半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)Sox基因家族生物信息学分析

Sox(SRY-related HMG-box)基因家族是在动物体内发现的一类编码转录因子的基因家族,广泛参与了动物生长发育、理化反应,特别是性别决定和分化等过程。本研究采用生物信息学方法,利用Sox基因高度保守的HMG-box区序列作为种子序列,检索半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)基因组注释的蛋白数据库,共鉴定分离出23个Sox基因。并在全基因组水平对半滑舌鳎Sox基因家族进行了保守结构域序列、进化、基因结构、染色体定位及基因表达模式的系统分析。结果显示,通过保守结构域分析发现了半滑舌鳎Sox基因家族除Cse Sox32外,皆存在一段9个氨基酸残基(RPMNAFMVW)的高度保守基序;结合保守结构域及进化分析,所有半滑舌鳎Sox基因被分为B1、B2、C、D、E、F和K共7个亚族,且不同的亚族在进化上存在种间趋同性和种内特异性;基因结构分析将半滑舌鳎Sox基因分为两大类,即单外显子类和多外显子类;而染色体定位分析则显示,Sox基因在染色体上散乱分布,不存在集簇现象;不同类型性腺及幼鱼变态前后的Sox基因家族表达谱显示,半滑舌鳎Sox基因具有不同的组织表达模式,表明其在性别分化、性腺发育及早期幼鱼发育过程中可能发挥了重要作用。本研究对于今后半滑舌鳎Sox基因家族深入的功能验证及分子作用机制研究具有重要的意义,也为日益丰富的水产基因组资源的挖掘利用提供了参考。     

半滑舌鳎Shh基因的克隆与表达及甲基化分析

通过RACE方法获得半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)Hh基因家族的Shh基因,该基因全长1 922 bp,其中5′UTR 266 bp,3′UTR 360 bp,ORF1 296 bp,编码431个氨基酸,经预测该多肽的相对分子质量为47.28 k D,理论等电点6.95,具有Hh基因家族特有的保守结构域。氨基酸序列分析表明,半滑舌鳎Shh与牙鲆的同源性最高,为82%,与其他鱼类同源性为74%~81%,与非洲爪蟾的同源性为61%,与人和鼠的同源性为63%~64%。甲基化结果显示,Shh基因在1龄卵巢中的甲基化程度普遍低于雄鱼与伪雄鱼精巢。基因表达分析显示,Shh基因在胚胎期的囊胚期表达显著高于其它时期(P0.05),在雌雄成鱼8个组织器官均表达,在雌性性腺分化的关键期孵化后50 d,雌性性腺中表达量较前期升高,且显著高于同时期雄性性腺中的表达(P0.05),在雄性性腺分化的关键期80~95 d,Shh基因在雄性中的表达水平显著升高(P0.05),在8月龄、1龄及2龄雌鱼性腺中表达显著高于雄鱼与伪雄鱼。本研究表明,半滑舌鳎Shh基因在进化中高度保守,与胚胎分化、组织器官形成、雌雄性腺分化及性腺发育密切相关。     

半滑舌鳎抗缪勒氏管激素(AMH)基因的克隆及组织表达分析

本研究克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)AMH基因并对其进行表达分析。该基因cDNA序列开放阅读框长为1 563 bp,编码蛋白含520个氨基酸。该蛋白含有TGF-β超家族的特征序列,包含1个AMH-N区域和TGF-β结构域,并在C端生物活性区含有9个保守的半胱氨酸残基。系统进化分析表明,半滑舌鳎AMH和所有鱼类AMH聚为一簇,与鲽形目相似性最高。实时定量结果表明,AMH基因在半滑舌鳎不同组织中有差异表达,在正常雄鱼和伪雄鱼性腺中表达量最高。胚后不同时期性腺的实时定量结果表明,性腺分化之前AMH在精巢中相对表达量较低,70 dph(days post hatching)达到最高峰,而在卵巢中呈现先升高后下降的趋势,预示AMH基因可能在半滑舌鳎性腺发育中起重要作用。较正常雄鱼后代而言,AMH基因在伪雄鱼后代的雄鱼和伪雄鱼性腺中的表达都有升高的趋势,而在雌鱼中无明显差异,也预示其可能参与半滑舌鳎的性反转过程。     

