发生非特异性免疫应答反应,提高其免疫因子的活性,从而增强鱼体的免疫保护力。