克氏原螯虾PcCRCN-L基因的克隆鉴定及在低氧胁迫下的表达响应

虾青蛋白(Crustacyanin,CRCN)在甲壳动物脂类代谢及低氧胁迫应激调控等方面具有重要的功能。为获取虾青蛋白在克氏原螯虾(Procambarus clarkii)性腺发育和低氧胁迫应答中的作用，本研究在克氏原螯虾肝胰腺组织中鉴定出1个类虾青蛋白PcCRCN-L基因的c DNA序列，分析了PcCRCN-L基因的结构特征和进化模式，研究了PcCRCN-L基因在不同组织与性腺不同发育时期的表达特征，探讨了Pc CRCN-L在低氧–复氧胁迫下的表达响应模式。结果显示，PcCRCN-L基因c DNA序列长2 700 bp，其开放阅读框(ORF)长度为1 587 bp，编码528个氨基酸残基；DNA序列长6 130 bp，位于克氏原螯虾基因组的第12号染色体，包含5个外显子和4个内含子，内含子/外显子剪接方式符合GT-AG规则。Pc CRCN-L具有1个完整的lipocalin结构域，包含典型的序列保守区Ⅰ(SCR1)序列G-X-W、保守区Ⅱ(SCR2)序列T-D-Y和保守区Ⅲ(SCR3)序列精氨酸R。多序列比对与系统进化分析结果显示，PcCRCN-L独立于传统虾青蛋白A和C亚族，单独聚...     

半滑舌鳎含sox9基因BAC克隆的筛选及BAC-FISH定位

以本实验室构建的半滑舌鳎BAC文库为基础,通过对其进行有序混合,构建了两步PCR筛选体系;对性别决定相关的sox9基因的序列设计特异性引物,筛选获得阳性单一BAC克隆。利用BAC-FISH技术将包含sox9基因的BAC克隆定位在半滑舌鳎染色体上。结果显示,sox9基因在雌、雄半滑舌鳎的一对常染色体的长臂上分别存在两个杂交信号位点,信号稳定且特异。研究证实了该文库筛选体系的有效性;首次实现了对性别相关的sox9基因在半滑舌鳎染色体上的定位,其结果为揭示sox9基因参与鱼类性别控制的机制提供了重要基础。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) c-Jun基因的克隆及免疫应答分析

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)AP-1家族转录因子c-Jun基因(Jun proto-oncogene)及其在免疫应答中的作用尚无报道.本研究根据半滑舌鳎转录组数据库中预测的c-Jun序列,通过RACE技术和PCR扩增方法获得了半滑舌鳎c-Jun基因cDNA全长2093 bp,CDS区域共981 bp,编码326个氨基酸,5'UTR区域377 bp,3'UTR区域735 bp.SMART分析显示,C-JUN蛋白具有2个结构域:AP-1家族典型结构域Jun,以及高度保守的亮氨酸拉链结构域(BRLZ).经蛋白多序列同源比对、系统进化树分析,发现半滑舌鳎c-Jun与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)c-Jun亲缘关系最近.实时荧光定量PCR分析显示,c-Jun基因在半滑舌鳎不同组织中普遍表达,在卵巢中表达量最高.鳗弧菌(Vibrio anguillarum)人工感染半滑舌鳎后,c-Jun基因在肝脏、脾脏、头肾、小肠、鳃、血液中表达量都出现不同程度上调,其中,鳃中变化最明显:感染12h后表达量达到0h时的13.20倍.使用LPS、PGN、PolyI:C和WGP病原模拟物刺激半滑舌鳎外周血淋巴细胞,结果显示,WGP诱导c-Jun基因上调表达,而LPS与PolyI:C均下调基因表达.以上实验结果表明,c-Jun基因在半滑舌鳎的免疫防御中发挥重要作用.     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)雌性特异基因CSW3重组蛋白的表达与应用

CSW3基因序列来源于半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)全基因组测序项目,是经过筛选得到的雌性特异候选基因之一。本研究探索了半滑舌鳎雌性相关基因CSW3的表达与应用,构建了半滑舌鳎雌性特异CSW3基因重组表达载体,通过大肠杆菌进行了体外重组表达,对基因表达产物进行分离纯化,并通过蛋白转染的方法研究了纯化的蛋白对几个性别相关基因的影响。结果显示,雌性特异CSW3重组蛋白注射鱼体后对半滑舌鳎性腺foxl2、sox9a、amh这3种性别相关基因的表达水平具有显著影响,能够引起雌性相关基因foxl2表达上调、雄性相关基因sox9a和amh表达下降。从蛋白水平对雌性相关基因CSW3的基因功能进行初步研究,为半滑舌鳎性别控制及全雌苗育种提供基因资源及技术方法。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)雌性特异基因CSW3重组蛋白的表达与应用

CSW3基因序列来源于半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)全基因组测序项目,是经过筛选得到的雌性特异候选基因之一。本研究探索了半滑舌鳎雌性相关基因CSW3的表达与应用,构建了半滑舌鳎雌性特异CSW3基因重组表达载体,通过大肠杆菌进行了体外重组表达,对基因表达产物进行分离纯化,并通过蛋白转染的方法研究了纯化的蛋白对几个性别相关基因的影响。结果显示,雌性特异CSW3重组蛋白注射鱼体后对半滑舌鳎性腺foxl2、sox9a、amh这3种性别相关基因的表达水平具有显著影响,能够引起雌性相关基因foxl2表达上调、雄性相关基因sox9a和amh表达下降。从蛋白水平对雌性相关基因CSW3的基因功能进行初步研究,为半滑舌鳎性别控制及全雌苗育种提供基因资源及技术方法。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)c-Jun基因的克隆及免疫应答分析

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)AP-1家族转录因子c-Jun基因(Jun proto-oncogene)及其在免疫应答中的作用尚无报道。本研究根据半滑舌鳎转录组数据库中预测的c-Jun序列,通过RACE技术和PCR扩增方法获得了半滑舌鳎c-Jun基因c DNA全长2093 bp,CDS区域共981 bp,编码326个氨基酸,5'UTR区域377 bp,3'UTR区域735 bp。SMART分析显示,C-JUN蛋白具有2个结构域:AP-1家族典型结构域Jun,以及高度保守的亮氨酸拉链结构域(BRLZ)。经蛋白多序列同源比对、系统进化树分析,发现半滑舌鳎c-Jun与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)c-Jun亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析显示,c-Jun基因在半滑舌鳎不同组织中普遍表达,在卵巢中表达量最高。鳗弧菌(Vibrio anguillarum)人工感染半滑舌鳎后,c-Jun基因在肝脏、脾脏、头肾、小肠、鳃、血液中表达量都出现不同程度上调,其中,鳃中变化最明显:感染12 h后表达量达到0 h时的13.20倍。使用LPS、PGN、Poly I:C和WGP病原模拟物刺激半滑舌鳎外周血淋巴细胞,结果显示,WGP诱导c-Jun基因上调表达,而LPS与Poly I:C均下调基因表达。以上实验结果表明,c-Jun基因在半滑舌鳎的免疫防御中发挥重要作用。     

斑节对虾Sox基因HMG盒的PCR扩增及SSCP分析

SRY基因是人类及哺乳动物睾丸决定因子的最佳候选基因，HMG盒是SRY基因编码蛋白质的唯一功能区，在性别决定中极其重要且高度保守，许多进化程度上明显不同的物种中都能检测出SRY基因的HMG盒，即Sox基因。斑节对虾是一种重要经济虾类，其性别决定机制研究薄弱，至今未找到性染色体。本研究根据人的SRY基因的HMG盒保守区的核苷酸序列，设计了1对兼并引物，通过PCR扩增出斑节对虾的Sox基因，并对扩增产物进行SSCP分析。结果表明，斑节对虾雌雄个体均存在Sox基因，从雌雄个体中均扩增出约350bp和220bp两条基因片段，推测其中350bp片段含内含子，SSCP结果显示斑节对虾内存在Sox基因家族的不同成员，且雌雄存在差异最后我们讨论了对虾性别决定可能的机制。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)黑色素聚集素受体(MCHR)表达特性及其与无眼侧黑化的关系

利用cDNA末端快速克隆技术(RACE)获得了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)2种黑色素聚集素受体(MCHR1和MCHR2)的cDNA全长序列,并采用定量PCR技术分析了MCHR mRNA的组织表达特性,研究了其与无眼侧黑化程度的关系.结果显示,半滑舌鳎MCHR1 cDNA序列全长为1685 bp,开放阅读框(ORF)长为1080 bp,编码359个氨基酸,与牙鲆(Paralichthys olivaceus)同源性高达83.3％.系统进化分析显示,半滑舌鳎MCHR1与鲋形目、鲽形目和鲈形目鱼类聚为1个小分支.MCHR2 cDNA序列全长为1626bp,ORF长为1044bp,编码347个氨基酸,与鲽形目同源性最高达到90％以上.系统进化分析显示,半滑舌鳎MCHR2与鲽形目、鲈形目鱼类聚为1个小分支.MCHR1 mRNA在鳃中表达量最高,而MCHR2 mRNA在有眼侧皮肤中表达量最高,性腺次之.另外,MCHR1和MCHR2 mRNA在其他组织中均检测到表达,这表明半滑舌鳎黑色素聚集素(MCH)可能通过内分泌方式和各组织中的MCHR介导参与生理调控.不同黑化面积表达分析显示,在无眼侧黑化发生早期,脑垂体中MCHR1 mRNA显著升高,在无眼侧50％黑化组达到峰值,皮肤中MCHR1 mRNA在无眼侧10％黑化组显著升高,其后保持较高水平;脑垂体和皮肤中MCHR2mRNA表达表现出一致的变化趋势,在无眼侧黑化发生早期都达到峰值,其后逐渐下降至相对较低水平.表明MCHR可能直接或通过其他信号通路参与了半滑舌鳎无眼侧黑化性状的调控过程.     

缢蛏ABC转运蛋白基因家族成员全基因组鉴定及表达模式分析

腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(ATP binding cassette transporter,ABC transporter)家族是最古老的膜蛋白家族之一，广泛存在于原核生物和真核生物体内，利用ATP水解释放的能量对氨基酸、脂质、抗生素等物质进行跨膜运输，参与生物体内多种生理活动。目前，对软体动物ABC转运蛋白家族的鉴定，仅在虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)、栉孔扇贝(Chlamys farreri)和长牡蛎(Crassostrea gigas) 3种双壳类中有系统研究，对缢蛏(Sinonovacula constricta) ABC转运蛋白家族的鉴定和表达模式分析尚未见报道。利用缢蛏基因组和转录组数据，运用本地及NCBI在线BLAST程序、FGENESH+、SMART、Ex PASy、MEGA X、Mev 4.90和MapInspect等生物信息学分析工具，在全基因组水平系统地鉴定出52个缢蛏ABC转运蛋白，并对转运蛋白基因外显子数目、染色体定位等信息进行分析；通过系统进化分析，将缢蛏ABC转运蛋白家族分为8个亚家族，即ABCA～ABCH；通过比较分析不同物种...     

奥利亚罗非鱼DMT基因克隆与序列分析

利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)分离、克隆奥利亚罗非鱼(Oreochromis aurea)睾丸DMT(DM-do-main gene in testis)基因,并进行序列测定与分析。结果表明,该基因cDNA序列全长1 260 bp,包括74 bp 5’非翻译区,879 bp阅读框以及含poly(A)信号AATAAA的307 bp 3’非翻译区,阅读框共编码292个氨基酸。序列同源性分析表明,不同进化地位动物的DMRT1基因DM域编码序列存在高度同源性,显示DMRT1基因在系统进化上高度保守。生物信息学分析表明:DMT基因编码蛋白无信号肽,无跨膜区域,有多个蛋白激酶C、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和N-糖基化位点,推测其可能在细胞信号传导中发挥作用,且其生物活性可能接受信号途中多种信号的调控。该基因的成功克隆及生物信息学分析不仅为DMRT1基因的分子进化和相似性比较研究提供了新的材料,而且对进一步研究其编码蛋白的结构与功能以及其在鱼类性别调控中的作用具有重要意义。[中国水产科学,2007,14(1):23-31]     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) Nramp基因克隆与表达分析及SNP筛选

天然抗性相关巨噬细胞蛋白(Natural resistance-associated macrophage protein, Nramp)属于膜整合转运蛋白,具有抑制胞内寄生菌侵染、调节巨噬细胞的抗菌活性等作用。本研究对半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)Nramp基因进行了克隆和表达分析,并对其与抗鳗弧菌感染相关的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)位点进行了筛选。该基因cDNA序列全长3717 bp,其中开放阅读框(Open reading frame, ORF)1677 bp,所编码蛋白含有558个氨基酸,该蛋白具有Nramp家族的典型特征,包括10个跨膜区(Transmembrane, TM)、1个由20个氨基酸残基组成的胞质内转运蛋白特征结构域(Consensus Transport Motif, CTM)。半滑舌鳎Nramp的ORF末端有1个类似于脊椎动物Nramp2中的铁反应控制蛋白结合位点(Iron-responsive regulatory protein-binding site, IRE)。半滑舌鳎Nramp与其他14个物种的Nramp氨基酸序列同源性在63%?91%之间,系统进化分析表明,半滑舌鳎Nramp和所有鱼类Nramp聚集为一簇,与其他物种Nramp2的亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析显示,Nramp基因在半滑舌鳎脾脏和肾脏中的表达量最高,而在肌肉和性腺中的表达量最低;在哈维氏弧菌感染的半滑舌鳎肾脏、脾脏和肝脏中表达量呈升高趋势,而在鳃中则表现为下调趋势。利用直接测序法检测感染鳗弧菌后同一家系的233个个体(抗病个体165个,感病个体68个),共检测到15个SNP位点,对其中3个SNP 位点即 SNP-g.3113(T→C)、SNP-g.3125(A→G)和 SNP-g.3164(A→T)进行测序分型后发现,SNP- g.3125(A→G)的等位基因(G)频率和基因型(GG)频率与半滑舌鳎抗鳗弧菌疾病呈极显著相关(P<0.01)。研究结果表明,Nramp 基因不同基因型对半滑舌鳎的抗病能力有着极其重要的影响,SNP-g.3125(A→G)可作为潜在的抗性遗传标记位点。本研究将为半滑舌鳎抗性品系培育提供技术支持。     

中国大鲵Sox19 基因全长cDNA 序列的克隆及组织表达分析

采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了中国大鲵(Andrias davidianus)Sox19基因全长cDNA序列,并进行各组织间的表达分析。中国大鲵Sox19基因全长1290 bp,ORF长858 bp,编码285个氨基酸,位于39~109位的HMG-box是其主要功能区。氨基酸序列分析表明,其与舌齿鲈(Dicentrarchus labrax)、斑马鱼(Danio rerio)及红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)的相似度分别为64%、58%、55%。采用邻接法对不同物种的Sox19编码区序列构建分子系统树发现:中国大鲵Sox19基因属于较早从鱼类分化出来的基因,表明Sox19基因从中国大鲵到鱼类的进化速度比较快。荧光定量PCR结果显示,Sox19在所有检测的组织中均有表达,且在心脏中的表达量最高,卵巢中次之,肾脏中的表达量略高于肠道。中国大鲵Sox19基因的发现打破了Sox19基因一直被认为是鱼类所特有基因的观点,填补了两栖类有关此基因的空白,为更进一步的了解Sox19基因在中国大鲵中的重要功能奠定了基础,同时Sox19基因还可作为研究中国大鲵早期胚胎神经系统发育情况的分子标记,为其他两栖类动物的研究提供借鉴。     

赤点石斑鱼Toll样受体 (TLRs)基因家族的鉴定、进化与表达

为研究赤点石斑鱼Toll样受体（Toll-like receptors, TLRs）的进化、分布及表达模式，本研究基于已公开的赤点石斑鱼基因组和转录组数据，利用blast、系统进化与共线性等生物信息学方法，分析赤点石斑鱼TLRs基因家族的系统进化、染色体分布及在各组织中的表达模式。结果显示，在赤点石斑鱼中共鉴定出17个TLR基因，这些基因分为5个亚家族（TLR1、TLR3、TLR5、TLR7和TLR11），分别分布在24条染色体中的11条染色体上；17个TLR基因在赤点石斑鱼不同组织中具有不同的表达模式，然而，位于相同染色体上的TLR基因的不同拷贝则存在相似的表达模式。其中EaTLR18-1与EaTLR18-2均位于9号染色体上，二者的表达模式高度相似，均在心脏中高表达；同位于20号染色体上的EaTLR2-1a与EaTLR2-1b的表达模式也高度相似，均在脑中高表达；EaTLR5M与EaTLR5S同位于14号染色体上，二者不仅具有高度相似的LRR结构域，且在不同组织中的表达水平也高度相似；而位于18号染色体的EaTLR7与EaTLR8和位于4号染色体的EaTLR2-2与EaTLR3，其表达模式却存在明显差异。研究结果可为鱼类Toll样受体系统进化分析提供参考数据，也为进一步研究赤点石斑鱼Toll样受体基因的功能奠定基础。